МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД “ТЕРНОПІЛЬСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені І.Я. ГОРБАЧЕВСЬКОГО”

САЩУК МИКОЛА МИКОЛАЙОВИЧ

УДК 616.8315 – 005.1/ – 053

ВІКОВІ АСПЕКТИ ІМУНОЛОГІЧНОЇ ДИЗРЕГУЛЯЦІЇ ПРИ НЕПОВНІЙ ГЛОБАЛЬНІЙ ІШЕМІЇ МОЗКУ В САМЦІВ-ЩУРІВ

14.03.04 – патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Тернопіль - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Буковинському державному медичному

університеті МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, Ткачук Світлана Сергіївна,

Буковинський державний медичний університет МОЗ України,

завідувач кафедри фізіології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Абрамов Андрій Володимирович, Запорізький державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри патологічної фізіології;

доктор медичних наук, професор Шандра Олексій Антонович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри нормальної фізіології.

Захист відбудеться 27 червня 2008 р. о 14 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 58.601.01 у Державному вищому навчальному закладі “Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського” МОЗ України (46001, м. Тернопіль, Майдан Волі, 1).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державного вищого навчального закладу “Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського” МОЗ України (46001, м. Тернопіль, вул. Січових стрільців, 8).

Автореферат розісланий 16 травня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор Я.Я. Боднар

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Експериментальні дослідження та клінічні спостереження останніх років дозволили перегля­нути традиційні погляди на імунну ізольованість мозку і розширити розуміння механізмів взаємо­відносин центральної нервової та імунної систем (Абрамов А.В., Колесник Ю.М., 2004; Reinke E., Fabry Z., 2006; Харченко Е.П., Клименко М.Н., 2007). Встановлено, що тісні зв’язки імунної та нервової систем здійснюються не лише через цитокіни, нейротрансмітери, нейропептиди та їх рецептори (Blalock J.E., 2005; Czura C.J., Tracey K.J., 2005; Watkins L.R., Maier S.F., 2005), але й шляхом безпосереднього надходження в мозок клітин імунної системи, які забезпечують виникнення в ЦНС імунних реакцій (Engelhardt В., Ransohoff R.M., 2005).

Накопичені знання про характер нейроімунних стосунків знайшли логічне завершення у виникненні нових науково-практичних дисциплін – нейроімунології та нейроімунопатології (Акмаев И.Г., 2000; Лисяный Н.И., 2004), діяльність яких спрямувала вивчення патогенезу багатьох неврологічних захворювань, у тому числі ішемічного пошкодження мозку, у нове русло і дозволила розглядати їх як імунонейропатологічні процеси (Boulanger I., Shatz С., 2001; Shandra A.A. et al., 2002; Turrin N.P., Rivest S., 2004; Koistinaho M., Koistinaho J., 2005). Об’єднаними зусиллями неврологів та нейроімунологів досягнуто значного прогресу у вивченні імунопатологічних механізмів багатьох нервово-психічних захворювань (Ponomarev E.D. et al., 2004; Герасимов М.М., Никитина О.А., 2006; Кутько И.И. и др., 2006; Чехонин В.П.и др., 2006).

Актуальність теми. Порушення церебрального кровообігу та інсульти віднесено до імунозалежних захворювань нервової системи на підставі появи в крові високого рівня нейроантитіл (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Лисяный Н.И., 2004; Рулева Н.Ю. и др., 2004). Активація автоімунних механізмів у подальшому відіграє важливу роль у формуванні хронічного деструктивного процесу в мозку і вогнищевого інфаркту (Константинова Н.И. и др., 2005; Петров С.В. и др., 2005; Sharkey J. et al., 2005).

