МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
ДЕРЖАВНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД
„ТЕРНОПІЛЬСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ
УНІВЕРСИТЕТ імені І.Я. ГОРБАЧЕВСЬКОГО”
ГОРБАТЮК СВІТЛАНА МИХАЙЛІВНА
УДК : 611-018.5:611.81:616.831-005.001
МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ОСОБЛИВОСТІ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ ДИСЛІПОПРОТЕЇДЕМІЇ
14.03.01 – нормальна анатомія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Тернопіль - 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Вінницькому національному медичному університеті імені М.І. Пирогова МОЗ України.
Науковий керівник : Заслужений працівник освіти України, лауреат Державної премії в галузі науки і техніки, доктор біологічних наук, професор, Піскун Раїса Петрівна , Вінницький національний медичний університет імені М.І. Пирогова МОЗ України, завідуюча кафедрою медичної біології.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор Волков Костянтин Степанович, Державний вищий навчальний заклад „Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського” МОЗ України, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології.
доктор біологічних наук, професор Стеченко Людмила Олександрівна, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, професор кафедри гістології та ембріології.
Захист відбудеться 18 квітня 2008 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 58.601.01 у Державному вищому навчальному закладі „Тернопільському державному медичному університеті імені І.Я. Горбачевського” МОЗ України за адресою:46001, м. Тернопіль, Майдан Волі, 1.
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Державного вищого навчального закладу „Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського” МОЗ України за адресою: 46001, м. Тернопіль, вул. Січових Стрільців, 8.
Автореферат розісланий “13” березня 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
доктор медичних наук, професор Я.Я. Боднар
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Дисліпопротеїдемії являються однією з найбільш важливих причин розвитку атеросклерозу та збільшують ризик судинних захворювань (Н.О. Кравчун і співавт., 2005; М.И. Лутай, 2004; M. Akishita, 2004). В Україні хвороби системи кровообігу становлять 62 % в структурі загальної смертності, а серед них найважливішу проблему являють собою цереброваскулярні захворювання (ЦВЗ) в зв’язку з їх поширеністю, особливістю клінічного перебігу, грубою інвалідизацією та високою смертністю (В.И. Волков, 2003; С.М. Кузнєцова, 2004; С.Ю. Марцевич, 2004).
Дисліпопротеїдемії та атеросклероз – є важливими етіологічними факторами порушення мозкового кровотоку та причиною виникнення інсульту (В.М. Коваленко, А.П. Дорогой, 2003; B. Stegmayr, R. Asplund, 2003). Щорічно в Україні мозковим інсультом уражається близько 175 тис. чол.. Таким чином, в нашій країні кожні 3 хвилини виникає новий випадок інсульту. На відміну від багатьох країн, де інсульт займає серед причин смерті третє місце, у нас він значно випередив злоякісні новоутворення і впевнено займає друге місце. Смертність від інсульту серед чоловіків в віці 45-74 роки становить 606, а серед жінок – 408 людей на 100 тис. населення. Це відповідно в 11,2 і 12,75 раз вище в порівнянні з Швейцарією і в декілька раз більше ніж в інших країнах Європи (Н.Е. Полищук, Д.В. Гуляев, 2003). До того ж, як відзначають експерти ВООЗ, у майбутньому кількість цереброваскулярних захворювань ще зростатиме, що пов’язано з постарінням планети та збільшенням поширеності як у розвинених країнах, так і в країнах, що розвиваються, таких чинників ризику ЦВЗ, як дисліпопротеїдемія, ожиріння, артеріальна гіпертензія, куріння, гіподинамія тощо (И.В. Богданова, 2005; B. Stegmayr, R. Asplund, 2003).
Аналізуючи літературу по даній темі, встановлено, що на даний час існує незначна кількість досліджень присвячених вивченню характеру дифузних і осередкових змін головного мозку при атеросклеротичній ангіапатії. По морфологічних, біохімічних, симптоматичних, патофізіологічних, патологічних і клінічних наслідках це явище ще не до кінця досліджене (Ш. Хорват, 2004). В остані дисятиріччя особлива увага приділяється поглибленому вивченю нейрона як морфофункціональної одиниці нервової тканини (Ю.Б. Чайковський і співавт, 2003). І хоча мікроскопічні дослідження значно розширили уявлення про структуру та функції нейронів, вивчення їх морфофункціонального стану при різних патологічних станах не втрачає своєї актуальності і понині (С.И. Тертышный, В.И. Дарий, 2006; А.В.Корсак, Л.О. Стеченко, 2006; Б.А. Локай, К.С. Волков, 2006).
