Н АЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ
ГІЛЬЧУК Юлія Миколаївна
УДК 577.21 : 577.213.3 : 577.215
577.217 : 577.218
ЕФЕКТИ, ОБУМОВЛЕНІ ВВЕДЕННЯМ У КЛІТИНИ ССАВЦІВ ТРАНСГЕНА АПОЛІПОПРОТЕЇНУ А-1 ЛЮДИНИ
03.00.22 - молекулярна генетика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ − 2008
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).
Науковий керівник:
доктор біологічних наук, професор,
член-кореспондент НАН України, академік АМН України
Кордюм Віталій Арнольдович,
Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,завідувач відділу регуляторних механізмів клітини.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Строковська Людмила Іванівна ,
Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,провідний науковий співробітник відділу біохімічної генетики;
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Літошенко Олександр Якович ,
Інститут геронтології АМН України, керівник лабораторії молекулярної та клітинної біології.
Захист дисертації відбудеться «24 » червня 2008 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м.Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.
Автореферат розіслано « 24 » травня 2008 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук О.В. Підпала
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Останні роки інтенсивно розвиваються дослідження, які спрямовані на корекцію певних генетичних дефектів введенням цільових генів у клітини реципієнта – генна терапія (ГТ) (Vermaetal., 2005). ГТ, як напрямок, сформувалася на перетині молекулярної генетики та медицини і спочатку була зосереджена на лікуванні спадкових моногенних захворювань, таких, як дефіцит аденозиндезамінази, муковісцидоз, гемофілія, дефіцит α-1 антитрипсину та інших (Patiletal., 2005). На сьогодні генно-терапевтичні дослідження поширились на полігенні та інфекційні захворювання; більше 60 % клінічних випробувань ГТ стосуються терапії злоякісних пухлин, велика кількість зусиль спрямована на лікування синдрому набутого імунодефіциту (Edelsteinetal., 2007). Для медичного використання схвалено перший препарат «Gendicine» (SiBiono Genetech, Китай) (Pangetal., 2005) для лікування різних форм раку.
Прикладом полігенного захворювання, для якого інтенсивно розробляють схеми генно-терапевтичної корекції на стадії доклінічних досліджень, є атеросклероз. Атеросклероз − одне із найпоширеніших захворювань у світі, проявами якого є звуження просвіту судин внаслідок порушення метаболізму ліпідів та, як наслідок, обмеження кровообігу до життєво важливих органів (Оганов и соавт., 2002). Першим кандидатом для ГТ атеросклерозу людини є ген основного білка ліпопротеїдів високої густини (ЛПВГ) − аполіпопротеїну А-1 (АРОА1) (Eckardsteinetal., 2001).
Основними проблемами як для підходів генно-терапевтичної корекції атеросклерозу, так і загалом для ГТ, є необхідність підвищення ефективності та тривалості функціонування в організмі рекомбінантних векторів, які містять терапевтичний ген, зниження їхньої токсичності, імуногенності та інших можливих негативних ефектів.
Для доставки гена АРОА1 людини in vivo вже використовували рекомбінантні вірусні вектори, комплекси плазмід із такими носіями, як модифікований полі-L-лізин, ліпосоми та інше. У роботах (Okaetal., 2007; Lebherzetal., 2007) авторами з використанням рекомбінантних аденовірусних векторів (рАд) та векторів на основі адено-асоційованого вірусу (рААВ) показано можливість забезпечення високого рівня синтезу АРОА1 людини у піддослідних мишей, який утримувався після одноразового введення вектора майже два роки. У той же час, застосування вищезазначеної системи рАд векторів для ГТ атеросклерозу на кролях продемонструвало низьку ефективність (Snoeysetal., 2007; Lievensetal., 2004). Використання рекомбінантних вірусних векторів для повторюваних введень цільового гена часто неефективне через продукування нейтралізуючих антитіл (Monhanetal., 2000; Amalfitanoetal., 2002). Крім того, безпечність використання вірусних векторів є нагальною проблемою ГТ та робить актуальним розробку саме невірусних засобів доставки цільових генів.
