Нейротропні ефекти координаційних сполук на основі оксіетилідендифосфонату германію з нікотиновою кислотою, нікотинамідом і магнієм (МІГУ-4, 5, 6)

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ВОЛОШЕНКОВ ДМИТРО БОРИСОВИЧ

УДК 615.217.34:547.419.5:577.164.16

НЕЙРОТРОПНІ ЕФЕКТИ КООРДИНАЦІЙНИХ СПОЛУК НА ОСНОВІ ОКСІЕТИЛІДЕНДИФОСФОНАТУ ГЕРМАНІЮ З НІКОТИНОВОЮ КИСЛОТОЮ, НІКОТИНАМІДОМ І МАГНІЄМ (МІГУ-4, 5, 6)

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Одеса – 2008

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. До найпоширеніших захворювань центральної нервової системи (ЦНС), що характеризуються хронічним, нерідко прогресуючим перебігом, належить епілепсія, а також нейродегенеративні захворювання (паркінсонізм, хвороба Альцгеймера). Незважаючи на значні досягнення останніх років у фармакотерапії багатьох захворювань ЦНС, істотного прогресу в лікуванні епілепсії і паркінсонізму досягти не вдалося. У 20-30% пацієнтів епілептичні напади не піддаються терапії існуючими протиепілептичними препаратами [Brodie M., 2001; Schmidt W., 2002] і у більше третини пацієнтів відзначаються їх виражені небажані ефекти [Sabers A. et al., 2003; Perucca E., 2006]. Недостатня ефективність сучасної фармакотерапії епілепсії обумовлена як гетерогенними, досить складними механізмами виникнення і розвитку захворювання, так і не повністю з'ясованими механізмами дії протиепілептичних препаратів.

Одним з підходів у створенні нейротропних препаратів, у тому числі протиепілептичних, є використання похідних природних метаболітів організму людини, наприклад, таких, як похідні медіаторних амінокислот, циклічних нуклеотидів, вітамінів та інших біологічних субстанцій, які проникають через гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) і біологічні мембрани, і, одночасно, самі по собі, мають нейротропні властивості [Мішин М.А. і співавт., 1991; Топузян В.О., 1992; Ковальов Г.В і співавт., 1993; Бурчинський С.Г., 2005]. Це обумовлює їхнє клінічне застосування для корекції різних розладів ЦНС судинного, травматичного, інфекційного походження [Крижанівський Г.Н. і співавт., 2002; Adibhatta A. et al., 2002; Бурчинський С.Г., 2006].

Прикладом нового протиепілептичного препарату, створеного на основі природних метаболітів, є лакозамід – оптичний антипод амінокислоти L-серину [Bialer M. et al.,2001; Stohr T. et al., 2007], який проявляє виражені протисудомні ефекти на різних моделях епілептичного синдрому [Bialer M. et al., 2004; Hovinda L., 2005], а також анальгетичну дію [Shohr T. et al., 2007]. На сьогоднішній день синтезовані нові комплексні сполуки оксіетилідендифосфонату германію з нікотиновою кислотою (МІГУ-4), нікотинамідом (МІГУ-5) і магнієм (МІГУ-6) [Кресюн В.Й. і співавт., 2003; Сейфуліна І.Й. і співавт., 2004]. Дослідження їхньої фармакокінетики показало, що вони добре з судинної системи проникають через ГЕБ [Відавська А.Г., 2001] і, як передбачається, можуть мати виражені психотропні ефекти, однак їх фармакологічну активність у цьому напрямку досліджено недостатньо. Таким чином, ця робота присвячена дослідженню нейротропних ефектів нових біологічно активних речовин (БАР) – МІГУ-4, 5, 6.

Зв'язок роботи з науковими планами, програмами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи кафедри загальної і клінічної фармакології Одеського державного медичного університету (ОДМУ), затвердженої МОЗ України «Комплексне експериментальне визначення фармакологічної активності нових похідних германійвмісних сполук з біолігандами» (№ держреєстрації 0105U008878), яка виконується спільно з вченими Одеського національного університету (ОНУ) ім. І. І. Мечникова МОН України й Опольського університету (Польща). Дисертант є співвиконавцем зазначеної теми.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є скринінг і порівняльна оцінка нейротропних ефектів нових координаційних сполук германію на основі оксіетилідендифосфонатогерманатів з нікотиновою кислотою, нікотинамідом і магнієм (відповідно МІГУ-4, 5, 6).

Задачі дослідження:

1. Визначити вплив МІГУ-4, 5, 6 на спонтанну рухову активність і поведінку інтактних тварин, а також з'ясувати загальну нейротропну спрямованість дії зазначених сполук.