Враховуючи, що в патогенезі склерозу судин головного мозку провідну роль відіграють ішемічні та гіпоксичні явища, які виникають в результаті порушення кровообігу, одним із способів корекції патологічних змін в нервовій тканині може бути покращення кровопостачання та кисневого забезпечення. В даному випадку доцільне використання нейрометаболічних церебропротекторів – препаратів які захищають та покращують адаптивні структури головного мозку при негативних впливах (В. Мамчур, С. Дронов, 2005). До числа таких препаратів з політропними фармакологічними властивостями, спроможними одночасно впливати на різні ланки патогенезу захворювання і, які б сприяли регресу склеротичних змін в органах, відносяться вінборон, пентоксифілін та вінпоцетін, які ми взяли для експериментального дослідження, і порівняння їх ефективності.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційне дослідження виконано відповідно до плану Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова і є частиною комплексної науково-дослідницької роботи „Експериментальне обґрунтування доцільності застосування бензофурокаїну, вінборону та тіотриазоліну як лікарських засобів з політропними фармакологічними властивостями при гострих та хронічних запальних процесах”, № держреєстрації – 0199U004043. Дисертантка є співвиконавцем даної наукової теми.Тема дисертації затверджена проблемною комісією МОЗ і АМН України „Морфологія людини” 28 вересня 2005 р. (протокол № 68).
Мета дослідження. Встановити структурно-функціональні особливості головного мозку кролів в нормі, за умов експериментальної дисліпопротеїдемії та оцінити церебропротекторний потенціал препаратів з політропною дією.
Задачі дослідження.
1. Провести макроморфометричну оцінку лінійних і об’ємних показників головного мозку в нормі, при експериментальній дисліпопротеїдемії та при її корекції.
2. Визначити структурні особливості кровоносних судин, та нейроцитів головного мозку в нормі, при змодельованій патології та її фармакокорекції.
3. Провести порівняльне вивчення особливостей біохімічних показників ліпідного обміну сиворотки крові в нормі, при експериментальній дисліпопротеїдемії та при її корекції.
4. Провести порівняльне вивчення мозкового кровотоку кролів в нормі, за умов експериментальної дисліпопротеїдемії та під корегуючим впливом лікарських препаратів.
5. З комплексним урахуванням морфофункціональних змін вивчених структур головного мозку співставити отримані результати для оцінки впливу коригуючих препаратів.
Об’єкт дослідження: реактивність та морфогенез кровоносного русла і нейроцитів головного мозку кролів при експериментальній дисліпопротеїдемії та під корегуючим впливом лікарських препаратів.
Предмет дослідження: макро- та мікроморфометричні параметри головного мозку, гемомікроциркуляторне русло, ліпіди, нейроцити.
Методи дослідження: біохімічні – для дослідження ліпідного спектру сироватки крові; функціональні – для визначення об’ємної швидкості мозкового кровотоку; морфологічні: а) макроморфометричні – для визначення параметрів головного мозку; б) гістологічний, гістохімічний, мікрометричний та електронномікроскопічний – для дослідження якісних і кількісних характеристик судин і клітин головного мозку в нормі, при експериментальній дисліпопротеїдемії та її корекції, статистичні – для об’єктивізації отриманих даних.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження (біохімічне, функціональне, морфометричне, гістологічне, гістохімічне та електронномікроскопічне) головного мозку тварин в нормі та при експериментальній дисліпопротеїдемії.
