МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО
КОНОВАРТ ОКСАНА ВІКТОРІВНА
УДК 612.112.94.015.11.014.23.014.333
МЕХАНІЗМИ ДІЇ БЛОКАТОРІВ Н2-ГІСТАМІНОВИХ І
М1-ХОЛІНЕРГІЧНИХ РЕЦЕПТОРІВ У ЛІМФОЦИТАХ
ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ
14.03.03 – нормальна фізіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Львів – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України
Науковий керівник
доктор біологічних наук, професор, Воробець Зіновій Дмитрович, Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, завідувач кафедри медичної біології та генетики
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Скляров Олександр Якович,
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, завідувач кафедри біологічної хімії
доктор біологічних наук, професор Берегова Тетяна Володимирівна, Науково-дослідний інститут фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка МОН України, завідувач відділу фармако-фізіології
Захист відбудеться „16” травня 2008 р. об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.600.03 Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького МОЗ України за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 52.
З дисертацією можна ознайомитись у Науковій бібліотеці Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (79010, м. Львів, вул. Січових Стрільців, 6).
Автореферат розісланий „ 7 ” квітня 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Томашова С.А.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Розвиток багатьох захворювань супроводжується оксидативним стресом внаслідок інтенсивного утворення у клітинах активних форм кисню (АФК) (Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997; Владимиров Ю.А., 1989). Завдяки високій реакційній здатності, АФК можуть призводити до ураження клітин, викликаючи окиснення біомолекул та ініціювання ланцюгових процесів пероксидного окиснення у мембранних ліпідах. Зміна ліпідного оточення мембран та посилення процесів пероксидації призводять до структурних порушень у клітинах і модуляції активності мембранозв’язаних ферментів, таких як АТФаза, аденілатциклаза тощо (Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997; Krinsky N.I., 1991). Недостатнє функціонування систем антиоксидантного захисту спричиняє порушення активності Са2+-транспортувальних систем і, відповідно, призводить до зміни концентрації іонізованого кальцію у клітині, який є внутрішньоклітинним месенджером і прямо чи опосередковано регулює більшість клітинних функцій. Каталітична активність ферментів антиоксидантної системи (АОС), яка регулює процеси вільнорадикального окиснення у клітинах, забезпечує підтримання стабільності їх плазматичних мембран і внутрішньоклітинних структур в умовах оксидативного стресу (Krinsky N.I., 1991; Ursini F., Bindoli A., 1987). Важлива роль у цих процесах належить ферментам глутатіонової антиоксидантної системи.
Відомо, що гострі та хронічні панкреатити, підвищена шлункова секреція супроводжуються оксидативним стресом (Білоусов Ю.Б., Асецкая И.Л., 1993; Дегтярьова І.І. та ін., 2000; Полотнюк С.Я., Штанова Л.Я., Берегова Т.В., 2006). Для їх лікування широко використовуються блокатори Н2-гістамінових і М1-холінергічних рецепторів (Дегтярьова І.І. та ін., 2000; Gespach C., 1990; Kulkarni P. N., 1997; Leurs R. et all., 1991; Singer M. V. et all., 1991; Sklyarov A. Y. et all., 2001; 2002). Для зниження гіперпродукції хлоридної кислоти парієтальними клітинами слизової оболонки шлунку (СОШ) застосовують блокатори протонної помпи (Burdan F. et all., 2000). Відомо, що блокатор М1-холінергічних рецепторів пірензепін, на відміну від неселективних середників, вибірково пригнічує секрецію кислоти та пепсину у СОШ, зменшує функціональну активність ацинарних клітин підшлункової залози, покращує мікроциркуляцію та кровопостачання. Селективний блокатор Н2-гістамінових рецепторів – фамотидин – не тільки гальмує секрецію шлункових залоз, але й інгібує генерацію АФК, активність аденілатциклази, синтез панкреатичних ферментів.
Хоча Н2 - і М1-рецептори експресуються переважно у парієтальних клітинах СОШ та ацинарних клітинах підшлункової залози, вони також наявні і у лімфоцитах (Ganther F. et all., 2002; Jutel M. et all., 2001; Nomura J. et all., 2003).
