Формування резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжувалося також зміною інтенсивності її метастазування: статистична обробка результатів виявила підвищення середньої кількості метастазів на термінальній фазі росту пухлини LLC-27 (p<0,05) порівняно з вихідною пухлиною (табл. 1). Аналіз динаміки змін швидкості метастазування при зниженні чутливості карциноми легені Льюїс до цисплатину свідчить про його неоднонаправлені зміни: від зростання (на 18,2%; p<0,05) до зниження (на 20,9%; p<0,001).
Таким чином, кінетика росту та інтенсивність метастазування карциноми легені Льюїс визначається ступенем її резистентності: для пухлин з середнім і високим ступенем резистентності (LLC-19 та LLC-27) характерним є пролонгація латентного періоду росту пухлини (в 1,9 та 2,0 рази, відповідно), підвищення швидкості росту в експоненційній фазі (в 3,3 та 3,7 рази, відповідно) та зростання інтенсивності метастазування (пухлина LLC-27). Для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) такі зміни не є характерними.
Протеолітична активність та вміст основних інгібіторів протеїназ у плазмі крові тварин при рості пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину. Визначення рівнів ПРА, б1 -ІП і б2 М в плазмі крові щурів з вихідною та резистентною до цисплатину карциномою Герена проводили у динаміці росту пухлини: на 9, 18, 21, 25 добу після перещеплення.
В плазмі крові щурів із резистентною до цисплатину карциномою Герена в латентний період її росту виявлено зниження рівня ПРА на 32,2% порівняно з аналогічним показником у плазмі крові тварин із вихідною пухлиною (табл. 2). В експоненційній фазі росту (період з 18 по 21 добу включно) резистентної пухлини відмічено значне зростання рівня ПРА в плазмі крові (в 2,4 та 2,3 рази, відповідно; p<0,05) порівняно з таким у плазмі крові тварин із вихідною пухлиною. Аналогічні зміни продовжували відмічати на термінальній фазі росту пухлин: величина ПРА в плазмі крові тварин з резистентною пухлиною в 2,2 рази перевищувала таку в плазмі крові тварин з вихідною пухлиною (p<0,05).
Таблиця 2
ПРА (мкмоль арг/хв на л) у плазмі крові щурів при рості карциноми Герена з індукованою резистентністю до цисплатину
| Пухлина | 0 доба | 9 доба | 18 доба | 21 доба | 25 доба |
| GC | 139,0±5,0 | 121,0±6,0 | 99,0±3,0* | 108,0±4,0* | 151,0±9,0 |
| GC/R | 139,0±5,0 | 82,0±8,0*, # | 233,0±19,0*, # | 249,0±24,0*, # | 329,0±15,0*, # |
Примітки:
GC – вихідна карцинома Герена, GC/R – резистентна до цисплатину карцинома Герена;
* – Р<0,05 у порівнянні з інтактним контролем;
# – Р<0,05 у порівнянні з відповідним показником у групі з вихідною пухлиною.
Таким чином, аналіз отриманих даних свідчить, що характерною особливістю резистентної до цисплатину карциноми Герена є суттєве підвищення рівня ПРА в експоненційній та термінальній фазах росту пухлини порівняно з аналогічним показником в групі тварин з вихідною пухлиною (p<0,05).
Зміни протеолітичного потенціалу плазми крові щурів з резистентною до цисплатину карциномою Герена супроводжуються також суттєвими змінами рівнів основних інгібіторів протеїназ, які визначають антипротеолітичний потенціал. Зокрема, в експоненційній фазі росту резистентної карциноми Герена в плазмі крові тварин було виявлено підвищення рівня б1 -ІП (в середньому на 28,5%) порівняно з таким у тварин з вихідною пухлиною (p<0,05).
