НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

КІТЮРІЙ ЯРОСЛАВОВИЧ

УДК 577.112.7: 576.32/36

АНТИТІЛА МОЛОКА І СИРОВАТКИ КРОВІ ЛЮДИНИ: ХАРАКТЕРИСТИКА КАТАЛІТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ТА ВПЛИВ НА РІСТ І ВИЖИВАННЯ КЛІТИН

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертаціїна здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Львів – 2008

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті біології клітини НАН України та у Новосибірському інституті біоорганічної хімії СВ РАН.

Науковий консультант: член-кореспондент НАН України

доктор біологічних наук, професор,

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції

проліферації клітин та апоптозу.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

Сибірна Наталія Олександрівна,

Львівський національний університет

імені Івана Франка,

завідувач кафедри біохімії;

доктор біологічних наук,

Скок Марина Володимирівна,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

головний науковий співробітник

відділу молекулярної мунології;

доктор біологічних наук,

Заставна Данута Володимирівна,

Інститут спадкової патологіїАМН України,

завідувач відділу діагностики спадкової патології.

Захист відбудеться «11» червня 2008 р. о «1400» годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології клітини НАН України (79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розісланий «8» травня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук В.М. Убийвовк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Імунна система ссавців не тільки забезпечує захист організму від шкідливих чинників оточуючого середовища, але й бере участь у регуляції багатьох біологічно важливих функцій, які підтримують гомеостаз організму. Гуморальна імунна система функціонує через продукцію мільйонів варіантів молекул антитіл (АТ), направлених як проти чужорідних антигенів, так і проти антигенів власного організму (аутологічних антигенів). Аутологічні антитіла (ауто-АТ) із спорідненістю до різноманітних біомолекул (білків, нуклеїнових кислот, полісахаридів, ліпідів) було виявлено як у хворих на аутоімунні захворювання, так і в клінічно здорових людей. В останніх описано дві різновидності ауто-АТ: поліреактивні ауто-АТ (Avrameasetal., 1995) та анти-ідіотипові ауто-АТ (Jerneetal., 1985). Поліреактивні ауто-АТ (полі-АТ) сироватки крові людини, головним чином, представлені IgMабо імуноглобулінами інших ізотипів, що секретуються особливою популяцією В-лімфоцитів, на поверхні яких присутній білок CD5 (CD5+-B-лімфоцити). Полі-АТ є продуктами недиференційованих генів імуноглобулінів і характеризуються низькою афінністю та поліспецифічністю (спорідненістю до структурно-відмінних антигенів). Поліспецифічність цих ауто-АТ визначає їх подвійну фізіологічну роль в організмі ссавців. З одного боку, полі-АТ забезпечують первинну імунну відповідь організму на дію чужорідних антигенів, а з іншого боку, через спорідненість до аутологічних антигенів ці антитіла можуть бути задіяні у регуляцію гомеостазу.

Другою різновидністю ауто-АТ, які продукуються в нормі, є антиідіотипові АТ (аі-АТ). В основі продукції аі-АТ лежить здатність імунної системи ссавців сприймати варіабельні ділянки власних антитіл (ідіотипи) як чужорідні антигени і продукувати вторинні антитіла (аі-АТ), специфічні до цих фрагментів антитіл. Через рецептор–опосередковану взаємодію із імунокомпетентними клітинами аі-АТ беруть участь у клональній селекції лімфоцитів в організмі ссавців. Згідно з цим механізмом, співвідношення між первинними антитілами і аі-АТ регулює імунну відповідь організму на чужорідні антигени. Характерною ознакою аі-АТ є їхня висока специфічність до антигенних детермінант антитіл.

На відміну від ауто-АТ клінічно здорових людей, ауто-АТ, виявлені в організмі хворих на аутоімунні захворювання, володіють високою специфічністю і високою спорідненістю до аутоантигенів. При цьому антигенна специфічність ауто-АТ безпосередньо пов’язана з типом захворювання та особливістю його перебігу. Через взаємодію із аутоантигенами ауто-АТ, безпосередньо або опосередковано, можуть брати участь у розвитку аутоімунних захворювань, що дозволяє вважати їх молекулярними маркерами, придатними для діагностики аутоімунних захворювань та прогнозування особливостей їхнього перебігу у пацієнтів.

Імунний статус організму вагітних жінок і породіль має ряд суттєвих відмінностей від нормального стану. З одного боку, це пов’язано зі змінами в організмі вагітної жінки, скерованими на забезпечення імунної толерантності щодо клітин організму плоду, а з другого боку, це пов’язано із особливістю функціонування гуморального імунітету у породіль, який направлений на забезпечення імунного захисту новонароджених та на розвиток їхньої власної імунної системи.

Відомо, що зміни у гормональному та імунному статусі жінок, пов’язані з вагітністю, пологами та лактацією, можуть призводити до розвитку аутоімунних захворювань (Сerveraetal., 2002; Molokhiaetal., 2008). Внаслідок порушення аутоімунної толерантності в організмі жінки з’являються високоспецифічні ауто-АТ та абзими, характерні для хворих на аутоімунні захворювання (Bunevaetal., 2003).