З іншого боку, спроби доставки цільової ДНК з геном АРОА1 людини в організм мишей з використанням таких носіїв, як галактолізований полі-L-лізин (Диже и соавт., 2001; Перевозчиков и соавт., 1997), забезпечили низький рівень експресії трансгена, хоча було показано ефективність повторних ін’єкцій препаратів. Введенням гідродинамічною ін’єкцією плазмідної ДНК вдалось досягнути у десятки разів вищого рівня експресії АРОА1 людини у піддослідних тварин (Акифьев и соавт., 2004) порівняно з зазначеними раніше носіями. Однак, зазначений метод переносу ДНК є небажаним для ГТ атеросклерозу людини, особливо, для пацієнтів із серцево-судинними захворюваннями.
Одним із найефективніших носіїв для доставки плазмідних векторів in vivo є поліетиленімін (ПЕІ) (Boussifetal., 1995). Однак, при введенні комплексів ДНК/ПЕІ внутрішньовенною ін`єкцією експресію трансгена виявляють переважно у тканинах легенів (Goulaetal., 1998). З іншого боку, описано чимало випадків ефективного переносу плазмідної ДНК у комплексі з ПЕІ при локальному введенні препарату (Goulaetal., 1998). Рівень експресії введених у клітини ссавців генів залежить від багатьох чинників, у тому числі і від сили елементів регуляції транскрипції трансгена. У випадку необхідності забезпечення високого рівня експресії трансгена перспективним вважається його розміщення у векторі під контролем сильних промоторів.
Таким чином, актуальним є вивчення експресії гена АРОА1 людини in vitro та in vivo при введенні рекомбінантної плазмідної ДНК у комплексі з ПЕІ, а також встановлення впливу на рівень експресії гена АРОА1 людини сильних гібридних промоторів.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках плану фундаментальних досліджень відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетною темою 2.2.4.3. „Вивчення на модельних об’єктах очікуваних терапевтичних ефектів, обумовлених введенням рекомбінантних молекул” (№ державної реєстрації 0103V000075, 2003-2007 pp.).
Мета та завдання дослідження: Метою даної роботи є дослідження експресії клітинами СНО-К1 гена АРОА1 людини, який знаходиться у складі рекомбінантних плазмід під регуляцією різних сильних промоторів, вивчення експресії, тривалості знаходження та локалізації трансгена АРОА1 людини в організмі піддослідних тварин.
Для досягнення цієї мети поставлено такі завдання:
1. Створити рекомбінантні плазміди, які містять ген АРОА1 людини під контролем енхансеру/промотору середньораннього гена цитомегаловірусу людини з інтроном А цього ж гена (hCMV-ІA) та енхансеру середньораннього гена цитомегаловірусу людини, промотору та першого інтрону гена β-актину курчати (CAG), для експресії в клітинах ссавців in vitro та in vivo .
2. Одержати трансфіковані клітини культури клітин яєчників китайського хом’яка (СНО-К1) при використанні невірусного методу доставки цільової плазмідної ДНК.
3. Дослідити експресію гена АРОА1 людини трансфікованими клітинами СНО-К1, одержаними для різних рекомбінантних плазмід.
4. Розробити експериментальну модель для дослідження експресії трансгена АРОА1 людини in vivo .
5. Дослідити експресію гена АРОА1 людини, локалізацію та тривалість його знаходження в організмі піддослідних тварин при використанні невірусного методу доставки цільової ДНК.
Об’єктом дослідження є експресія трансгена АРОА1 людини in vitro та in vivo , локалізація та тривалість знаходження трансгена в організмі піддослідних тварин.
Предметом дослідження є ген АРОА1 людини, що знаходиться в рекомбінантних плазмідах під контролем різних елементів регуляції транскрипції.
Методи дослідження – мікробіологічні (нарощування і культивування бактерій, трансформація бактерій), генно-інженерні (полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), зворотна транскрипція, виділення і рестрикційний аналіз плазмідної ДНК, конструювання рекомбінантних ДНК, гель-електрофорез ДНК), молекулярно-біологічні (експресія білків), імунохімічні (ферментний імуносорбентний аналіз (ELISA), Вестерн-блот аналіз), біохімічні (електрофорез білків), мікроскопія.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше сконструйовано серію рекомбінантних плазмід, які містять повнорозмірний варіант гена АРОА1 людини під транскрипційним контролем промоторів енхансеру/промотору середньораннього гена цитомегаловірусу людини (hCMV-ІЕ), hCMV-ІA та CAG. Вперше показано можливість доставки рекомбінантних плазмід із геном АРОА1 людини у клітини ссавців ін’єкцією комплексів плазмідна ДНК/ПЕІ у паренхіму печінки. Вперше досліджено характер локалізації та тривалість знаходження гена АРОА1 людини в організмі піддослідних тварин при введенні плазмідної ДНК у складі комплексів з ПЕІ.