При співставленні рівнів ПРА та б1 -ІП в експоненційній фазі росту вихідної та резистентної до цисплатину карциноми Герена виявлено однонаправлений характер змін даних показників: зі зниженням величини ПРА з деяким запізненням у часі відмічали також і зниження рівня б1 -ІП у плазмі крові тварин із вихідною пухлиною; підвищення рівня ПРА супроводжувалось паралельним зростанням вмісту інгібітора в плазмі крові тварин з резистентною пухлиною. На думку дослідників (Акбашева О.Е. и соавт., 1999), зростання рівня б1 -ІП можна розглядати як адекватну реакцію організму на підвищення ПРА, спрямовану проти деструкції тканин та поширеності пухлинного процесу. Зрозуміло, що для нейтралізації високого рівня ПРА в плазмі крові щурів з резистентною пухлиною, необхідним є підвищення вмісту інгібітора, що і спостерігається в експерименті. З іншого боку, підвищення рівня б1 -ІП як білка гострої фази запалення є несприятливим фактором перебігу захворювання і тому характеризує резистентну пухлину як більш агресивнішу.
Динаміка змін б2 М – універсального інгібітора протеолітичних ферментів, в плазмі крові тварин з вихідною та резистентною до цисплатину карциномою Герена має однонаправлений характер, який проявляється в зниженні рівня інгібітора. Однак, було встановлено, що зниження ступеня чутливості пухлини до цитостатика супроводжується статистично достовірним зниженням рівня б2 М в латентний період росту (на 16,7%) та в експоненційній фазі росту пухлини (на 18,0%).
Визначення протеїназно-інгібіторного балансу проводили шляхом обчислення співвідношення рівнів ПРА/б1 -ІП та ПРА/б2 М. Величину даного співвідношення в плазмі крові щурів із групи інтактного контролю приймали за одиницю і обчислювали на основі процентного співвідношення, яке для кожного з показників у групі контролю дорівнювало 100% (табл. 3).
Результати дослідження показали, що характерною особливістю резистентної до цисплатину карциноми Герена є зміни в направленості протеїназно-інгібіторного балансу в експоненційній та термінальній фазах росту пухлини (табл. 3). Зокрема, в плазмі крові щурів із вихідною карциномою Герена зниження величини ПРА/б1 -ІП відносно рівня інтактного контролю асоціюється з пригніченням протеолізу, очевидно, за рахунок інгібування активності протеолітичних ферментів. На противагу наведеним даним, величина співвідношення рівнів ПРА/б1 -ІП в експоненційній та термінальній фазах росту резистентної пухлини в 2,0 рази (p<0,05) перевищує таку в групі тварин з вихідною пухлиною, що фактично свідчить про порушення динамічної рівноваги між протеолітичними ферментами та їх інгібітором у бік підвищення сумарної активності серинових протеїназ при розвитку резистентності карциноми Герена до цисплатину. Слід також зазначити, що величина співвідношення рівнів ПРА/б1 -ІП вказує на те, що рівень б1 -ІП в плазмі крові щурів з резистентною пухлиною є недостатнім для нейтралізації наявної ПРА.
Величина співвідношення рівнів ПРА/б2 М також була значно вищою в плазмі крові щурів із резистентою до цисплатину карциномою Герена (табл.3), що свідчить про суттєве порушення рівноваги “фермент-інгібітор” при розвитку резистентності карциноми Герена до цисплатину.
Експоненційна фаза росту резистентної до цисплатину карциноми Герена характеризувалася значним підвищенням співвідношення рівнів б1 -ІП/б2 М в плазмі крові порівняно з відповідним показником у групі тварин із вихідною пухлиною (табл. 3), що свідчить про істотне порушення антипротеолітичного балансу при розвитку резистентності пухлини до цисплатину.
Підсумовуючи результати проведеного фрагменту роботи, можна констатувати, що при розвитку резистентності карциноми Герена до цисплатину найбільш суттєві відмінності в кінетиці пухлинного росту та характері змін протеїназно-інгібіторного балансу були виявлені в експоненційній фазі росту пухлин.