2. З’ясувати впливи синтезованих БАР на м'язовий тонус і координацію рухів інтактних тварин.

3. Дослідити ефекти МІГУ-4, 5, 6 на процеси навчання і пам'яті.

4. Вивчити фармакологічні ефекти, що розвиваються при одноразовому введенні МІГУ-4, 5, 6 в умовах моделювання різних форм судомного синдрому in vivo і in vitro.

5. З’ясувати характерні риси протисудомних ефектів найбільш активної досліджуваної речовини в умовах її курсового введення.

6. Провести ізоболографічний аналіз взаємодії найбільш активної досліджуваної протисудомної сполуки і стандартних протиепілептичних препаратів.

7. Визначити вплив МІГУ-4, 5, 6 на поведінку, м'язовий тонус і деякі вегетативні реакції тварин в умовах розвитку різних моделей паркінсонічного синдрому.

Об'єкт дослідження – пошук та створення нових вітчизняних протисудомних лікарських засобів.

Предмет дослідження – еспериментальний аналіз нейротропних ефектів похідних оксіетилідендифосфонату германію з нікотиновою кислотою, нікотинамідом і магнієм (МІГУ-4, 5, 6).

Методи дослідження – нейрофармакологічні, електрофізіологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено дослідження особливостей впливу нових БАР в ряду оксіетилідендифосфонатогерманатів з різними біолігандами на поведінкову активність і електрофізіологічні показники у інтактних тварин, а також в умовах моделювання нейропатологічних синдромів.

Вперше виявлено, що МІГУ-4 і 5 знижують рухову активність, послаблюють м'язовий тонус і мають протисудомну дію. Найвираженішу протисудомну дію на моделях як гострої, так і хронічної судомної активності, мав МІГУ-5 - похідне нікотинаміду. Дослідження впливу МІГУ-5 на активність нейронів зрізів гіпокампу виявило, що його протисудомна дія обумовлена потенціюванням механізмів як прямого, так і зворотного гальмування в системі колатералей Шафера. Ізоболографічний аналіз взаємодії МІГУ-5 і стандартних протиепілептичних препаратів показав вибіркове потенціювання МІГУ-5 протисудомних ефектів вальпроату натрію, карбамазепіну, дифенілгідантоїну, топірамату, габапентину, ламотриджину і левітирацетаму.

Вперше показано, що сполука МІГУ-6 зменшує м'язову ригідність і поведінкові прояви паркінсонізму на різних експериментальних моделях паркінсонічного синдрому. Виявлено, що досліджувані нові сполуки, залежно від хімічної структури, здатні одночасно проявляти транквілізуючі, адаптивні, протисудомні та інші психотропні ефекти.

Практична значимість роботи .Отримані дані про протисудомні і протипаркінсонічні ефекти нових БАР – МІГУ-5 і МІГУ-6 розширюють і поглиблюють існуючі відомості про нейрофармакологічні властивості сполук германію з біолігандами і можуть слугувати базою для створення на їхній основі нових ефективних протиепілептичних і протипаркінсонічних засобів. Вперше виявлені закономірності залежності «доза – протисудомний ефект», а також мінімально ефективні дози досліджуваних сполук, що необхідно враховувати при розробці лікарських препаратів на їхній основі. Результати роботи впроваджено у навчальний процес на кафедрах: загальної та клінічної фармакології, нормальної фізіології, загальної та клінічної патологічної фізіології Одеського державного медичного університету, фармакології Луганського державного медичного університету, фармакології Дніпропетровської державної медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є особистою науковою працею автора. Здобувач самостійно вивчив і узагальнив сучасний стан проблеми за даними інформаційних джерел, сформулював мету і завдання дослідження, здійснив планування. Самостійно освоїв методи експериментальних досліджень і виконав запланований обсяг експериментів. Зробив узагальнення і провів аналіз отриманих результатів, опублікував і апробував основні дані, написав і оформив дисертаційну роботу. У розробці концепції досліджень і обговоренні отриманих результатів активну участь брали співавтори опублікованих робіт, яким автор висловлює глибоку повагу.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були повідомлені на IV Національному конгресі геронтологів України (Київ, 2005); 26-му міжнародному протиепілептичному конгресі (Париж, 2005); II міжнародній науковій конференції «Гомеостаз: физиология, патология, фармакология и клиника» (Одеса, 2005); 4-му міжнародному конгресі «The Improvement of the Quality of life on Dementia, Epilepsy, MS and Peripheral Neuropathies» (Одеса, 2006); 7-му Європейському конгресі епілептологів (Гельсінкі, 2006); III Всеукраїнській науковій конференції, присвяченій 70-річчю від дня народження Г.М. Чайченка «Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології» (Київ, 2006); III національному з'їзді фармакологів України «Фармакологія 2006 - крок у майбутнє» (Одеса, 2006); науково-практичній конференції молодих вчених з міжнародною участю «Вчені майбутнього» (Одеса, 2006); VI читаннях ім. В.В. Підвисоцького, присвячених 150-річчю з дня народження (Одеса, 2007); XI міжнародній конференції Української протиепілептичної Ліги (Київ, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 наукових праць, з яких 4 статті в профільних наукових журналах, атестованих ВАК України, та 12 тез у міжнародних та вітчизняних виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладенона 157 сторінках комп’ютерного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, 2 розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів,висновків і списку використаної літератури. Робота ілюстрована 27 таблицями і 22 рисунками. Бібліографічний покажчик включає 224 джерела, з них 62 – кирилицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження проводили на щурах-самцях лінії Вістар масою 140-250 г і білих мишах-самцях лінії СВА масою 18-26 г, які утримувалися в стандартних умовах віварію ОДМУ. Досліди проводили згідно вимог GLPта комісії біоетики ОДМУ (протокол № 41В от 14 вересня 2007 р.). В експериментах використовували нові БАР на основі оксіетилідендифосфонатогерманатів з біолігандами – нікотиновою кислотою, нікотинамідом і магнієм (відповідно МІГУ- 4, 5, 6), які були створені на кафедрі загальної хімії та біополімерів ОНУ ім. І.І. Мечнікова під керівництвом з.д.н.т. України, професора І.Й. Сейфуліной.