Практичне значення одержаних результатів. Одержано стабільно трансфіковані клони культури клітин СНО-К1, що продукують білок АРОА1 людини. Оптимізовано методи імунохімічної детекції АРОА1 людини у плазмі крові трансфікованих тварин. Результати дослідження можуть бути використані при розробці підходів до генно-терапевтичної корекції атеросклерозу, заснованої на використанні невірусної системи доставки цільової ДНК.
Особистий внесок здобувача. Результати, викладені у дисертації, отримано автором особисто або за безпосередньої участі у виконанні експериментів. Зокрема, автором самостійно створено рекомбінантні плазміди, оптимізовано умови детекції наявності гена АРОА1 людини в трансфікованих клітинах ссавців, оптимізовано методи імунохімічної детекції АРОА1 людини in vitro та in vivo . Виділення та очищення плазмідної ДНК, виділення тотальної хромосомальної ДНК з клітин ссавців, ПЛР та імунохімічне дослідження експресії гена АРОА1 людини виконані безпосередньо здобувачем. Роботи із культивування культури клітин СНО-К1, одержання транзиторно експресуючих та стабільно трансфікованих клітин СНО-К1, проводились спільно з м.н.с. Т. А. Рубан та н.с. О. М. Сухорадою. Розрахунок схем конструювання рекомбінантних плазмід та розрахунок праймерів було проведено спільно із м.н.с. Д. М. Іродовим. Роботи, пов’язані із піддослідними тваринами проводили у співробітництві з Інститутом геронтології АМН України. Розробка програми вирішення поставлених завдань, аналіз і обговорення одержаних результатів досліджень проведені спільно з м.н.с. Д. М. Іродовим, д.мед.н. С. Н. Новіковою, м.н.с. О. К. Топоровою, а також завідувачем відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України, д.б.н., професором, чл.-кор. НАН України, академіком АМН України В. А. Кордюмом, з якими автор має спільні публікації.
Автор висловлює подяку науковому керівнику д.б.н., професору, чл.-кор. НАН України, академіку АМН України В. А. Кордюму за корисні поради та критичні зауваження, а також всім співробітникам, які сприяли її виконанню.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на вітчизняних та міжнародних конференціях, симпозіумах та з’їздах: XXX Щорічному міжнародному конгресі Європейського товариства штучних органів (Аахен, Німеччина, 2003), Конференції, присвяченій 50-річчю відкриття подвійної спіралі ДНК (Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, Україна, 2003), Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна, 2004), XXXI Щорічному міжнародному конгресі Європейського товариства штучних органів (Варшава, Польща, 2004), Конференції молодих вчених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2006» (Інститут біохімії імені О. В. Палладіна НАН України, Київ, Україна, 2006), ХІV Щорічному міжнародному конгресі європейського товариства генної терапії (Афіни, Греція, 2006), а також на наукових семінарах відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових журналах та тези 6 доповідей на конференціях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, які представлені у 5-ти розділах, аналізу та узагальнення результатів, списку використаних джерел (328 найменувань). Роботу викладено на 150 сторінках машинописного тексту та проілюстровано 35 рисунками і 4 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали і методи дослідження. В роботі використано штами Escherichia coli (E . coli ) DH10B, SureII. Дослідження проводили на культурах клітин СНО-К1 і СПЕВ, щурах лінії Вістар та кролях породи Шиншила.
Для конструювання векторів експресії використовували плазміди pTRhCMV-IEapo (Топорова і співав., 2004), pBacMam-1 «Novagen» (США), pTR-GT60 (Кордюм і співав., 2003), pTRUFneoR- та pTRUF, які були люб`язно надані С. Золотухіним(Gene Therapy Center Vector Core Lab, США), pBluSKM («Fermentas», Литва), pTR-EGFP (Кордюм і співав., 2004).
Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення плазмідної ДНК, електрофорез ДНК в агарозному гелі, елюцію фрагментів ДНК, гідроліз ДНК рестриктазами, лігування ДНК, ПЛР) виконували згідно зі стандартними методами (Sambrook etal., 1989). Тотальну ДНК клітин виділяли за допомогою набору реактивів «Genomic DNA Purification kit» («Fermentas»). У процедурах молекулярного клонування застосовували ферменти виробництва «Fermentas». Тотальну ДНК/РНК з клітин печінки та крові тварин виділяли набором реактивів Рибо-золь А («Амплісенс», Російська Федерація). ДНК в пробах гідролізували за допомогою дезоксирибонуклеази 1 («Sigma»). Синтез кДНК проводили з використанням набору реактивів «Реверта L-100» («Амплісенс»).
Трансфекцію клітин ссавців in vitro та in vivo здійснювали за допомогою розгалуженого ПEI (25 кДа, «Aldrich» (США)). Препарат ДНК/ПЕІ готували у масовому еквіваленті 1:2, додаючи при перемішуванні розчин ПЕІ до розчину плазмідної ДНК.
При трансфекції до 5∙105 клітин СНО-К1 вносили 5 мкг препарату плазмідної ДНК/ПЕІ. Відбір стабільно трансфікованих клітин СНО-К1 проводили на середовищі F10, що містить 20 % ембріональної телячої сироватки та 1 мг/мл антибіотика G418. Аналіз наявності білка АРОА1 у культуральному середовищі трансфікованих клітин СНО-К1 здійснювали методами ELISA, дот-блот та Вестерн-блот аналізу з використанням моноклональних антитіл MGHLaa («ИМТЕК», Російська Федерація).
Препарат ДНК/ПЕІ вводили ін`єкцією в паренхіму печінки піддослідних тварин: по 100 мкг та 240 мкг ДНК на тварину − щурам та кролям, відповідно. Введення препарату тваринам проводили при ультразвуковому дослідженні або при операції. Всі процедури проводили з використанням анестезуючих препаратів, згідно загальноприйнятих міжнародних правил поводження з тваринами. Аналіз наявності АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів здійснювали Вестерн-блот аналізом із використанням моноклональних антитіл 3F10 («ICN»,США). Кролям, які утримувались на холестериновій дієті щодня орально вводили 1,5 % розчин холестерину у рослинній олії з розрахунку 1 мг холестерину / кг ваги тварини. Визначення концентрації тотального холестерину у плазмі крові тварин проводили з використанням набору реактивів фірми «Sentinel Diagnostics» (Італія) та «Elitech Diagnostics» (Франція). Препарати тканин органів кролів готували згідно загальноприйнятих методів (Лили, 1969). Зрізи тканин забарвлювали розчинами гематоксиліну та еозину за Ван-Гізоном.
Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програми Statistica 6.0.
Результати досліджень та обговорення. Для корекції дефіциту певного білка в організмі необхідно підтримувати таку концентрацію цільового білка, що відповідає його фізіологічній нормі або має терапевтичний ефект. При цьому для кожного білкового продукту ця концентрація буде індивідуальною. Фізіологічна концентрація АРОА1 у плазмі крові людини становить – 1,47±0,17 мг/мл (Bekaertetal., 1993). Таким чином, для корекції атеросклерозу необхідне досягнення високого рівня експресії трансгена АРОА1 людини.
Конструювання рекомбінантних плазмід для експресії АРОА1 людини in vitro та in vivo. На сьогодні створено велику кількість гібридних промоторів, які мають вищу швидкість ініціації транскрипції порівняно з промотором hCMV-IE. Продемонстровано, що введення до складу вектора експресії деяких геномних елементів, зокрема, інтронів та 3`- і 5`- послідовностей, які не транслюються, підвищує рівень експресії трансгена як in vitro (Palmiteretal., 1991) так і в трансгенних тваринах (Ebertetal., 1998). Механізм впливу таких послідовностей на рівень експресії трансгенів не в усіх випадках відомий, але його пов`язують з такими явищами, як підвищення частоти ініціації транскрипції, стабільності і ефективності транспорту і/або підвищення ефективності формування 3`-кінця мРНК при її дозріванні (Kawamotoetal., 1998). Тому, одним із перспективних шляхів підвищення рівня експресії трансгена є використання послідовностей, що містять не лише промотор, а також і перший інтрон гена, транскрипцію якого регулює даний промотор чи промотор іншого гена, у випадку гібридних послідовностей. В експериментах із використанням маркерних генів показано, що послідовності CAG та hCMV-ІA забезпечують вищий рівень синтезу трансгена in vitro порівняно з hCMV-IE (Niwaetal., 1991; Chapmanetal., 1991; Xiaetal., 2006). З використанням цих промоторів одержано трансгенні тварини (Okabeetal., 1997; Ishiietal., 1997) та здійснено експресію трансгенів in vivo (Xuetal., 2001). Враховуючи дані літератури, використання цих елементів регуляції транскрипції видається перспективним для підвищення рівня експресії трансгена АРОА1 людини в клітинах ссавців.
