Зміни протеїназно-інгібіторного балансу при рості злоякісних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ

І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

КОВТОНЮК ОКСАНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 616-006.04:615.477.2:57.042.2:615.277.3

ЗМІНИ ПРОТЕЇНАЗНО-ІНГІБІТОРНОГО БАЛАНСУ ПРИ РОСТІ ЗЛОЯКІСНИХ ПУХЛИН З ІНДУКОВАНОЮ РЕЗИСТЕНТНІСТЮ ДО ЦИСПЛАТИНУ

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Науковий керівник-

академік НАН України, доктор медичних наук, професор Чехун Василь Федорович,

директор, завідувач відділу механізмів протипухлинної терапії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Офіційні опоненти: -

доктор біологічних наук, професор Воронцова Ада Леонідівна,

провідний науковий співробітник відділу експериментальних клітинних систем Інститутуекспериментальної патології, онкології і радіобіології

ім. Р.Є. Кавецького НАН України;

кандидат біологічних наук

Кизим Олександра Йосипівна,

старший науковий співробітник лабораторії біохімії Інституту отоларингології ім. проф. О.С.Коломійченка АМН України

Захист дисертації відбудеться “26” березня 2008 року о 13.30 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий “26” лютого2008 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук

Л.М. Шлапацька

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Проблема формування лікарської резистентності до цитостатиків є, без сумніву, надзвичайно актуальною і навіть ключовою в клінічній практиці, оскільки саме цей феномен у багатьох випадках визначає неефективність хіміотерапії і ставить під загрозу життя онкологічних хворих.

На сьогодні відомо, що резистентність пухлинних клітин до цитостатиків є багатофакторним явищем і пов’язана з рядом особливостей клітин на рівні цитоплазматичної мембрани, внутрішньоклітинних систем детоксикації, систем репарації (Liang X.J. et al., 2004; Longley D.B. et al., 2005; Чехун В.Ф. и соавт., 2006; Chekhun V.F. et al., 2007). Однією з відомих причин виникнення лікарської резистентності може бути порушення сигнальних шляхів розвитку апоптозу (Biliran H.Jr. et al., 2005; Choi H.K. et al., 2005; Ohmichi M. et al., 2005). Слід зазначити, що серед численних факторів регуляції апоптозу, викликаного дією протипухлинних препаратів, значну роль відіграють серинові протеїнази – представники окремого класу протеолітичних ферментів. Зокрема, на сьогодні встановлена участь серинових протеїназ у регуляції апоптозу, індукованого дією цисплатину – протипухлинного препарату, який широко застосовується в клінічній практиці (Kim R. et al., 2001; Wu C.H. et al., 2002; Downing S. et al., 2003; Chien J. et al., 2006; Alfano D. et al., 2006). За цих обставин логічно припустити участь серинових протеїназ та їх інгібіторів і в формуванні резистентності до цисплатину, тим більше, що дані ферменти та їх інгібітори відіграють суттєву роль у механізмах, які асоціюються зі зниженням накопичення цитостатику в пухлинній клітині (Dong Y. et al., 1997).

Слід зазначити, що в літературі вже є інформація про зв’язок між зміною рівня експресії серинових протеїназ та розвитком резистентності пухлинних клітин до цисплатину (Dong Y. et al., 1997; Osmak M. et al., 1999; Alfano D. et al., 2006), хоча цей зв’язок виявлений лише в системах іn vitro. Що стосується ситуації in vivo, то тут проблема залишається відкритою, і її висвітлення є, безумовно, актуальним; не менш важливим за цих умов є вивчення рівня інгібіторів протеолітичних ферментів, оскільки нормальне функціонування системи протеолізу знаходиться під контролем ендогенних інгібіторів протеолітичних ферментів.

Серед основних природних інгібіторів серинових протеїназ особливий інтерес викликають б₁ -інгібітор протеїназ (б₁ -ІП) і б₂ -макроглобулін (б₂ М), які є важливою складовою частиною антипротеолітичного потенціалу плазми крові (Hibbets К. et al., 1999;Нероев В.В. и соавт., 2007). Інтегральним показником, який дозволяє визначати ендогенну активність серинових протеїназ плазми крові/пухлинної тканини і дає уявлення про протеолітичний потенціал біологічного об’єкту, є рівень сумарної протеолітичної активності – ПРА (Веремеенко К.Н. и соавт., 2000). Враховуючи те, що співвідношення рівнів ПРА з рівнями б₁ -ІП і б₂ М свідчить про стан динамічної рівноваги між протеїназами та їх інгібіторами в плазмі крові чи пухлинній тканині, не виключено, що співставлення рівнів ПРА/б₁ -ІП і ПРА/б₂ М в динаміці росту пухлин з різним ступенем чутливості до цитостатику може бути важливим критерієм розвитку лікарської резистентності в умовах іn vivo. Саме цій проблемі – дослідженню змін протеїназно-інгібіторного балансу при рості пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину, присвячена дана робота.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі механізмів протипухлинної терапії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України у відповідності з планом науково-дослідної роботи інституту за темами: “Вивчення біологічних особливостей пухлинного процесу при формуванні фенотипу лікарської резистентності” (2000–2004 рр., державний реєстраційний № 0101U000670), “Роль гомоцистеїну в процесах формування лікарської резистентності пухлин до дії цитотоксичних препаратів” (2004–2007 рр., державний реєстраційний № 0104U006131).