Наступним завданням роботи було дослідження динаміки змін показників системи протеолізу в плазмі крові мишей з різними за чутливістю до цисплатину підштамами карциноми легені Льюїс. Визначення рівнів ПРА, б1 -ІП і б2 М в плазмі крові мишей різних груп проводили на 10, 15, 20, 25, 28 добу після перещеплення пухлини.
При зниженні чутливості пухлини до цитостатика суттєві зміни рівнів ПРА були виявлені в латентний період та експоненційній фазі росту пухлини (табл. 4).
В латентний період росту пухлини LLC-9 (як і пухлини LLC) не відмічали вірогідних змін ПРА (р>0,05) порівняно з відповідним показником інтактного контролю, тоді як для пухлин з більш низьким ступенем чутливості до цисплатину (LLC-19 і LLC-27) характерним було суттєве підвищення рівня ПРА (в 1,6 та 2,0 рази, відповідно, р<0,05). При зниженні чутливості до цисплатину карциноми легені Льюїс в експоненційній фазі її росту також відмічали зростання ПРА в плазмі крові (р<0,05). Крім того, було показано, що зміна рівнів ПРА в плазмі крові мишей із карциномою легені Льюїс в експоненційній фазі росту (на 25 добу) визначається ступенем резистентності пухлини до цисплатину: для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) характерним є незначне підвищення ПРА (в 1,4 рази), для пухлин з середнім (LLC-19) та високим (LLC-27) ступенем резистентності – значне підвищення ПРА (в 2,1 та 4,1 рази, відповідно).
Таким чином, аналіз одержаних даних свідчить про підвищення величини ПРА в плазмі крові мишей із карциномою легені Льюїс при розвитку резистентності до цисплатину: зі збільшенням ступеня резистентності пухлини до цитостатика відмічається підвищення ПРА в латентний період та експоненційній фазі росту.
Співставлення рівня б1 -ІП в експоненційній фазі росту різних за чутливістю до цисплатину підштамів карциноми легені Льюїс свідчить, що зниження чутливості пухлини до цитостатика супроводжується суттєвим підвищенням рівня б1 -ІП в плазмі крові тварин. Зокрема, вміст інгібітора в плазмі крові тварин із пухлиною LLC-27 на 60% перевищував значення інтактного контролю (р<0,05), тоді як для пухлин LLC і LLC-9 таких змін не виявлено. Різниця між рівнем даного інгібітора в плазмі крові тварин з пухлиною LLC та з пухлиною LLC-27 складала 58,5% (р<0,05). Відмічено асоціативний зв’язок між зростанням рівня б1 -ІП в експоненційній фазі росту пухлини LLC-27 та підвищенням інтенсивності її метастазування.
Співвідношення рівнів ПРА/б1 -ІП, величина якого зростає зі збільшенням ступеня резистентності карциноми легені Льюїс, вказує на те, що, незважаючи на високий рівень б1 -ІП по відношенню до інтактного контролю, в плазмі крові мишей з пухлинами LLC-19 та LLC-27 спостерігається відносний дефіцит б1 -ІП, тобто концентрації інгібітора недостатньо для нейтралізації наявної активності протеолітичних ферментів (табл. 5). Необхідно також зазначити, що найбільш суттєві зміни співвідношення рівнів ПРА/б1 -ІП відмічаються при рості пухлини LLC-27, для якої характерним була найвища інтенсивність метастазування. Високий метастатичний потенціал пухлини LLC-27 порівняно з пухлиною LLC свідчить про підвищення її інвазивності, реалізація якої вимагає високої активності протеолітичних ферментів.
В плазмі крові мишей всіх груп на різних етапах спостереження за ростом пухлин виявлено зниження рівня б2 М у порівнянні з відповідним показником у інтактних тварин. Встановлено, що підвищення ступеня резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується зниженням рівня б2 М в латентний період росту пухлини. Зокрема, вміст інгібітора в плазмі крові тварин із пухлинами LLC-19 і LLC-27 знижувався відповідно на 23,3% та 30,8% у порівнянні з інтактним контролем (р<0,05). Для пухлин LLC і LLC-9 таких змін не виявлено. Вміст інгібітора в плазмі крові тварин із пухлиною LLC-27 був зниженим на 27,2% порівняно з таким у плазмі крові тварин з пухлиною LLC (р<0,05).