Вперше якісними і кількісними методами встановлено, що при дисліпопротеїдемії в головному мозку виникає структурна перебудова у вигляді дистрофії та атрофії, прогресивне зниження об’ємної швидкості мозкового кровотоку, зміни кровоносних судин, які характеризуються збільшенням площі поперечного перерізу і площі стінки артерій, потовщенням стінки, зменшенням площі просвіту судин та зниженням їх пропускної здатності. Вперше встановлено, що в корі головного мозку виникають морфофункціональні зміни, які носять дистрофічний та деструктивний характер, що виражається в звуженні просвіту капілярів, зменшенні об’ємів пірамідних клітин, появі нейронів з різним ступенем хроматолізу та нервових „клітин – тіней”, а також ділянок вільних від нейроцитів; порушується функція гематоенцефалічного бар'єру за рахунок розширеного перикапілярного простору, виникає деструкція та дистрофія органел ендотеліоцитів та нейроцитів. В результаті всебічного наукового аналізу досліджуваного матеріалу вперше представлено порівняльну оцінку церебропротекторного потенціалу препаратів з політропною дією при експериментальній дисліпопротеїдемії. Встановлено, що використання з лікувальною метою вінборону, пентоксифіліну та вінпоцетіну покращує кровопостачання головного мозку (збільшується діаметр і площа просвіту судин, зменшується товщина стінки), що призводить до регенераторних змін нейроцитів (збільшується кількість нормохромних нейроцитів, відновлюються їх об’ємні показники), а також сприяє внутрішньоклітинній регенерації структурних компонентів нейронів кори головного мозку.
Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження розширюють і поглиблюють знання про компенсаторно-адаптаційні можливості головного мозку при експериментальній дисліпопротеїдемії. Результати дослідження показують особливості морфофункціональних змін кровоносних судин і нейроцитів в умовах даної патології та при її корекції препаратами політропної дії, виявляють ефективність досліджуваних препаратів, а також доцільність їх використання в практичній медицині.Розроблено „Спосіб лікування експериментального склерозу судин головного мозку” (Деклараційний Патент України на корисну модель №16408А, Бюлетень № 8 від 15.09.2006 р.).
Матеріали дисертації впроваджені в навчально-педагогічний процес і наукову роботу кафедр гістології, оперативної хірургії та топографічної анатомії Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова; кафедр нормальної анатомії людини, медичної біології паразитології і генетики Кримського державного медичного університету ім. С.Г. Георгієвського; кафедр гістології, цитології та ембріології, анатомії людини і медичної біології Харківського державного медичного університету; кафедри медичної біології Української медичної стоматологічної академії; кафедр анатомії людини, загальної та оперативної хірургії з топографічною анатомією Буковинського державного медичного університету.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням. Здобувачем особисто проаналізована наукова література й обґрунтована тема і задачі дослідження, проведено експеримент, зібрано матеріал з наступною його обробкою, заливкою та приготуванням препаратів. Зроблено функціональне, макроморфометричне, гістологічне, гістохімічне дослідження. Здійснено опис гістологічних і електронномікроскопічних препаратів, проведено мікроморфометрію з наступною статистичною обробкою отриманих результатів та оформленням дисертації. Разом з асистентом кафедри медичної біології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова Шевчук Т.І. проведено біохімічне дослідження. Авторка провела аналіз та узагальнення результатів дослідження і сформулювала основні положення. Разом з науковим керівником сформулювано висновки. У наукових працях опублікованих у співавторстві, і в актах впровадження, що стосується науково-практичної новизни, використано фактичний матеріал автора.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації оприлюднені на IV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології (Вінниця, 2004); Всеукраїнській науковій конференції „Актуальні питання клінічної анатомії та оперативної хірургії” (Чернівці, 2004); ІІ Міжвузівській конференції студентів і молодих вчених з міжнародною участю (Вінниця, 2005); IV Національному конгресі геронтологів і геріатрів України (Київ,2005); науково-практичній конференції з міжнародною участю „Сучасні проблеми терапії – від гіпотез до фактів” (Вінниця, 2005); ІІІ Міжнародній науковій конференції студентів та молодих вчених „Молодь та медична наука на початку ХХІ століття” (Вінниця, 2006); Х Пущинській школі-конференції молодих вчених „Біологія – наука ХХІ століття” (Пущино, Росія, 2006); Всеукраїнській науковій конференції „Актуальні питання вікової анатомії та ембріотопографії” (Чернівці, 2006); Всеукраїнській науково-практичній конференції „Сучасні проблеми морфології” (Полтава, 2006); ХIІ Університетській (ХХХХII вузівській) науково-практичній конференції молодих вчених і фахівців (Вінниця, 2006);науково-практичній конференції з міжнародною участю „Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів” (Тернопіль, 2006); науково-практичній конференції з міжнародною участю „Експериментальна і клінічна біохімія” (Люблін, Польща, 2006); на ІV національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України (Сімферополь-Алушта, 2006); на ІІІ Міжнародних Пироговських читаннях (Вінниця, 2006); на ІІІ національному з’їзді фармакологів України (Одеса, 2006); на V-ої Міжнародній науково-практичній конференції студентів та молодих вчених „Новітні підходи до лікування в сучасній медицині” (Ужгород, 2007); на ІІІ Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ біології”(Львів, 2007), на VI міжнародному конгресі з інтегративної антропології (Вінниця, 2007).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 19 наукових праць, з них 3 – у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 15 – у збірниках матеріалів науково-практичних конференцій, з яких 5 одноосібних, отримано 1 деклараційний патент на корисну модель.