Адаптація організму до стресових чинників та підтримання гомеостазу здійснюється за участю нервової, ендокринної та імунної систем (Давтян Т.К., Аванесян Л.А., 2001). Виявлена функціональна та фенотипова подібність між нервовою та імунною системами. Лімфоїдні та нервові клітини здатні синтезувати одні і ті ж біологічно активні речовини, експресувати одні і ті ж рецептори, зокрема М1 і Н2. Це обумовлює те, що лімфоцити, як й нервові клітини, можуть активно і оперативно брати участь в індукції та регуляції стрес-реакції організму шляхом синтезу і секреції різноманітних факторів (Давтян Т.К., Аванесян Л.А., 2001). Виходячи з цього, можна припустити, що лімфоцити крові можуть бути зручною, адекватною та актуальною моделлю для вивчення багатьох процесів, зокрема механізмів дії Н2 - і М1 - антагоністів. Стимуляція В - і Т-лімфоцитів супроводжується каскадом біохімічних реакцій і різноманітних шляхів мобілізації Са2+ (Choquet D. et all., 1994). Са2+ задіяний у всіх регуляторних системах та у формуванні клітинної відповіді на зовнішні впливи (Костюк П.Г., Чазов Е.И., 1988; Choquet D. et all., 1994; Gallo E. M. et all., 2006). Низькі концентрації іонізованого кальцію у клітині (10-6-10-7 М) підтримуються завдяки скоординованій роботі Са2+-транспортувальних та інших іон-транспортувальних систем, зокрема Са2+, Мg2+-АТФази та Nа+, К+-АТФази. Отже, для розкриття механізму дії блокаторів Н2 - та М1 - рецепторів і протонної помпи при ряді захворювань травної системи доцільно вивчати на модельних системах, зокрема лімфоцитах периферичної крові, їх ефект на іон-транспортувальні системи і на системи антиоксидантного захисту.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького у рамках теми „Вивчення регуляторної ролі кальцію у функціонуванні глутатіонової антиоксидантної системи клітин” (№ реєстрації ІН.07.00.0001.04). Тема дисертації затверджена на засіданні Вченої Ради медичного факультету № 2 Львiвського національного медичного унiверсистету iмені Данила Галицького, протокол № 3 від 21 грудня 2005 р., на засіданні проблемної комісії з медико-біологічних дисциплін Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького, протокол № 1 від 7 грудня 2005 р. та на засіданні Проблемної комісії "Фізіологія людини" АМН та МОЗ України, протокол № 1 від 15 лютого 2007 р.
Мета роботи: з’ясувати роль глутатіонової антиоксидантної системи і транспортувальних АТФаз у реалізації ефектів блокаторів Н2-гістамінових та М1-холінергічних рецепторів, а також блокатора протонної помпи у лімфоцитах периферичної крові.
Завдання дослідження:
1. Встановити оптимальні умови для функціонування глутатіонпероксидазної, глутатіонтрансферазної, глутатіонредуктазної, Na+,K+-АТФазної та Са2+,Mg2+-АТФазної активностей лімфоцитів периферичної крові, використовуючи як пермеабілізуючий агент сапонін.
2. Вивчити вплив блокатора Н2-гістамінових рецепторів фамотидину на активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи та активність транспортувальних АТФаз у лімфоцитах периферичної крові.
3. Вивчити вплив блокатора М1-ацетилхолінових рецепторів пірензепіну на активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи та активність транспортувальних АТФаз у лімфоцитах периферичної крові.
4. Дослідити вплив омепразолу як блокатора протонної помпи на активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи та активність транспортувальних АТФаз у лімфоцитах периферичної крові.
Об’єкт дослідження: механізми дії ферментів глутатіонової антиоксидантної системи і транспортувальних АТФаз в опосередкуванні ефектів блокаторів Н2-гістамінових та М1-холінергічних рецепторів, а також блокатора протонної помпи у лімфоцитах периферичної крові.
Предмет дослідження: ферменти глутатіонової антиоксидантної системи – глутатіонпероксидаза, глутатіонредуктаза та глутатіонтрансфераза, Na+,K+-АТФаза та Ca2+,Mg2+-АТФаза у лімфоцитах крові при дії фамотидину, пірензепіну та омепразолу.