Як трансген у роботі використано повнорозмірний геномний варіант гена АРОА1 людини (рис. 1).
Для оцінки впливу вищезазначених гібридних послідовностей на експресію гена АРОА1 людини крім вихідної плазміди pTRhCMV-IEapo , яку створено співробітниками нашого відділу раніше (Топорова і співав., 2004), було сконструйовано рекомбінантні плазміди pTRC AG apo та pTRhCMV-I A apo . Для конструювання вектора експресії pTRC AG apo в плазміді pTRhCMV-IEapo промоторhCMV-IE було замінено на CAG. Для одержання цільової плазміди pTRhCMV-I A apo в плазміді pTRhCMV-IEapo промотор hCMV-IE було замінено на hCMV-ІA.
Для вивчення рівня експресії гена АРОА1 людини стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1, до складу плазмід pTRhCMV-IEapo, pTRC AG apo та pTRhCMV-I A apo було клоновано ген неоміцинфосфотрансферази (neoR ), який дозволяє відбирати клітини на селективному середовищі з антибіотиком G418 та отримано плазміди pTRhCMV-IEapo neoR , pTRC AG apo neoR , pTRhCMV-I A apo neoR .
Транзиторна експресія гена АРОА1 клітинами СНО-К1. Нами було досліджено експресію АРОА1 людини під контролем різних елементів регуляції транскрипції транзиторно та стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1.
Перевагами використання транзиторної системи експресії є незалежність рівня експресії трансгена від «ефекту положення», тобто впливу регуляторних хромосомних елементів, оскільки експресія трансгена відбувається з неінтегрованих послідовностей. Дослідження рівня транзиторної експресії трансгена трансфікованими клітинами СНО-К1 проводили після трансфекції клітин препаратами ДНК/ПЕІ з рекомбінантними плазмідами: pTRhCMV-IEapo , pTRC AG apo та pTRhCMV-I A apo , що містять у своєму складі ген АРОА1 людини.
Наявність плазмідної ДНК у трансфікованих клітинах визначали на 6-ту добу після трансфекції за допомогою методу «nested» ПЛР. Для проведення ПЛР використовували розраховані нами за допомогою програми Vector NTI Advance 10 пари праймерів Ap-r/Ap-f та Ap(n)-f /Ap(n)-r (Гільчук та співав., 2006).
Синтезований АРОА1 людини секретується клітинами і тому його визначення проводили безпосередньо у культуральному середовищі. Для цього використовували таку схему: через добу після трансфекції змінювали середовище на безсироваткове, на наступну добу середовище повністю відбирали та зберігали при -20 0 С, а до клітин додавали свіже середовище без сироватки. Таким чином були відібрані проби культурального середовища на 2-5 добу після проведення трансфекції клітин.
На 2-гу добу після трансфекції Вестерн-блот аналізом було показано наявність АРОА1 людини в культуральному середовищі клітин трансфікованих рекомбінантними плазмідами pTRhCMV-IEapo та pTRhCMV-I A apo (рис. 2).
Встановлено, що рівень синтезу АРОА1 клітинами, трансфікованими плазмідою pTRhCMV-I
A
apo
, складає ~ 3 нг білка/мл середовища за добу, в той час, як при трансфекції клітин плазмідою pTRhCMV-IEapo
– ~ 0,4 нг/мл. Рівень експресії трансгена, що контролюється гібридною послідовністю
8-09-2015, 22:03