Структура і об’єм дисертації. Дисертація викладена державною мовою на 191 сторінках, з яких 136 сторінок залікового принтерного тексту. Робота складається з вступу, огляду літератури, розділу „Матеріали і методи”, трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел та одного додатку. Робота ілюстрована 88 рисунками, 32 таблицями. Список літературних джерел містить 297 робіт, з яких 175 викладені кирилицею, 122 – латиницею.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал і методи дослідження. Дослідження проведене на 28 статевозрілих кролях-самцях породи „шиншила” на базі Науково-експериментальної клініки Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова. Усі втручання та забій тварин проводили з дотриманням міжнародних принципів «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985р.), „Загальних етичних принципів експериментів на тваринах”, ухвалених Першим Національним конгресом з біоетики (Київ, 2001р.). Комісією з питань біоетики Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова (протокол № 7 від 25 січня 2006 р.) порушень у проведенні досліджень не виявлено.
Модель дисліпопротеїдемії була створена за класичною методикою Анічкова шляхом перорального введення кристалічного холестерину на соняшниковій олії з морквою в дозі 0,5 г/кг маси тіла кроля протягом 3 місяців. Піддослідні тварини були розподілені на 5 груп: 1 група - інтактні тварини, які утримувались в звичайних умовах віварію, 2- тварини з експериментальною дисліпопротеїдемією (ЕДЛП) без подальшого лікування, 3 - тварини з ЕДЛП, яким в наступні 30 діб проводили корекцію даної патології препаратом вінборон (5 мг/кг), 4 – група тварин на тлі змодельованої патології в наступні 30 діб отримувала препарат пентоксифілін (5 мг/кг); 5 – група, якій також в наступні 30 діб проводили корекцію ЕДЛП препаратом вінпоцетін (2 мг/кг).
Для біохімічного дослідження забирали кров із крайової вени вуха тварин і визначали наступні показники ліпідного обміну: загальний холестерин (ЗХ) (за методом Ілька), ліпопротеїни низької щільності (ЛПНЩ) - за методом В.В. Меньшикова з гепариновим реактивом (1987), фосфоліпіди (ФЛ) - за методом А.А.Пентюка, (1985), тригліцериди (ТГ) (реактивом Наша), ліпопротеїни високої щільності (ЛПВЩ) (за методом Ілька), та розраховували індекс атерогенності (ІА) (співвідношеня загального холестерину і фосфоліпідів).
Рівень мозкового кровотоку визначали в кінці досліду під тіопенталовим наркозом за допомогою флоуметра (вимірювача об’ємної швидкості кровотоку) Transonic Animal Research Flowmeters T 106 Series. Приваскулярний датчик Transonic Flowprobe #2RB1071, накладений на внутрішню сонну артерію, фіксував швидкість мозкового кровотоку (мл/хв). Результати моніторування були зафіксовані на жорсткому диску комп’ютера у вигляді графічних даних. Вимірювання рівня мозкового кровотоку проводили протягом 30 хв. фіксуючи показники об’ємної швидкості мозкового кровотоку (ОШМК) кожні 5 хвилин експерименту. За 100% було взято швидкість мозкового кровотоку в початковий стан вимірювання.