Методи дослідження: виділення моноядерних лімфоцитів з периферичної крові практично здорових донорів у градієнті густини фікол-урографіну, біохімічні методи (пермеабілізація клітин сапоніном, визначення концентрації білка за Лоурі, визначення активностей глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази, глутатіонтрансферази, Са2+, Мg2+ - та Nа+, К+-АТФаз, оцінка стану пероксидації ліпідів, визначення вмісту неорганічного фосфату), статистично-математичне опрацювання результатів за допомогою t-критерію Стьюдента.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше комплексно вивчено функціонування окремих ланок глутатіонової антиоксидантної системи, транспортувальних АТФаз та їх чутливість до іонів кальцію у моноядерних лімфоцитах периферичної крові. Встановлені оптимальні концентрації сапоніну, які розкривають латентні активності глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази, глутатіонтрансферази, Са2+, Мg2+ - та Nа+, К+-АТФаз у лімфоцитах периферичної крові, що дає змогу виявити функціональні зв’язки між цими ферментами. Підібрані оптимальні умови для вивчення активностей цих ферментів у пермеабілізованих лімфоцитах.
З’ясовано, що блокатор Н2-гістамінових рецепторів фамотидин дозозалежно впливає на активність глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази – при низьких концентраціях активує ці ферменти, а при високих (>10-3 М) інгібує. Водночас цей препарат у концентраціях >10-4 М практично повністю інгібує Са2+, Мg2+ - та Nа+, К+-АТФазні активності лімфоцитів периферичної крові.
Блокатор М1-ацетилхолінових рецепторів пірензепін інгібує пероксидацію ліпідів та стимулює активність глутатіонпероксидази, а також, цей же блокатор дозозалежно інгібує активність Са2+, Мg2+ - та Nа+, К+-АТФаз.
Блокатор протонної помпи омепразол у концентраціях до 10-4 М стимулює активність глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази, а у вищих концентраціях інгібує їх. Омепразол також, подібно до фамотидину та пірензепіну, дозозалежно інгібує активність Са2+, Мg2+ - та Nа+, К+-АТФаз.
Практичне значення одержаних результатів. Зміна активності іон-транспортувальних систем і ферментів антиоксидантної системи при дії різних блокаторів може супроводжуватись модуляцією синтезу лімфоцитами біологічно активних речовин і здатністю клітин до хемотаксису. Оскільки Н2-гістамінові та М1-ацетилхолінові рецептори широко експресуються не тільки у клітинах СОШ чи ацинарних клітинах підшлункової залози, але й у лімфоцитах периферичної крові, ці клітини можуть бути зручною моделлю для вивчення механізмів дії блокаторів вказаних рецепторів, які використовуються для лікування кислотозалежних захворювань і панкреатитів. Отримані дані можуть слугувати основою для розробки методів корекції патологічних змін клітинного гомеостазу. З огляду на це можна ставити питання про створення та підбір нових фармакологічних препаратів, які модулюють активність глутатіонової антиоксидантної системи і транспортувальних АТФаз.
Результати дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес кафедр медичної біології та генетики, нормальної фізіології і біологічної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького.
Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно проаналізувала наукову літературу за темою дослідження, сформулювала та обґрунтувала основні положення дисертаційної роботи і налагодила методи досліджень. Експериментальні дослідження, результати яких викладені у дисертації, здобувач проводила особисто. Постановка завдань, аналіз та обговорення отриманих результатів здійснено спільно з науковим керівником і співавторами статей.
Апробація результатів дисертації. Апробація дисертації проведена на спільному засіданні кафедр нормальної фізіології і медичної біології та генетики Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького 20 вересня 2007 року, протокол № 3. Основні положення дисертаційної роботи викладені у доповідях та обговорені на 63-й науковій конференції студентів і молодих вчених Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (Львів, 2003), Міжнародних наукових конференціях „Нейрогуморальні та клітинні регуляторні механізми процесів травлення” (Львів, 2003, 2007), Міжнародній науковій конференції „Клітинні та субклітинні механізми функціонування травної системи” (Львів, 2004), Установчому з’їзді товариства клітинної біології (Львів, 2004), ІV Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Люблін, 2006); ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006), Міжнародній науковій конференції „Механізми функціонування фізіологічних систем” (Львів, 2006).
Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 13 наукових працях: 7 статей (5 у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 2 – у зарубіжних часописах), 6 робіт у матеріалах конференцій та з’їздів.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 131 сторінках, побудована за традиційною схемою та складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, 4-х розділів, де викладено отримані результати, проведено їх аналіз та узагальнення, а також із висновків і списку використаної літератури. Робота містить 25 рисунків і 4 таблиці. Бібліографічний список налічує 232 джерела.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Моноядерні лімфоцити периферичної крові людини виділяли з гепаринізованої свіжоотриманої крові практично здорових донорів віком 21-28 років у градієнті концентрації фікол-урографіну (480 зразків) (A. Boum, 1968). Підраховували клітини у камері Горяєва, використовуючи як барвник 0,1% трипановий синій. Життєздатність лімфоцитів, яка в усіх дослідах складала не менше 95%, оцінювали за забарвленням трипановим синім.
Для розкриття глутатіонредуктазної, глутатіонтрансферазної та Nа+, К+-АТФазної латентної активностей до суспензії лімфоцитів додавали 0,2% сапонін, а для визначення глутатіонпероксидазної та Са2+, Мg2+-АТФазної активностей - 0,1% сапонін. Дана методика грунтується на роботах, виконаних на еритроцитах, лімфоцитах і сперматозоїдах (Орлов С.Н. и др., 1985; Підковка Н.О., 2003; Maksymjuk H. V., Vorobets Z. D., 2000).
Інтенсивність пероксидної оксидації ліпідів (ПОЛ) оцінювали за вмістом одного із кінцевих метаболітів – малонового діальдегіду (Тимирбулатов С.А., Селезнев Е.И., 1988).
Глутатіонпероксидазну активність визначали за зменшенням вмісту GSH (Моин В.М., 1986), глутатіонредуктазну активність – за зменшенням вмісту NADPH (Mannervik V., 1991), глутатіонтрансферазну активність – за зменшенням вмісту GSH (Власова С. Н и др., 1990; Булавин Д.В., 1996).
Визначення Ca2+,Mg2+-АТФазної активності проводили при 37° С у середовищі, що містило 5 мМ Nа2АТФ, 5 мМ МgС12, 5 мкМ СаС12, 0,02 М трис-НCl буфер (рН=7,4). До інкубаційного середовища додавали лімфоцитарну суміш. Реакцію зупиняли додаванням 1 мл 20% ТХО. Зразки 10 хв центрифугували при 800 g. У супернатанті визначали вміст неорганічного фосфату за методом Фіске-Субароу (Меншиков В.В., 1987). Активність Са2+, Мg2+-АТФази оцінювали за величиною, що інгібувалась 1 мМ розчином ЕГТА, та відображали у мкмолях Фн (хв · мг білка) - 1. Мg2+-АТФазну активність визначали у тих же умовах, але за відсутності СаС12 із додаванням 1 мМ ЕГТА та 0,1 мМ оуабаїну (Орлов С.Н., 1977). За Na+,K+-ATФазну активність приймали таку, що інгібувалась 0,1 мМ розчином оуабаїну.
Препарати фамотидину, пірензепіну, омепразолу використовували в концентраціях 10-6...10-3 М.
Варіаційно-статистичне опрацювання отриманих результатів проводили з використанням критерію Стьюдента за допомогою комп’ютерної програми Microsoft Excel 2003.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Функціональні властивості глутатіонзалежних ферментів і транспортувальних АТФаз лімфоцитів крові при пермеабілізації клітин сапоніном. Відомо, що очищені ферменти глутатіонової антиоксидантної системи не є Ca2+-залежними (Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997; Doroshow J. H., 1995; Mannervik B., 1991). Однак, невідомо, як вони функціонують in vivo. Значна кількість даних вказує на те, що на активність цих ферментів, якщо не прямо, то опосередковано, впливає іонізований кальцій (Підковка Н.О., Воробець З.Д., 2002).
Враховуючи те, що ряд ферментів, які ми вивчали, локалізовані з внутрішнього боку плазматичної мембрани (АТФази, глутатіонпероксидаза - ГП, глутатіонтрансфераза - ГТ), інші - у цитозольній фракції (глутатіонредуктаза - ГР), для розкриття їх латентної активності доцільною є пермеабілізація клітинних мембран.