Зниження чутливості карциноми карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжувалось також порушенням співвідношення між рівнями ПРА та б2 М в плазмі крові в бік підвищення ПРА та дефіциту інгібітора. Порушення даної рівноваги було найбільш виражене в плазмі крові мишей з пухлинами LLC-19 та LLC-27 (табл. 5).
Таким чином, співвідношення “фермент-інгібітор” при розвитку резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину свідчить про зниження рівнів б1 -ІП та б2 М відносно рівня активності протеолітичних ферментів.
ПРА та вміст б1 -ІП у тканині карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину. Загальновідомо, що одним з можливих джерел надходження протеолітичних ферментів та їх інгібіторів у кровоносне русло може бути синтез їх злоякісними клітинами з подальшою секрецією в позаклітинний простір. За цих обставин цікаво було співставити зміни рівнів ПРА і б1 -ІП в пухлинній тканині та плазмі крові мишей з вихідною та резистентною до цисплатину карциномою легені Льюїс.
Результати проведених досліджень свідчать, що на всіх етапах спостереження рівень ПРА в тканині пухлини LLC-27 значно перевищував такий у пухлині LLC. Так, зокрема, на 15 добу рівень ПРА в тканині пухлини LLC-27 в 61,8 рази перевищував такий у тканині пухлини LLC (р<0,001). Протягом подальших періодів спостереження за пухлинним ростом відмічали значно менше, але все ще достатньо суттєве підвищення ПРА в резистентній карциномі легені Льюїс: на 20 добу рівень ПРА в резистентній пухлині перевищував такий у вихідній у 8,6 разів (р<0,001), а на 25 добу – у 4,2 рази (р<0,001). Цілком очевидно, що такі зміни ПРА можна розглядати як одну з причин підвищення інтенсивності метастазування пухлини LLС-27, оскільки посилення протеолізу обумовлює підвищення інвазивних властивостей злоякісних клітин, а також їх міграційну здатність. В той же час, вміст б1 -ІП в тканині пухлин LLС-27 був значно нижчим (на 49,5%) у порівнянні з таким у тканині пухлин LLC (р<0,001).
Співставлення рівнів ПРА і б1 -ІП в тканині пухлини і плазмі крові на окремих етапах пухлинного росту, на нашу думку, може бути достатньо інформативним для розуміння ролі системи протеолізу в пухлинній прогресії. Така думка виглядає переконливою завдяки співставленню рівня ПРА і вмісту б1 -ІП на 25 добу після перещеплення пухлин (період масової появи метастазів у легенях тварин). Показово, що саме в цей період у тварин з вихідною карциномою легені Льюїс спостерігається підвищення рівнів ПРА і б1 -ІП у тканині пухлини, і навпаки, зниження рівнів ПРА та б1 -ІП у плазмі крові. Що стосується змін ПРА і рівня б1 -ІП у тварин з резистентними пухлинами, то тут і в тканині пухлини, і в плазмі крові, має місце суттєве наростання ПРА і рівня б1 -ІП.
Таким чином, порівняння динаміки змін показників системи протеолізу в організмі мишей з вихідною і резистентною до цисплатину карциномою легені Льюїс свідчить, що і в тканині пухлини LLC-27, і в плазмі крові мишей з відповідною пухлиною, рівні ПРА є значно вищими порівняно з такими при рості вихідної пухлини LLC. Таке наростання ПРА в пухлинах LLC-27 призводить до зміщення протеїназно-інгібіторного балансу в бік посилення протеолізу та дефіциту основних інгібіторів протеїназ, що, в свою чергу, обумовлює підвищення інтенсивності метастазування даних пухлин.