Мета дослідження. Дослідити зміни протеолітичної активності та вмісту основних інгібіторів протеїназ (плазма крові та пухлинна тканина) при рості експериментальних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину.

Задачі дослідження.

1. Вивчити кінетику росту резистентної до цисплатину карциноми Герена.

2. Дослідити динаміку змін ПРА, вмісту б₁ -ІП та б₂ М в плазмі крові щурів при рості резистентної до цисплатину карциноми Герена.

3. Вивчити кінетику росту та інтенсивність метастазування карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.

4. Дослідити динаміку змін ПРА, вмісту б₁ -ІП та б₂ М в плазмі крові мишей при рості карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.

5. Дослідити динаміку змін ПРА та вмісту б₁ -ІП у тканині карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.

6. Вивчити зміни протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині при рості карциноми Герена та карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.

7. Проаналізувати кореляційні залежності між зміною рівнів ПРА, вмісту б₁ -ІП і б₂ М та кінетикою росту експериментальних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину.

Об’єкт дослідження – миші лінії С57BL/6 з перещепленою карциномою легені Льюїс (вихідного та резистентних до цисплатину підштамів); щури лінії Вістар з перещепленою карциномою Герена (вихідного та резистентного до цисплатину штамів).

Предмет дослідження – індукована резистентність до цисплатину, протеолітична активність та вміст основних інгібіторів протеїназ (б₁ -ІП та б₂ М), кінетика росту пухлин, метастазування.

Методи дослідження – використання експериментальних модельних систем пухлинного росту, біохімічні, статистичні.

Наукова новизна. Вперше експериментально доведено, що формування резистентності карциноми Герена та карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується суттєвими змінами кінетики пухлинного росту: пролонгацією латентного періоду росту пухлини та підвищенням швидкості її росту в експоненційній фазі. Встановлено, що зміна кінетики росту пухлин асоціюється з підвищенням рівнів ПРА і б₁ -ІП та зниженням рівня б₂ М в плазмі крові.

Вперше виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом резистентної карциноми Герена та рівнями ПРА (rho = 0,7; p = 0,000001) і б₁ -ІП (rho = 0,67; p = 0,000002) в плазмі крові. Пряма кореляційна залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,42; p = 0,05) і б₁ -ІП (rho = 0,65; p = 0,001) в плазмі крові виявлена також при рості карциноми легені Льюїс за умов розвитку резистентності до дії цисплатину. Аналогічний кореляційний зв’язок між об’ємом резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс та рівнями ПРА (rho = 0,5; p = 0,03) і б₁ -ІП (rho = 0,76; p = 0,0001) був виявлений безпосередньо і в пухлинній тканині.

Вперше за співвідношенням рівнів ПРА/б₁ -ІП та ПРА/б₂ М в плазмі крові тварин з різними за чутливістю до цисплатину пухлинами виявлено, що розвиток резистентності карциноми Герена та карциноми легені Льюїс до цитостатику супроводжується порушенням протеїназно-інгібіторного балансу в напрямку підвищення рівня ПРА. Показано, що при рості резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс (LLC-27) в пухлинній тканині значно підвищується рівень ПРА та знижується рівень б₁ -ІП у порівнянні з такими у вихідній пухлині. Виявлено асоціативний зв’язок між змінами протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині при розвитку резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину.

