Молекулярні механізми реалізації нейротропної дії вітаміну РР та його біологічно активних похідних

6. І.О. Шиманський, Г.В. Донченко, А.П. Клименко Т.М. Кучмеровська. Механізми індукованих цукровим діабетом порушень процесу вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку щурів: ефект нікотинаміду // Укр. біохім. журн. – 2006. - Т. 78, № 4. - С. 130-136.

7. Kuchmerovskaya T.,Donchenko G., Shimansky I., Pakirbaeva L. Effect of the inhibitors of PKC on serotoninergic transmission in streptozotocin-induced diabetes // 35^th An. Meeting of EASD. – Diabetologia, V.42, Suppl.1. – Brussels, Belgium, 1999. – P. A 12, 6.

8. Shymanskyy I., Kuchmerovska T., Donchenko G., Klimenko A. NAD-Receptor System in the mechanisms of nicotinamide action in diabetic encephalopathy // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv, Ukraine, 2004. - P. 386.

9. I. Shymanskyy, T. Kuchmerovska, A. Klimenko. The relation of diabetes-associated mono-ADP-ribosylation to impaired brain serotonin transmission: effect of nicotinamide // 40^th An. Meeting of the EASD. – Diabetologia, V.47, Suppl. 1. – Munich, Germany, 2004. – P. A 99, О. 256.

10. I. Shymanskyy, T. Kuchmerovska, G. Donchenko, A. Klimenko. Diabetes-associated cAMP/PKA-dependent facilitation of 5-HT release from rat brain synaptosomes: effect of nicotinamide // 41st EASD An. Meeting. – Diabetologia, V.48, Suppl. 1. - Athens, Greece, 2005. – A 426, 1181.

11. Kuchmerovska T, Shymanskyy I., Donchenko G., Klimenko A. Possible involvement of cyclic AMP system in nicotinamide adenine dinucleotide-induced serotonin release from rat brain synaptosomes // Укр. біохім. журн. – 2005. – Т. 77, № 2 (спец. випуск). - С. 64.

12. I. Shymanskyy, T. Kuchmerovska, G. Donchenko, A. Klimenko. Possible mechanisms of nicotinamide and nicotinoyl-GABA action in central nervous system of STZ-diabetic rats // 19^th World Diabetes Congress. – Diabetic Medicine, V.23. – Cape Town, South Africa, 2006. – P. 107-108.

АНОТАЦІЯ

Шиманський І.О. Молекулярні механізми реалізації нейротропної дії вітаміну РР та його біологічно активних похідних. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2008.

Дисертацію присвячено дослідженню біологічної дії вітаміну РР та його похідних за різних функціональних станів ЦНС. У роботі експериментально обґрунтовано концепцію можливості реалізації нейротропних ефектів вітаміну РР безпосередньо на рівні модуляції процесів зворотного поглинання та вивільнення нейромедіаторів синаптичними закінченнями та з’ясовано конкретні механізми такої дії.Показано, що механізм NAD-індукованого вивільнення серотоніну синаптосомами мозку опосередковується активацією сигнальних шляхів протеїнкінази С/А і включає інгібування Na⁺ ,К⁺ -АТРази та активацію потенціал- керованих Na-каналів. На експериментальній моделі цукрового діабету 1 типу встановлено, що зростання специфічного зв’язування NAD⁺ синаптичними мембранами корелює з підвищенням як спонтанного, так і індукованого деполяризуючими агентами вивільнення серотоніну синаптосомами, але супроводжується зниженням вивільнення медіатору у відповідь на дію екзогенного NAD⁺ . Відмічено роль активації сигнального шляху G_s -білки/cAMP/протеїнкіназа A, внаслідок підвищення рівня моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків, у посиленні вивільнення серотоніну за діабету. Встановлено також підвищення активності полі-АDP-рибозополімерази клітинних ядер, що викликано інтенсифікацією вільнорадикального пошкодження ДНК. Введення нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК за умов ЦД1 сприяло зниженню процесів моно- та полі-АDP-рибозилювання нейронних білків, інтенсивності ліпопероксидації, а також нормалізувало функціонування NAD-модуляторної системи та сигнальних шляхів протеїнкінази А/C, що призводило до зниження спонтанного та індукованого вивільнення серотоніну синаптичними закінченнями. Результати дослідження дозволяють зробити висновок про доцільність використання вітаміну РР з метою попередження розвитку та комплексного лікування діабетичної невропатії та на його основі вести пошук терапевтичних засобів, скерованих на нормалізацію функціональної активності ЦНС.