Дослідження впливу нових БАР на поведінкові реакції інтактних тварин проводилося на моделях прямої актометрії, «відкритого поля» [Буреш Я. и соавт., 1991]., обертового стрижня [Dunham N.W. et al., 1957] і умовної реакції активного уникнення [Буреш Я. и соавт., 1991], а також аналізувалися фармакологічні ефекти сумісного введення нових БАР зі стандартними депримуючими (гексенал, 20,0 мг/кг; тіопентал-натрію, 50,0 мг/кг; діазепам, 5,0 мг/кг) і збуджуючими (фенамін, 1,0 мг/кг) засобами [Кресюн В.Й., 1973]. МІГУ-4, 5, 6 вводили внутрішньочеревно (в/о) дозами 1/10 ЛД₅₀ (34,0; 56,0; 45,0 мг/кг відповідно), 1/20 ЛД₅₀ (17,0; 28,0; 23,0 мг/кг відповідно), 1/40 ЛД₅₀ (8,5; 14,0; 12,0 мг/кг відповідно) і 1/80 ЛД₅₀ (4,2; 7,0; 6,0 мг/кг відповідно).

Для вивчення протисудомної дії досліджуваних БАР використовували моделі гострої і хронічної судомної активності, рекомендовані Міжнародною протиепілептичною лігою як скринінгові моделі: максимальних електрошокових судом (МЕС) [Swinyard et al., 1957], 6-Гц судом [Barton M.E. et al., 2001], [Swinyard et al., 1957], аудіогенних судом [Mohler M.H., 1986], судом, викликаних підшкірним (п/ш) введенням пентилентетразолу (ПТЗ) дозою 85 мг/кг, пікротоксину (ПКТ) дозою 2,7 мг/кг, бікукуліну (БКК) дозою 2,5 мг/кг, стрихніну дозою 1,2 мг/кг, внутрішньошлуночковим введенням N-метил-D-аспартату (NMDA) дозою 0,2 нг/5 мкл (клонічні судоми) і 3,0 нг/5 мкл (тонічні судоми). Осередки епілептичної активності (ЕпА) створювали за допомогою аплікації на кору мозку щурів розчинів стрихніну, бензилпеніциліну-натрію і ацетилхоліну за методикою [Шандра О.А. та співавт., 1999]. Кіндлінг у мишей і шупів моделювали в/о введенням ПТЗ у підпороговій дозі 30 мг/кг і транскорнеальною стимуляцією (8 мА, 60 Гц, 4 с) за методикою [Шандра О.А. та співавт., 1999]. При моделюванні судомних синдромів розраховували середньоефективні (ЕД₅₀ ), середньотоксичні (ТД₅₀ ) дози та захисний протисудомний індекс (співвідношення ТД₅₀ /ЕД₅₀ ) [Стефанов О.В., 2001]. Тваринам контрольних груп в/о вводили аналогічні об'єми фізіологічного розчину.