Практичне значення результатів дослідження. Особливості протеїназно-інгібіторного балансу, виявлені в динаміці росту пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину в плазмі крові та пухлинній тканині, можуть бути використані для подальшої розробки методів оцінки чутливості злоякісних пухлин до дії даного цитостатику. Одержані дані можуть також бути підґрунтям для пошуку шляхів профілактики метастазування через вплив на систему протеолізу.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто поставлена мета роботи, сформульовані основні завдання і налагоджені методи дослідження. Автором зібрана та проаналізована сучасна наукова література за темою дисертації, самостійно виконані наукові дослідження, проведено аналіз первинного матеріалу, статистичну обробку отриманих даних. Автором проведено теоретичне узагальнення результатів роботи, сформульовані основні положення і висновки дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені та обговорені на: VI конференції молодих онкологів України (Київ, 2003); ІІ науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005); ІІІ з’їзді онкологів та радіологів СНД (Мінськ, Білорусія, 2004); 18 European association for cancer research (Інсбрук, Австрія, 2004); International Student Congress of Medical Sciences (Гронінген, Нідерланди, 2005); всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів”, (Київ, 2006); International Medical Students’ Congress in Novi Sad (Сербія, 2006); 17 European Student’s Conference (Берлін, Німеччина, 2006); IV з’їзді онкологів та радіологів СНД (Баку, Азербайджанська Республіка, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових робіт, у тому числі 3 статті у провідних фахових журналах, рекомендованих ВАК України та 9 тез у матеріалах вітчизняних та міжнародних з’їздів та конференцій. Отримано 1 патент на винахід в Україні.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 148 сторінках друкованого тексту, складається із вступу, огляду літератури, 6-ти розділів, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел. Робота ілюстрована 11 таблицями та 36 рисунками. Список цитованої літератури налічує 215 першоджерел, у тому числі 195 зарубіжних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. В дослідженнях використано 478 мишей-самців лінії С57Bl/6 та 140 щурів-самців лінії Вістар, які були отримані з розплідника віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Утримання тварин та робота з ними проводилися у відповідності до загальноприйнятих міжнародних правил виконання робіт з експериментальними тваринами.

Штами карциноми Герена та карциноми легені Льюїс були отримані з Банку клітинних культур ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Перещеплення експериментальних пухлин здійснювали загальноприйнятим методом. Вироблення резистентності пухлин до цисплатину досягали шляхом послідовних перещеплень пухлинних клітин, які одержували від тварин, котрим було проведено курс ін’єкцій цитостатику.

Після перещеплення суспензії пухлинних клітин тварини були поділені на дві групи: контрольну і дослідну. Цисплатин (“Ebewe”, Австрія) вводили тваринам дослідної групи на 7 добу після перещеплення пухлини в дозі 1,2 мг/кг внутрішньочеревинно через день – всього п’ять ін’єкцій. Тваринам контрольної групи за аналогічною схемою вводили стерильнийфізіологічний розчин. Пухлини дослідної групи використовували для приготування суспензії клітин, які перещеплювали тваринам другого пасажу. В експериментах з карциномою Герена було проведено 12 послідовних перещеплень, в експериментах з карциномою легені Льюїс – 27. Вивчення кінетики росту пухлин та визначення показників системи протеолізу проводили у тварин контрольних груп.

Дослідження на щурах з кариномою Герена були проведені на 2 групах тварин: 1 група – тварини, яким було перещеплено вихідну карциному Герена (Guerin carcinoma, (GC));

2 група – тварини, яким було перещеплено карциному Герена, попередньо проведену через 12 пасажів на щурах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (GC/R).

В серії досліджень на мишах з кариномою легені Льюїс використовували 4 групи тварин:

1 група – тварини, яким було перещеплено вихідну карциному легені Льюїс (Lewis lung carcinoma, LLC).

2 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 9 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC- 9).

3 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 19 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC-19).

4 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 27 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC-27).

Таким чином, в експериментах з карциномою легені Льюїс були використані пухлинні підштами, отримані на різних етапах формування резистентності: LLC-9 (початковий етап), LLC-19 (проміжний етап), LLC-27 (кінцевий етап). В експериментах з карциномою Герена був використаний пухлинний підштам, отриманий на кінцевому етапі формування резистентності до цисплатину (GC/R).

Аналіз кінетики пухлинного росту проводили для кожної тварини за допомогою математичної моделі Вейбула росту гетерогенних пухлин (Weibull W, Sweden S., 1951). Кінетичні параметри росту пухлини визначали для кожної тварини контрольної групи за кінетичними кривими росту, які розраховували методом нелінійної регресії з використанням програми “Microcal Origin 7.0”.

Параметр “а” відображає швидкість росту цілісної пухлини в експоненційній фазі росту. Параметр “t_lag ” – латентний період росту первинної пухлини. Для аналізу динаміки змін кількості метастазів карциноми легені Льюїс використовували параметр “в” – швидкість метастазування, який характеризує темпи утворення метастатичних вузлів.