Нейроімунопатологічний підхід до природи ішемічно-реперфузійного пошкодження мозку та багатьох інших неврологічних захворювань вимагає оцінки не лише неврологічного дефіциту, але й імунного статусу з метою проведення імунокорекції (Hilschmann N. et al., 2000; Евсеев В.А. и др., 2004; Лисяный Н.И., 2004). Серед широкого спектра імунних досліджень при цих захворю­ван­нях пріоритетними є оцінка інтенсивності нейросенсибілізації клітинного й гуморального типів, рівня імунних комплексів, неспецифічної імунної відповіді, про- та протизапальних цито­кінів, а також функціонального стану окремих субпопуляцій лімфоцитів (Евсеев В.А. и др., 2004; Гусев Е.И. и др., 2000; Жданов Г.Н., 2006; Kadhim Н., Sebire G., 2002). Накопичені нейро­іму­нологами наукові факти свідчать, що вибір раціональної тактики лікування повинен передбачати ступінь імунозалежності нервового захворювання і патогенез порушення імунного статусу конкретного хворого (Byrnes A.A. et al., 2002; Streilein J.W., 2003; Hohlfeld R., Wekerle H., 2004).

Незважаючи на констатацію того факту, що ішемічно-реперфузійні пошкодження головного мозку стають причиною суттєвих порушень імунного статусу організму, природа та конкретні прояви їх до сьогоднішнього дня залишаються багато в чому недослідженими. Тимус, як центральний орган імунної системи, у першу чергу реагує на несприятливі впливи змінами морфофункціонального стану (Mann C.L. et al., 2000; Камышный A.M., 2002; Абрамов А.В. и др., 2003; Перцов С.С., 2006) і не може залишитися осторонь імунологічної дизрегуляції, спричиненої ішемією мозку. Незважаючи на це, ми не виявили в літературі ґрунтовних досліджень цієї проблеми та її вікових аспектів, хоча дизрегуляторна концепція нейроімунопатології відкриває нові перспективи імунотерапії, що зумовлює актуальність подібних досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційне дослідження є фрагментом планової міжкафедральної наукової роботи “Дослідження порушень водно-електролітного обміну, закономірностей центральних стресіндукованих та ішемічних дисфункцій, паренхіма­тозно-стромального дисбалансу при ушкодженні внутрішніх органів за умов впливу екологічно несприятливих чинників з розробкою шляхів корекції виявлених патологічних змін” (№ державної реєстрації 01049U009029) Буковинського державного медичного університету. Автором досліджено вікові особливості механізмів імунологічної дизрегуляції, спричиненої неповною глобальною ішемією мозку в самців-щурів різного віку. Тема дисертації затверджена Проблемною комісією "Патологічна фізіологія та імунологія" 26 січня 2005 року (протокол № 41).

Мета дослідження. З’ясувати вікові особливості деяких ланок патогенезу імунологічної дизрегуляції за умов неповної глобальної ішемії мозку.

Задачі дослідження:

1. Вивчити реакцію структури лімфоїдної популяції тимуса одно- та тримісячних щурів на неповну глобальну ішемію мозку.

2. Проаналізувати вікові особливості впливу неповної глобальної ішемії мозку на морфо­метричні та денситометричні параметри лімфоцитів структурно-функціональних зон тимуса.

3. Вивчити вплив неповної глобальної ішемії мозку на інтенсивність флуоресценції катехоламінів у структурно-функціональних зонах тимуса щурів одно- та тримісячного віку.

4. Дослідити індуковані неповною глобальною ішемією мозку показники пероксидного окиснення ліпідів та антиоксидантного захисту в структурно-функціональних зонах тимуса одно- та тримісячних щурів.

5. З’ясувати можливість впливу емоксипіну на спричинені неповною глобальною ішемією мозку порушення морфофункціонального стану тимуса.

Об’єкт дослідження: механізми нейроімунної дизрегуляції за умов неповної глобальної ішемії мозку.

Предмет дослідження: структура лімфоїдної популяції тимуса, морфо- та денситометричні параметри тимоцитів, стан катехоламінергічних систем та прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу в структурно-функціональних зонах тимуса щурів різного віку після неповної глобальної ішемії мозку та ефективність емоксипіну для корекції виявлених порушень.