Таким чином, дослідження антигенної специфічності та функціональної активності ауто-АТ, які продукуються в нормі, при аутоімунних захворюваннях, а також при вагітності і лактації, є актуальними, оскільки вони дозволяють виявити молекулярні механізми, залучені у розвиток аутоімунних процесів в організмі людини.

Компоненти молозива та молока жінок діють не лише як фактори трофічного забезпечення дитини, але й як чинники регуляції розвитку дитячого організму. Ключову роль у такій регуляції виконують білки молока, які можуть впливати на проліферацію, диференціацію та апоптоз клітин різних типів. Цитокіни, зокрема інтерферон і деякі фактори росту, у невеликій кількості присутні у молоці і сироватці крові (Канышкова та ін., 2003). Інші білки, які задіяні у регуляції клітинної активності, зустрічаються, переважно, у жіночому молоці. До цих білків, наприклад, належить альфа-лактальбумін, олігомерні форми якого здатні індукувати апоптоз пухлинних клітин у присутності іонів кальцію (Hakanssonetal., 1995), та лактоферин, який, залежно від наявності іонів заліза, здатний регулювати проліферацію, диференціацію чи апоптоз різного типу клітин (Legrandetal., 2008).

Оскільки лактація є частиною репродуктивного циклу жінки, функціональна активність імуноглобулінів молозива та молока може відображати індивідуальні особливості стану її гуморального імунітету. У жіночому молоці виявлено полі-АТ (Vassilevetal., 1996) та високоспецифічні ауто-АТ, характерні для хворих на аутоімунні захворювання (Brenneretal., 1992; Askanaseetal., 2002). Останні можуть бути задіяні у розвитку аутоімунних процесів у дитини.

Важливою функціональною особливістю ауто-АТ, виявлених в нормі та при патології, є їхня здатність каталізувати хімічні реакції. Каталітично активні ауто-АТ отримали назву абзимів. Абзими, подібно до ауто-АТ, виявлених в організмі ссавців, можна розділити щонайменше на два типи – абзими, які є продуктами недиференційованих генів імуноглобулінів (Pauletal., 2005), та абзими, які утворюються внаслідок молекулярної мімікрії антигенів. Останні відносяться до аі-АТ, які продукуються за умов, коли антигенними детермінантами виступають поліпептидні ділянки, які формують каталітичні центри ензимів (Gabibovetal., 2006). Функції абзимів в організмі людини вивчені недостатньо. Аналіз літературних даних вказує на те, що перший тип абзимів може брати участь у знешкодженні вірусних та бактеріальних антигенів в організмі клінічно здорових людей, а другий тип абзимів може бути задіяний у розвитку аутоімунних захворювань.

У молозиві та молоці клінічно здорових породіль присутні обидва типи абзимів. Перший тип (абзими із фосфотрансферазною активністю) було виявлено тільки у молоці жінок (Kitetal., 1991, 1995; Gorbunovetal., 2000, 2005; Karataevaetal., 2005), тоді як другий тип (абзими із гідролізуючою активністю) присутні як у молоці клінічно здорових породіль, так і у сироватці крові хворих на аутоімунні захворювання (Nevinskyetal., 2002, 2003). Оскільки функція цих абзимів в організмі залишається не з’ясованою, дослідження їх біологічної активності є важливим для розуміння особливостей функціонування гуморального імунітету у жінок під час вагітності і лактації.

Усе вищесказане свідчить про актуальність дослідження антигенної специфічності і каталітичної активності антитіл, а також вивчення впливу цих антитіл на ріст і виживання клітин.

Зв’язок роботи з науковими програмами і планами. Роботу було розпочато відповідно до планів науково-дослідних робіт лабораторії радіохімії Новосибірського інституту біоорганічної хімії Сибірського відділення Російської Академії Наук у межах напрямку “Биокатализ, структура и функция гена” упродовж 1994-1999 рр. Пізніше її було продовжено у відділі регуляції проліферації клітин та апоптозу Інституту біології клітини Національної Академії Наук України в межах теми «Дослідження процесів, що відбуваються під час апоптозу, індукованого антинеопластичними препаратами з різним механізмом дії» упродовж 2006-2008 років (номер державної реєстрації № 0106U002599). Частково роботу було також підтримано грантом Російського Фонду Фундаментальних Досліджень за темою: “Роль фосфорилирования лактальбумина человеческого молока в образовании его мультимерных форм, обладающих способностью индуцировать апоптоз раковых, эмбриональных и лимфоидных клеток”, проект 97-04-49931 (1997-1999 рр) та грантом підтримки спільних проектів вчених Національної Академії наук України і Сибірського відділення Російської Академії наук за темою “Біологічно активні сполуки молока і їх фізіологічні функції”, проект № 9 (2006-2008 рр), які були надані здобувачу.

Мета і завдання дослідженя. Метою роботи було дослідити взаємозв’язок між антигенною специфічністю та особливостями каталітичної активності ауто-АТ клінічно здорових людей та хворих на аутоімунні захворювання, а також вивчити їхній вплив на ріст і виживання клітин ссавців invitro.