Ключові слова:нікотинамід, нікотиноїл-ГАМК, NAD-зв’язувальний білок, моно- та полі-ADP-рибозилювання, протеїнкінази А та С, Na⁺ ,K⁺ -АТPаза, серотонін, синаптосоми, цукровий діабет.

аннотация

Шиманский И.О. Молекулярные механизмы реализации нейротропного действия витамина РР и его биологически активных производных. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена изучению биологического действия витамина РР и его производных при разных функциональных состояниях ЦНС. В работе экспериментально обоснована концепция возможности реализации нейротропных эффектов витамина РР непосредственно на уровне модуляции процессов захвата и высвобождения нейромедиаторов синаптическими окончаниями, а также исследованы конкретные механизмы такого действия.Показано, что механизм NAD-индуцированного высвобождения серотонина синаптосомами головного мозга опосредуется активацией сигнальных путей протеинкиназы С/А и включает ингибирование Na⁺ ,К⁺ -АТРазы, а также активацию потенциал-зависимых Na-каналов. На экспериментальной модели сахарного диабета 1 типа установлено, что повышение специфического связывания NAD⁺ синаптическими мембранами коррелирует с усилением как спонтанного, так и индуцированного деполяризирующими агентами высвобождения серотонина синаптосомами, однако сопровождается снижением высвобождения в ответ на действие экзогенного NAD⁺ . Отмечена роль активации сигнального пути G_s -белки/cAMP/протеинкиназа A, в результате повышения уровня моно-ADP-рибозилирования синаптосомальных белков, в усилении высвобождения серотонина при диабете. Установлено также повышение активности поли-АDP-рибозополимеразы клеточных ядер, что вызвано интенсификацией свободнорадикального повреждения ДНК. Введение никотинамида и никотиноил-ГАМК при диабете способствовало снижению процессов моно- и поли-АDP-рибозилирования нейронных белков, интенсивности липопероксидации, а также нормализовало функционирование NAD-модуляторной системы и сигнальных путей протеинкиназы А/C, что приводило к снижению спонтанного и индуцированного высвобождения серотонина синаптическими окончаниями. Результаты исследования позволяют сделать вывод о целесообразности применения витамина РР для предупреждения развития и комплексного лечения диабетической нейропатии, а также на его основе вести поиск терапевтических средств, направленных на нормализацию функциональной активности ЦНС.

Ключевые слова:никотинамид, никотиноил-ГАМК,NAD-связывающий белок, моно- и поли-ADP-рибозилирование,протеинкиназы А и С, Na⁺ ,K⁺ -АТPаза, серотонин,синаптосомы, сахарный диабет.

SUMMARY

Shymanskyy I.O. Molecular mechanisms of neurotropic action of vitamin PP and its biologically active derivatives . – Manuscript .

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 – biochemistry. – O.V. Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

The dissertation is devoted to investigating the mechanisms of biological action of vitamin PP and its derivatives under different functional states of central nervous system. Particular attention has been focused on the experimental support of the concept of direct involvement of these compounds in modulation of synaptic transmission via NAD-binding protein. It was found that effects associated with this protein contribute to the changes in the plasma membranes electrochemical gradients and may also depend on receptor-coupled intracellular signalling pathways. Consistent with the involvement of “action potentials” in NAD-related neuromodulation, tetrodotoxin (specific inhibitor of potential-operated Na channels) abolished the release of serotonin from isolated synaptic endings evoked by NAD⁺ (1 mM) . These changes were accompanied by NAD⁺ ability to inhibit Na⁺ ,K⁺ -ATPase activity in non-competitive fashion. Protein kinase C/A inhibitor, H7, completely prevented secretogenic action of NAD⁺ . Thus, NAD⁺ -induced serotonin release from synaptosomes appears to involve protein kinase C/A pathway which probably links downregulation of Na⁺ ,K⁺ -ATPase and depolarization of synaptic membranes.