Згідно завдань досліджень, був проведений підбір оптимальних умов для визначення ГР-, ГП - та ГТ-ої активностей лімфоцитів периферичної крові, з використанням як пермеабілізуючого агента сапоніну. Для цього в інкубаційне середовище для визначення ферментативної активності додавали сапонін у діапазоні концентрацій 0,02...0,3%. ГП-а активність практично не змінювалась при низьких концентраціях сапоніну (до 0,04%), вона становила 9,2±0,9 нмоль GSН (хв · мг білка) - 1. Цей показник значно зростав, до 75,0±6,8 нмоль GSН (хв · мг білка) - 1 (р < 0,05), при вмісті сапоніну 0,1%. За наявності в інкубаційному середовищі вищих концентрацій (0,2%) цієї сполуки ГП-а активність різко знижувалась.
Встановлено, що ГР-а активність лінійно зростає від 4,2±0,3 нмоль NADРН (хв · мг білка) - 1, за відсутності сапоніну, до 30,0±3,1 нмоль NADРН (хв · мг білка) - 1, із підвищенням концентрації сапоніну до 0,2%.
У діапазоні концентрацій сапоніну 0...0,04% спостерігались дуже низькі значення ГТ-ої активності. При 0,04% вмісті сапоніну в інкубаційному середовищі ферментативна активність становила 3,2±0,3 нмоль GSН (хв · мг білка) - 1. За більших концентрацій (0,1-0,2%) сапоніну було виявлено лінійне зростання ГТ-ої активності до 68,1±6,7 нмоль GSН (хв · мг білка) - 1 (р < 0,05).
Таким чином, отримані результати довели необхідність підбору оптимальних концентрацій сапоніну для визначення активності глутатіонових антипероксидних ферментів нативних лімфоцитів периферичної крові.
При визначенні Са2+, Мg2+-АТФазної активності у діапазоні концентрацій сапоніну 0,02...0,1% спостерігалось зростання показника до 7,9±1,3 мкмоль Фн (хв · мг білка) - 1. Більші концентрації сапоніну пригнічували активність даного ферменту.
Виявлено, що Na+, К+-АТФазна активність зростає лінійно відповідно до підвищення концентрації сапоніну в інкубаційному середовищі. Максимальна активність даного ферменту становила 10,6±0,6 мкмоль Фн (хв · мг білка) - 1, за 0,2% концентрації сапоніну.
Отже, низькі концентрації сапоніну (0,02...0,04%) є недостатніми для розкриття латентної активності досліджуваних ферментів. Оскільки це є здебільшого мембранозв’язані або цитозольні ферменти, а ГР - виключно цитозольний, для їх активації необхідна більша концентрація сапоніну - 0,1% для ГП, Са2+, Мg2+-АТФази та 0,2% для ГР, ГТ, Na+, К+-АТФази.
Оскільки функціонування будь-яких ферментів залежить від багатьох факторів, завданням наступного етапу роботи був добір оптимальних значень таких показників, як рН, концентрація білка, АТФ, співвідношення катіонів Na+ і К+, час інкубації для визначення Са2+, Мg2+-АТФазної та Na+, К+-АТФазної активностей лімфоцитів крові.
Було показано, що оптимум рН для Са2+, Мg2+-АТФази становить 7,0. За цих умов спостерігалась максимальна активність ферменту - 16±1,4 мколь Фн (хв · мг білка) - 1. Na+, К+-АТФазна активність сягала максимального значення при рН 6,8 і становила 10±0,7 мкмоль Фн (хв · мг білка) - 1. Зниження рН інкубаційного середовища від 7,4 до 6,0 призводило до істотного посилення інгібувального впливу Са2+ на АТФ-гідролазну активність ферменту. Зміщення рН у лужний бік, зокрема до 8,0, зменшувало інгібувальний ефект катіонів кальцію на активність Na+, К+-АТФази.
У результаті вивчення процесу гідролізу АТФ Са2+, Мg2+-АТФазою лімфоцитів залежно від часу виявлено, що активність цього ферменту становить 2,0±0,1 мкмоль Фн (хв · мг білка) - 1, за 20 хв інкубації досягає
8-09-2015, 19:42