Методи дослідження:

- морфологічні та морфометричні (вивчення структури лімфоїдної популяції структурно-функціональних зон тимуса, морфометричних і денситометричних характеристик тимоцитів);

- гістохімічний (визначення інтенсивності флуоресценції катехоламінів);

- біохімічні (визначення вмісту дієнових кон’югатів, малонового альдегіду, активності супероксид­дисмутази, каталази, глутатіонпероксидази);

- математичні (статистичний, методи математичного класифікаційного аналізу).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено вікові особливості конститутивної сумарної щільності тимоцитів, структури лімфоїдної популяції тимуса, відсоткового розподілу тимоцитів у межах структурно-функціональних зон тимуса, морфометричних та денситометричних параметрів тимоцитів, інтенсивності флуоресценції катехоламінів, активності антиоксидантних ферментів та показників інтенсивності ліпопероксидації в тимусі одно- та тримісячних тварин. Встановлено, що сумарна щільність незмінених тимоцитів під впливом неповної глобальної ішемії головного мозку зростає в усіх структурно-функціональних зонах вилочкової залози одно- та тримісячних щурів, за винятком мозкової зони одномісячних. Доведено посилювальний вплив ішемії мозку на деструкцію тимоцитів у субкапсулярній та глибокій кірковій зонах тимуса одномісячних щурів і гальмівний - у субкапсулярній, глибокій кірковій зонах та внутрішньочасточкових периваскулярних просторах залози тримісячних тварин. Отримано дані щодо здатності неповної глобальної ішемії мозку перерозподіляти щільність та відсоток різних класів тимоцитів за рахунок зменшення частки менш зрілих форм та зростання частки малих лімфоцитів у всіх структурно-функціональних зонах тимуса тварин обох вікових груп, за винятком медулярної, де, навпаки, щільність та відсоток малих тимоцитів зменшується. Доведено, що модифікувальний вплив неповної глобальної ішемії мозку на морфометричні параметри різних форм тимоцитів найбільш суттєвий у внутрішньочасточкових периваскулярних просторах тимуса тварин обох вікових груп та медулярній зоні тримісячних щурів. Показано вікові відмінності впливу неповної глобальної ішемії мозку на оптичну щільність тимоцитів - її зростання в тимусі одномісячних щурів відбулося в субкапсулярній зоні, а тримісячних – у глибокій кірковій зоні. Виявлено якісні вікові відмінності реагування катехоламінвмісних структур тимуса на неповну глобальну ішемію мозку, які полягають у відсутності постішемічних змін інтенсивності флуоресценції катехоламінів у медулярній зоні одномісячних щурів при зниженні цього показника в тримісячних. Встановлено, що неповна глобальна ішемія мозку в цілому знижує рівень функціонування прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу в різних зонах тимуса одно- та тримісячних тварин за рахунок паралельного зменшення як вмісту продуктів ліпопероксидації, так і активності антиоксидантних ферментів. Показано, що в субкапсулярній, глибокій кірковій зонах, внутрішньочасточ­кових периваскулярних просторах тимуса тварин обох вікових груп емоксипін має переважно антиішемічні ефекти щодо більшості досліджених параметрів морфофункціонального стану тимуса, а в мозковій зоні залози – проішемічні.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної роботи суттєво доповнюють існуючі уявлення про механізми розвитку дизрегуляторної патології, її вікові аспекти, конкретизують участь тимуса в патогенезі порушень адаптаційного імунітету та тих нейроімунних розладів, які є наслідком неповної глобальної ішемії мозку.

Отримані гістохімічні, морфологічні, морфометричні та біохімічні підтвердження впливу емоксипіну на перебіг нейроімунних розладів, супутніх ішемічно-реперфузійним пошкодженням головного мозку, свідчать про доцільність за даної патології не лише нейропротекторної терапії, але й імунокорегувальної, а вікові особливості ефектів препарату – про необхідність урахування віку при виборі імунокорегувальних засобів.

Нові наукові факти, отримані при виконанні дисертаційної роботи, можуть знайти використання при викладанні нормальної і патологічної фізіології, нервових хвороб, імунології, педіатрії, у роботі лабораторій науково-дослідних інститутів із відповідними науковими напрямами, при написанні підручників та монографій із зазначених галузей медицини.

Результати роботи впроваджено в навчальний процес кафедр фізіології та патофізіології Запорізького державного медичного університету, Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського, Буковинського державного медичного університету, м.Чернівці.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно здійснив підбір та аналіз літератури з проблеми дослідження, виконав усі експериментальні втручання на тваринах, провів статистичну обробку отриманих результатів, написав усі розділи дисертаційної роботи та публікації. Основні положення та висновки дисертації сформульовано спільно з науковим керівником.