По закінченню досліду всім піддослідним та інтактним тваринам проводили евтаназію тіопенталовим наркозом і для подальшого дослідження забирали головний мозок, який для фіксації поміщали разом з черепом в 10 % розчин нейтрального формаліну. Перед цим череп звільняли від м’язів голови, видаляли нижню щелепу та частину верхньої для кращого доступу фіксуючої рідини до мозку. Через 8-10 діб мозок відпрепаровували від черепа і залишали для дофіксації у 10 % розчині формаліну.
Масу тварин визначали на настільних вагах типу РН-10ц УЗ, а масу головного мозку – за допомогою ваг лабораторних типу ВЛР-200. Об’єм головного мозку визначали за формулою A.N. Iwaniuk (1992). Мозковий індекс визначали за співвідношенням маси головного мозку до маси тіла тварини (Г.Г. Автандилов, 1990). Лінійні величини – довжина, висота мозку, а також довжина і ширина півкуль головного мозку були отримані за допомогою штангенциркуля за вказаними у літературі схемами (H. Stephan, 1981).
Виготовлення целоїдинових блоків проводили за загальноприйнятими методиками (О.В.Волкова, 1982). Для різки целоїдинових блоків використовували санний мікротом МС-2. Отримані целоїдинові зрізи фарбували за класичним методом Ф. Нісля, а заморожені – по Лізону суданом чорним-В для виявлення загальних ліпідів. Оцінку мікропрепаратів проводили під мікроскопом МІКМЕД-1 при різних збільшеннях (окуляр 10, об’єктив 8, 20, 40, 90).
Для вимірювання мікрометричних характеристик використовували програмне забезпечення UTHSCSA Image Tool® for Windows® (version 2.00) (Відео Тест – розмір 5.0) в інтерактивному режимі з використанням об’єктива x40 і фотоокуляра x10. Топографію та цитоархітектоніку кори головного мозку визначали за атласом мозку кролика С.М. Блінкова (1973). На целоїдинових зрізах товщиною 8 - 10 мкм, забарвлених за методом Ф. Нісля, вимірювали площу профілю та діаметр нейроцитів, ядер та ядерець пірамідних нейронів третього та п’ятого шарів кори головного мозку. Використовуючи дані цих вимірювань, визначали об’єм клітин, їх ядер, ядерець, та ядерно-цитоплазматичне співвідношення. Об’єми розраховували за формулою С.М. Блінкова (1964). На целоїдинових зрізах визначали вміст різних типів нейронів пірамідного та гангліонарного шарів сенсомоторної кори головного мозку: нормохромних, гіпохромних, різко гіпохромних, гіперхромних, різко гіперхромних, що відображають різний морфофункціональний стан цих клітин (Н.Н. Боголепов, 2003). Морфометрію артерій м’якої мозкової оболонки проводили за методикою С.В. Шорманова (1982). Досліджували судини малого калібру: визначали площу поперечного перерізу артерій, площу просвіту, зовнішній і внутрішній діаметр, товщину стінки та індекс Вогенворта.
Для електронномікроскопічного дослідження шматочки сенсомоторної кори головного мозку (поле 4) вирізали із правої півкулі, та фіксували 2,5 % розчином глютарового альдегіду на фосфатному буфері (рН 7,4), дофіксовували 1 % розчином осмію. Заливали в суміш епоксидних смол (Епон 812). Зрізи виготовляли на ультрамікротомі УМТП7. Контрастування зрізів проводили 1 % розчином уранілацетату і цитратом свинцю за Рейнольдсом (Б. Уіклі, 1975). Ультраструктурне дослідження проводили на мікроскопі ПЕМ 125К.
Результати досліджень статистично обробляли з використанням програми „STATISTICA 5.5” (належить ЦНІТ ВНМУ ім. М.І. Пирогова, ліцензійний № AXXR910A374605FA) і математично-статистичного пакету „Microsoft Offise Excel – 2003”. Для кожного з отриманих варіаційних рядів оцінювали характер розподілів, визначали середню арифметичну для кожної
8-09-2015, 22:26