Підготовку переживаючих зрізів гіпокампу здійснювали за методикою, описаною М.И. Митюшовым (1985). З метою визначення характеру змін фокальних відповідей на дію досліджуваних БАР в омиваючий розчин додавали розчини МІГУ-5 (100-2000 мкмоль), фенітоїну (25-100 мкмоль), карбамазепіну (25-100 мкмоль), вальпроату кальцію (50-100 мкмоль) і кромокаліну (25-100 мкмоль).

Як препарати порівняння дії досліджуваних БАР на різних моделях судомного синдрому та для їх ізоболографічного аналізу, який проводили за методиками [Tаllaridа R.J., 1992; Luszczki J.J. et al., 2006; Jonker D.M. et al., 2007], використовували такі антиконвульсанти: карбамазепін, фенітоїн, вальпроєва кислота, левітирацетам, топірамат, габапентин, ламотриджин виробництва «Sigma» (США). Для з'ясування типу взаємодії БАР зі стандартними антиконвульсантами використовували 3 фіксовані співвідношення доз компонентів 1:3, 1:1 і 3:1 на моделі 6-Гц-індукованих судом.

Паркінсонічний синдром відтворювали шляхом п/ш введення оксотреморину (0,25 мг/кг,«Sigma», Німеччина), в/о введення резерпіну (2 мг/кг, Рауседил, Гедеон Рихтер, Угорщина) за методикою Nickel B. et al. [1997], введенням каїнової кислоти (30 і 100 нг, «Sigma», Німеччина)у хвостате ядро [Крижановский Г.Н. и соавт., 1981], введенням 6-гідроксидофаміну (6-ГДА) в чорну речовину [Johansson J. et al., 1975]. Як референс-препарати в/о використовували скополаміну гідробромід і метилбромід («Sigma», Німеччина), які вводили дозами 0,5, 5,0, 10,0 мг/кг і 0,005, 0,05, 0,5 мг/кг відповідно, а також флупертин і L-DOPA («Sigma», Німеччина), які вводили дозами 5,0, 10,0 мг/кг і 8,0, 16,0 мг/кг відповідно.

Статистичну обробку одержаних результатів проводили за допомогою загальноприйнятих в медико-біологічних дослідженнях методів аналізу з використанням стандартних пакетів комп’ютерних програм[Лапач С. Н. и соавт., 2002].

Результати досліджень. Вплив БАР на поведінку інтактних тварин . У тесті прямої актометрії досліджувані БАР найбільш виразні ефекти мали в дозах 1/20 і 1/10 ЛД_50. При цьому максимально пригнічувальний ефект на рухову активність виявив МІГУ-5 дозою 56,0 мг/кг (1/10 ЛД₅₀ ). В умовах «відкритого поля» під впливом МІГУ-6 (45,0 мг/кг) відзначалося найбільше посилення вертикального (на 33,3%) і горизонтального (на 23,5%) компонентів рухової активності, при цьому під впливом МІГУ-5 (56,0 мг/кг) вони найбільше знижувалися (відповідно на 77,8 і 86,5%). При дослідженні ефектів БАР на м'язову координацію мишей у тесті "обертового стрижня" у жодній з досліджуваних доз МІГУ-4, 5, 6 не спричинювали істотної нейротоксичної дії. В умовах підвищеної рухової активності щурів введення МІГУ-4 у максимальній досліджуваній дозі 34 мг/кг достовірно не впливав на активуючу дію фенаміну, введення МІГУ-5 (45,0 мг/кг) приводило до значного зниження ефектів фенаміну, достовірно зменшуючи прояви горизонтальної і вертикальної рухової активності (відповідно на 50,4 і 67,1%), епізодів грумінгу (на 61,5%), не пригнічуючи дослідницької активності. Введення МІГУ-6 (45 мг/кг) приводило до збільшення показників вертикальної і горизонтальної рухової активності як порівняно з інтактними тваринами (відповідно на 61,5 і 71,7%), так і в умовах введення фенаміну (відповідно на 7,5 і 8,2%).