Further study was undertaken to define the character of functional interplay between NAD⁺ availability and changes in the specific binding of NAD⁺ by brain synaptic membranes in STZ-diabetic rats (70 mg/kg b.w.) which were treated by single injection for 6 hours (short-term) or chronically for two weeks (long-term) after 6 or 4 weeks of diabetes respectively with nicotinamide (NAm) or nicotinoyl-GABA (N-GABA) in low or high (20 and 200 mg/kg b.w.) doses. The brain NAD⁺ and ATP contents were significantly reduced in diabetes vs. control (respectively by 27.3±1.9 % and 30.1±2.7 %). No difference occurred between increments in NAD⁺ contents after single administration of high NAm dose in control and diabetes indicating preserved nervous cells ability to synthesize NAD⁺ in sufficient amounts. Depletion of brain NAD⁺ and ATP contents defined in diabetes could be regarded as a consequence of free radical- and oxidant-induced increase in ADP-ribosylation since poly(ADP-ribose)polymerase activation was currently established. Diabetes was also found to be associated with enhanced oxidative stress in brain as it is evident from 2.9–fold increase in accumulation of thiobarbituric acid reactive substances vs. control. These changes were accompanied by 51.0 % increase in maximal capacity of [U-¹⁴ C]NAD⁺ binding sites (Bmax) of synaptic membranes. In spite of augmented binding, NAD⁺ (1 mmol/L) failed to evoke the release of serotonin from the synaptosomes isolated from diabetic rat brain to the level of control. While NAD⁺ and ATP contents were similarly counteracted by low and high doses of NAm and N-GABA treatments, NAD⁺ reception fully restored only in case of chronic administration of high Nam dose. Discrepancies in efficacy of the drugs to restore NAD⁺ contents and normalize NAD⁺ binding and serotonin release after long-term treatments corresponded to their efficacy as free radicals scavengers and Parp inhibitors being the strongest in case of high NAm dose.

Our data provide further evidence that diabetes may cause physiologically drastic failure in realization of serotonin-mediated effects in CNS.It was found that striking increase in spontaneous and evoked serotonin release associated with diabetes is, at least partially, dependent on G_s protein/cAMP/PKA-mediated facilitatory pathway in synaptic endings related to enhanced mono-ADP-ribosylation of extranuclear proteins. NAm treatment, initiated after diabetes duration of 4 weeks, virtually normalized both mono-ADP-ribosylation and serotonin release.

In conclusion, the present study confirms the complex pattern of vitamin PP neuroprotective action used in high therapeutic doses. Its beneficial effects on diabetes-associated brain failures can be related to normalization of NAD⁺ reception most likely due to its antioxidant and anti-ADP-ribosylating properties.

Key words: nicotinamide, nicotinoyl-GABA,NAD-binding protein, mono- and poly-ADP-ribosylation,protein kinases А/С, Na⁺ ,K⁺ -АТPase, serotonin, uptake, release, synaptosomes, diabetes mellitus.

СПИСОК СКОРОЧЕНЬ

ГАМК – г-аміномасляна кислота;

N-ГАМК – нікотиноїл-ГАМК;

ТБК-активні продукти – продукти, які реагують з тіобарбітуровою кислотою;

ЦД1 - цукровий діабет 1 типу;

4-AP - 4-амінопіридин;

СТХ - холерний токсин;

G-білки - GTP-зв’язувальні білки;

LTX - латротоксин

NАm - нікотинамід;

Parp - [Poly(ADP-ribose) polymerase] - полі-ADP-рибозилполімераза;

PKA - протеїнкіназа А;

РКС - протеїнкіназа С;

ТТХ - тетродотокcин;

VTD - вератридин;