Визначення показників системи протеолізу проводили в плазмі крові тварин та пухлинній тканині. Для отримання плазми крові в якості антикоагулянта був використаний 3,8% розчин цитрату натрію в пропорції 9:1. Гомогенат пухлини готували на 0,05М трис-НСl буфері (рН 7,4).

ПРА плазми крові (мкмоль арг/хв на л плазми) чи тканини пухлини (мкмоль арг/хв на г білка) визначали за розщепленням аргінінвмісного лужного білка протамінсульфату спектрофотометричним методом К.М. Веремеєнка (Веремеенко К.Н. и соавт., 1988). Принцип методу ґрунтується на визначенні пептидів, що містять аргінін, які відщеплюються від протамінсульфату протеолітичними ферментами пухлинної тканини чи плазми крові, що дозволяє визначати сумарну активність нейтральних серинових протеїназ. Вміст б₁ -ІП у плазмі крові (г/л) та тканині пухлини (мкг/мг тканини) визначали за здатністю останнього пригнічувати гідроліз трипсином синтетичного субстрата N- бензоїл -DL-аргінін-p-нітроаніліда (БАПНА).

Вміст б₂ М в плазмі крові (г/л) визначали за здатністю інгібітора утворювати з трипсином активний комплекс, який розщеплює синтетичний субстрат БАПНА, але є нечутливим до інгібітора з бобів сої (Веремеенко К.Н. и соавт., 1988). Вміст білка в досліджуваних зразках визначали за методом Lowry O.H. та співавт. (1951).

Усі отримані кількісні результати досліджень підлягали статистичній обробці загальноприйнятими методами варіаційної і кореляційної статистики з використанням пакету прикладних програм “Microsoft Excel 7.0”. Із сукупності даних розраховували середнє арифметичне варіаційного ряду (М), похибку середнього арифметичного (m), критерій Ст’юдента (t), рівень значущості (р). Різницю вважали статистично достовірною при рівні значимості р<0,05. Ступінь кореляційного зв’язку між окремими показниками визначали з використанням комп’ютерної програми “STATISTICA 6.0” методом непараметричної рангової кореляції Спірмена (rho).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

На першому етапі дослідження доцільно було переконатися, чи дійсно отримані шляхом послідовних перещеплень пухлинних клітин підштами карциноми Герена та карциноми легені Льюїс є резистентними до цисплатину. Дослідження показали, що у мишей із карциномою легені Льюїс по мірі зростання курсів введення цисплатину відмічали поступове зменшення впливу цитостатика на ріст первинної пухлини та її метастазування (табл. 1).

Таблиця 1

Протипухлинний та антиметастатичний ефект цисплатину при рості карциноми легені Льюїс (28 доба після перещеплення пухлини)

Примітки:

* – P<0,05 у порівнянні з вихідною пухлиною;

^# – P<0,05 у порівнянні з відповідним контролем.

Карцинома Герена після 12 послідовних курсів введення цисплатину також практично втратила чутливість до цитостатика: відсоток гальмування росту пухлини складав 4,2% (р>0,05), тоді як аналогічний показник в групі тварин з вихідною пухлиною досягав 95% (р<0,01).

Кінетика росту карциноми Герена та карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину. Зниження чутливості пухлин до цисплатину супроводжується суттєвими змінами кінетики їх росту. Зокрема, для резистентної до цисплатину карциноми Герена характерною є пролонгація латентного періоду росту пухлини в 3,3 рази та підвищення швидкості її росту в 2,0 рази в експоненційній фазі порівняно з вихідною пухлиною (р<0,05).

Кінетика росту резистентних до цисплатину підштамів карциноми легені Льюїс також мала суттєві відмінності порівняно з такою у вихідній пухлині (рис.1).

Аналіз кінетичних параметрів росту карциноми легені Льюїс свідчить, що для пухлин з середнім і високим ступенем резистентності до цисплатину (LLC-19 та LLC-27) характерним є пролонгація латентного періоду їх росту (в 2,0 рази) та підвищення швидкості росту в експоненційній фазі (в 3,4 та 3,7 рази, відповідно). Цікаво, що для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) такі зміни не характерні.

Незважаючи на тривалу пролонгацію латентного періоду росту пухлин LLC-19 та LLC-27, швидкість їх росту в експоненційній фазі є значно вищою порівняно з пухлиною LLC, що, на нашу думку, нівелює ефект затримки латентного періоду росту даних пухлин та призводить до швидкого наростання пухлинної маси.

Таким чином, при співставленні кінетики росту підштамів карциноми Герена та карциноми легені Льюїс,


8-09-2015, 20:14