На моделі тіопентал-викликаного сну МІГУ-4, 5, 6 не мали самостійної здатності викликати сон, однак показали здатність впливати на фармакологічний сон, збільшуючи відсоток заснулих тварин при збільшенні дози БАР. Найбільші відсотки заснулих тварин (66,7 і 91,6%) спостерігалися при введенні МІГУ-5 дозами 28,0 мг/кг і 56,0 мг/кг відповідно. При вивченні здатності нових БАР пролонгувати тіопенталовий сон найбільш виразний депримуючий ефект мав МІГУ-5, який у всіх досліджуваних дозах (14,0, 28,0 і 56,0 мг/кг) достовірно зменшував латентний період засипання (на 34,2, 41,8, 46,8% відповідно) і збільшував тривалість тіопенталового сну (на 0,3, 5,9 і 65,7% відповідно). МІГУ-6 у всіх досліджених дозах збільшував латентний період засипання (на 1,3, 3,7 і 6,3% відповідно) і зменшував тривалість тіопенталового сну (12,5, 27,6 і 60,9% відповідно). Таким чином, досліджувані БАР дозозалежно впливали на фармакологічний сон, викликаний тіопенталом натрію, який має властивості ГАМК-міметика, що дозволяє припускати можливі механізми дії МІГУ-4, 5, 6.

При вивченні впливу БАР на швидкість формування і відтворення умовної реакції (УР) активного уникнення показано, що введення МІГУ-4, 5, 6 істотно не прискорювало навчання, а збільшення дози МІГУ-4 і 5 обумовлювало погіршення формування УР і прискорення її згасання в тесті активного уникнення. Цей ефект пов'язаний зі зміною сприйняття і оцінки психотравмуючої ситуації і є одним з проявів транквілізуючої дії. Таким чином, можна вважати, що всі досліджувані БАР мають транквілізуючу активність. Разом з тим, МІГУ-5 істотно зменшував, порівняно з контролем, число поєднань УР і безумовного рефлексу через 24 год після вироблення рефлексу, що свідчить про поліпшення відтворення УР і короткострокової пам'яті.

Таким чином, оксіетилідендифосфонатогерманати мають адаптогенну, транквілізуючу і снотворну активність, виразність якої залежить від дози БАР та їхньої структури.

Вплив синтезованих БАР на експериментальні нейропатологічні синдроми. На моделі МЕС найбільш виразний дозозалежний протисудомний ефект мав МІГУ-5, який проявлявся зменшенням числа тварин з розвиненими тонічними судомами задніх кінцівок. ЕД₅₀ МІГУ-5 у мишей і щурів, відповідно, становили 92,0 і 78,0 мг/кг. ЕД₅₀ МІГУ-6 була дещо більшою – відповідно 164,0 і 191,0 мг/кг. МІГУ-4 не мав істотної протисудомної дії в умовах МЕС. Захисний індекс (співвідношення ТД₅₀ /ЕД₅₀ ) для МІГУ-5 становив на мишах 1,7 і на щурах – 2,4; для МІГУ-6 – відповідно на мишах і щурах 1,9 і 1,0, і відповідав такому для вальпроєвої кислоти.

Результати досліджень ефектів нових БАР на генералізовану судомну активність різної природи свідчали про те, що МІГУ-4 не впливав на інтенсивність судом у різних умовах їхнього моделювання (табл. 1). МІГУ-5 мав ефективну протисудомну дію, що полягала у зменшенні числа тварин з розвиненими клоніко-тонічними судомами на моделях судом, індукованих ПТЗ і NMDA. Водночас МІГУ-5 не виявляв помітної протисудомної дії в умовах моделей судом, викликаних за допомогою блокаторів ГАМК-ергічної передачі (пікротоксин і бікукулін) або антагоніста гліцинових рецепторів – стрихніну (див. табл. 1). МІГУ-6 мав протисудомні ефекти на моделях ПТЗ- і NMDA-викликаних судом. При цьому його ЕД₅₀ була більшою, ніж для МІГУ-5. Таким чином, виразність протисудомних ефектів цих БАР залежить від природи судомної активності.

Таблиця 1. Вплив БАР і стандартних протиепілептичних препаратів на хімічно-викликані судомні реакції у мишей

При вивченні ефектів нових БАР на моделі аудіогенних судом у мишей МІГУ-5 значно зменшував виразність судом (знижуючи до 2,5 балів) у дозах 20-80 мг/кг. Середньоефективна доза пригнічення клонічних судом становила 62 мг/кг. МІГУ-4 і МІГУ-6 не проявляли істотного впливу в умовах цієї моделі судомної активності.

Дослідження ефектів нових БАР на моделі фармакорезистентної судомної активності, викликаної за допомогою транскорнеальної електростимуляції струмом частотою 6 Гц, показало, що МІГУ-4 і 6 не мали виразної протисудомної дії. Водночас МІГУ-5 виявляв дозозалежну протисудомну активність: ЕД₅₀


8-09-2015, 19:29