В підтримку цього твердження свідчить також величина співвідношення рівнів ПРА/б1 -ІП у пухлинній тканині (табл. 6).
Відповідно, можна констатувати, що розвиток резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується зміщенням протеїназно-інгібіторного балансу в тканині пухлини у бік підвищення ПРА. Як було зазначено вище, аналогічні зміни спостерігаються і в плазмі крові тварин. Тому можна припустити, що значні відмінності протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові тварин з пухлинами LLC та LLC-27 обумовлені порушенням рівноваги між протеїназами та їх інгібіторами безпосередньо в тканині пухлини.
Кореляційні залежності між зміною рівнів ПРА, б1
-ІП і б2
М та кінетикою росту експериментальних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину. Аналіз кореляційних зв’язків між пухлинним процесом (динаміка змін об’єму пухлини) та динамікою змін показників системи протеолізу показав відсутність кореляційних залежностей між об’ємом пухлини та ПРА чи рівнями б1
-ІП і б2
М в плазмі крові щурів з вихідною карциномою Герена. Натомість, в плазмі крові щурів з резистентною до цисплатину карциномою Герена виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом пухлини та ПРА (rho = 0,7; p = 0,000001), між об’ємом пухлини і рівнем б1
-ІП (r = 0,67; p = 0,000002). Пряма кореляційна залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,42; p = 0,05) і б1
-ІП
(rho = 0,65; p = 0,001) в плазмі крові виявлена також при рості карциноми легені Льюїс при розвитку резистентності до цисплатину. В пухлинній тканині також встановлено кореляційний зв’язок між об’ємом резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс та рівнями ПРА (rho = 0,5; p = 0,03) і б1-ІП (rho = 0,76; p = 0,0001).
ВИСНОВКИ
На експериментальних моделях карциноми Герена та карциноми легені Льюїс встановлено, що формування резистентності пухлин до цисплатину асоціюється зі змінами кінетики їх росту та супроводжується порушенням протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині.
1. Виявлено, що для резистентної до цисплатину карциноми Герена характерним є пролонгація латентного періоду росту пухлини (в 3,3 рази) та підвищення швидкості її росту в експоненційній фазі (в 2,0 рази) порівняно з вихідною пухлиною.
2. Встановлено, що в експоненційній фазі росту резистентної до цисплатину карциноми Герена в плазмі крові щурів зростають рівні ПРА (в 2,4 рази) і б1 -ІП (на 28,5%) та дещо знижується (на 18,0%) рівень б2 М порівняно з такими у тварин з вихідною пухлиною.
3. Встановлено, що кінетика росту та інтенсивність метастазування резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс визначається ступенем її резистентності: для пухлин з середнім і високим ступенем резистентності (LLC-19 та LLC-27) характерним є пролонгація латентного періоду росту пухлини (в 2,0 рази), підвищення швидкості росту в експоненційній фазі (в 3,4 і 3,7 рази, відповідно) та підвищення інтенсивності метастазування (LLC-27). Для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) такі зміни не є характерними.
4. Встановлено, що в експоненційній фазі росту резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс зміна рівнів ПРА в плазмі крові визначається ступенем резистентності: для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) характерним є незначне підвищення ПРА (в 1,4 рази), для пухлин з середнім (LLC-19) та високим (LLC-27) ступенем резистентності – значне підвищення ПРА (в 2,1 та 4,1 рази, відповідно). Розвиток резистентності пухлини до цитостатику супроводжується підвищенням рівня б1 -ІП (на 58,5% для пухлини LLC-27) в експоненційній фазі її росту та зниженням рівня б2 М в латентний період росту (на 27,2% для пухлини LLC-27).
5. Показано, що при рості резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс (LLC-27) в пухлинній тканині значно підвищується рівень ПРА (в 4,2 – 61,8 рази) у порівнянні з таким у вихідній пухлині, а вміст б1
-ІП, навпаки, знижується (на
8-09-2015, 20:14