Біохімічні, гістохімічні та морфологічні дослідження виконано за участі дисертанта.

В опублікованих зі співавторами наукових працях здобувачу належить експериментальний матеріал, статистична обробка, узагальнення результатів, підготовка до друку. У тій частині актів впровадження, що стосуються науково-практичної новизни, викладено фактичний матеріал автора.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації оприлюднено та обговорено на: ІУ Національному Конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004), науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій 200-річчю з дня заснування Харківського державного медичного університету "Від фундаментальних досліджень – до прогресу в медицині" (Харків, 2005), Навчально-методичній нараді завідувачів кафедр і курсів клінічної імунології та алергології і регіональній науково-практичній конференції України (Чернівці, 2006), ХІ Конгресі СФУЛТ (Полтава, 2006), ХLІX підсумковій науково-практичній конференції (Тернопіль, 2006), ХУІІ з’їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (Чернівці, 2006), Всеукраїнській науковій конференції "Актуальні питання вікової анатомії та ембріотопографії" (Чернівці, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць, із них 6 статей у фахових наукових журналах, 6 – у матеріалах конгресів і конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 211 сторінках, ілюстрована 74 таблицями, одним рисунком. Структура дисертації складається зі вступу, шести розділів, виснов­ків і списку використаних джерел, який налічує 324 найменування вітчизняної та зарубіжної літератури. Бібліографічний опис джерел літератури та додатки викладені на 55 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження . Робота виконана на одно- та тримісячних самцях білих лабораторних щурів. Неповну глобальну ішемію мозку моделювали двобічним 20-хвилинним кліпсуванням загальних сонних артерій. Контрольним тваринам проводили розтин шкіри, сепарацію м’язів і виділення судин без порушення в них кровообігу. Усі оперативні втручання здійснювали під каліпсоловим наркозом (75 мг/кг маси тіла). Частині щурів у перші три хвилини по закінченні ішемічного періоду, потім щоденно, протягом 5 днів внутрішньочеревинно уводили емоксипін у дозі 5 мг/кг (Тимофійчук І.Р., 2003).

Усі втручання та забій тварин проводилися з дотриманням основних положень GСP (1996 р.), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину від 04.04.1997 р. та Гельсінської декларації Всесвітньої медичної асоціації про етичні принципи проведення наукових медичних досліджень за участю людини (1964-2000 р.) і Наказу МОЗ України №66 від 13.02.2006 р. Комісією з питань біоетики Буковинського державного медичного університету (протокол №23 від 13.12.2007 р.) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено.

На кріостатних зрізах різних частин тимуса, забарвлених гематоксилін-еозином, за допомогою комп’ютерної системи цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина) вивчали структуру лімфоїдної популяції тимуса, абсолютну кількість клітин (на 1 мм² площі залози) та відносну (%) щільність розподілу кожного класу клітин у межах окремих зон залози, морфометричні та денситометричні характеристики тимоцитів. Ідентифікація клітин в отриманому зображенні проводилася в автоматичному режимі за допомогою пакета прикладних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина). Визначали морфометричні характеристики лімфоїдних клітин (площу, периметр, коефіцієнти форми, елонгації) та денситометричні параметри (абсолютну та питому оптичну щільність). Математичний класифікаційний аналіз проводили з використанням мікроскопа Axioskop (Zeiss, Німеччина) та системи цифрового аналізу зображення VIDAS 2.5 (Kontron Electronik, Німеччина). Виділено 9 класів клітин лімфоїдної популяції вилочкової залози: лімфобласти; лімфобласти з ознаками деструкції; великі лімфоцити; великі лімфоцити з ознаками деструкції; середні лімфоцити; середні лімфоцити з ознаками деструкції; малі лімфоцити; малі лімфоцити з ознаками деструкції; лімфоцити в стані апоптозу.

Інтенсивність флуоресценції катехоламінів у тимусі визначали за методом Фалька-Овмена в модифікації А.Ю.Буданцева (1978). У гомогенатах структурно-функціональних зон тимуса визначали вміст дієнових кон'югатів, малонового альдегіду (Магаляс В.М. та ін., 2001), активність супероксид­дисмутази (Fried R. , 1975; Nashikimi N. et al., 1972), каталази (Королюк М.А. и др., 1988), глутатіонпероксидази (Мещишен И.Ф., 1991).

Результати досліджень оброблено на IBM-сумісному персональному комп’ютері з використанням пакета прикладних і статистичних програм VIDAS 2.5 (Kontron Electronik, Німеччина) та EXCEL із пакета MS Office 2000 (Microsoft Corp., США) і проаналізовано з використанням критерію Стьюдента. Статистично вірогідними вважали зміни при Р £ 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Для розуміння патогенезу імунологічних порушень за умов ішемічно-реперфузійного пошкодження мозку важливим є вивчення змін, що виникають при цьому в імунній системі, зокрема, у центральному її органі - вилочковій залозі.

Згідно з нашими дослідженнями, у субкапсулярній та глибокій кірковій зонах тимуса одномісячних тварин неповна глобальна ішемія головного мозку підвищила сумарну щільність незмінених і деструктивних тимоцитів. У даних зонах залози тримісячних тварин за аналогічних умов сумарна щільність нормальних лімфоцитів зросла, а деструктивних – знизилася. Емоксипін у субкапсулярній зоні одномісячних щурів зменшував постішемічний приріст щільності нормальних та, особливо, деструктивних тимоцитів. Незважаючи на протилежне спрямування порушень щільності нормальних та деструктивних тимоцитів у цій зоні залози тримісячних щурів, емоксипін також частково нормалізував ці показники. У глибокій кірковій зоні тимуса одномісячних щурів препарат посилив вплив ішемії мозку на щільність нормальних тимоцитів, проте повністю нормалізував щільність деструктивних клітин, а в тримісячних – мав антиішемічний ефект, однак із деякими ознаками надлишковості дії.

Неповна глобальна ішемія головного мозку підвищила сумарну щільність незмінених тимоцитів у внутрішньочасточкових периваскулярних просторах тимуса щурів обох вікових груп та знизила щільність деструктивних тимоцитів у тримісячних. Емоксипін в одномісячних щурів запобігав підвищенню сумарної щільності нормальних тимоцитів та знижував щільність деструктивних, незважаючи на відсутність постішемічних змін останнього показника, що, ймовірно, можна пов’язати з недостовірним його підвищенням під впливом ішемії. У даній зоні тимуса тримісячних щурів емоксипін частково нормалізував щільність нормальних тимоцитів та повністю – клітин з ознаками деструкції.

У мозковій зоні тимуса одномісячних щурів ішемія мозку знизила щільність незмінених та деструктивних клітин, а в тримісячних - підвищила щільність незмінених тимоцитів. Емоксипін не вплинув на ефекти ішемії мозку в одномісячних шурів, а в тримісячних - посилив ішемічний вплив на щільність нормальних тимоцитів та спричинив зростання щільності деструктивних клітин, незважаючи на відсутність постішемічних змін цього показника.

Враховуючи гетерогенність лімфоїдних клітин тимуса, ми дослідили вікові особливості впливу неповної глобальної ішемії головного мозку на розподіл різних класів тимоцитів у структурно-функціональних зонах залози, а також ефекти емоксипіну на виявлені постішемічні зміни (табл.1-2).

Таблиця 1

Структура лімфоїдної популяції в окремих зонах тимуса одномісячних щурів у контролі та після ішемії головного мозку (М±m)

Примітки: вірогідність змін щодо показників: * – у контрольних тварин; ^ – у тварин із неповною глобальною ішемією мозку; у чисельнику – питома щільність нормальних клітин, у знаменнику – клітин з ознаками деструкції (на 1 мм² залози)

Аналізуючи сукупність змін структури лімфоїдної популяції тимуса після неповної глобальної ішемії мозку, можна зазначити, що в субкапсулярній, глибокій кірковій зоні тимуса тварин обох вікових груп та у внутрішньочасточкових периваскулярних просторах одномісячних щурів має місце стабільне зростання щільності малих тимоцитів при одночасному зниженні тих чи інших класів менш зрілих клітин. У внутрішньочасточкових периваскулярних просторах тимуса тримісячних щурів зростання щільності малих та середніх тимоцитів не супроводжувалося зниженням щільності інших форм, тобто, відбувся


8-09-2015, 19:08