Для досягнення цієї мети було проведено дослідження у 3-х основних напрямках:

Порівняти антигенну специфічність та каталітичну активність ауто-АТ, виділених із сироватки крові здорових донорів та хворих на системний червоний вовчак і розсіяний склероз, із ауто-АТ, виділеними із молозива та молока клінічно здорових жінок.

Проаналізувати спорідненість синтетичних та природних чинників, здатних утворювати комплекси із ауто-АТ сироватки крові і молока людини, та дослідити їхній вплив на каталітичну активність абзимів.

Отримати очищені препарати антитіл із різною антигенною специфічністю із сироватки крові та молока людини і дослідити їхній вплив на ріст та виживання клітин invitro.

У межах цих напрямків дослідження у роботі вирішували наступні завдання:

Дослідити вплив препаратів імуноглобулінів, отриманих із сироватки крові здорових донорів, хворих на розсіяний склероз і молозива породіль, на ріст і виживання клітин invitro.

Розробити методи очистки ауто-АТ та абзимів із сироватки крові та молока людини.

Визначити антиген-зв’язувальні, каталітичні та регуляторні центри ауто-АТ та абзимів із використанням афінної модифікації молекул АТ реакційно здатними аналогами нуклеотидів та олігонуклеотидів.

Вивчити закономірності регуляції каталітичної активності абзимів сироватки крові та молока людини:

а) за допомогою різних речовин біологічного походження (нуклеотиди, ДНК, РНК, полісахариди, конкурентні інгібітори протеїназ);

б) за допомогою синтетичних речовин (модифіковані аналоги нуклеотидів та олігонуклеотидів, хімічні модифікатори амінокислотних залишків білків).

Встановити закономірності впливу ауто-АТ та абзимів, виділених із сироватки крові клінічно здорових людей та молока породіль, на ріст та виживання ракових і трансформованих клітин invitro.

Об’єкт дослідження – аутологічні антитіла сироватки крові і молока людини.

Предмет дослідження – виявлення і очистка аутологічних антитіл різної антигенної специфічності із сироватки крові і молока людини та дослідження їхньої функціональної активності, зокрема, впливу на ріст і виживання клітин.

Методи дослідження. У роботі використано методи препаративної та аналітичної біохімії білків і нуклеїнових кислот (осадження білків сульфатом амонію, діаліз, іонообмінна хроматографія, електрофорез у поліакриламідному та агарозному гелі, ізоелектричне фокусування білків, високоефективна рідинна хроматографія). Проведено комп’ютерний аналіз рівня гомології між первинними структурами протеїнкіназ та білків надродини імуноглобулінів. Застосовано методи дослідження цитотоксичної дії чинників на клітини ссавців invitro (визначення кількості живих і мертвих клітин у культурі, виявлення апоптозу електрофоретичним аналізом нуклеосомної фрагментації ДНК та електрофорезом індивідуальних клітин у гелі агарози (метод ДНК-комет)). Крім того, застосовано імунологічні методи (імуноензимний і цитохімічний аналіз антигенної специфічності антитіл молока людини), а також методи статистичної обробки результатів дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі розробленої схеми очистки антитіл із заданою антигенною специфічністю із сироватки крові хворих на аутоімунні захворювання (системний червоний вовчак (СЧВ), розсіяний склероз) та молока клінічно здорових жінок уперше очищено каталітично активні антитіла (абзими) класу IgG та IgAзі спорідненістю до АТР (анти-АТР АТ), дволанцюгової ДНК (анти-ДНК АТ) і гістону Н1 (антигістонові АТ). Встановлено, що анти-АТР АТ сироватки крові хворих на системний червоний вовчак і молока клінічно здорових жінок володіють фосфотрансферазною (протеїнкіназною і ліпідкіназною) активністю, анти-ДНК АТ молока людини володіють РНК-азною, ДНК-азною та протеїнкіназною активністю, тоді як антигістоновим АТ сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молозива породіль властива протеазна активність щодо деяких лужних білків.

Вперше виявлено чинники, які впливають на каталітичну активність абзимів. Показано, що дезоксирибоолігонуклеотиди стимулюють протеїнкіназну активність sIgA-абзимів молока людини, тоді як нуклеотидтрифосфати інгібують їхню нуклеазну активність.

Виявлено, що імуноглобуліни сироватки крові та молока клінічно здорових людей індукують загибель клітин лейкемії шляхом апоптозу. Разом із тим, у сироватці крові окремих хворих на розсіяний склероз присутні імуноглобуліни, здатні індукувати проліферацію лейкемічних клітин людини.

Теоретичне значення одержаних результатів. Вперше обґрунтовано механізм промітогенної дії IgG-абзимів на клітини ссавців, а також механізм каталізу антитілами фосфотрансферазної реакції. Запропоновано модель внутрішньоклітинної нейтралізації вірусів у епітеліальних клітинах за участю sIgA-абзимів.

Практичне значення отриманих результатів. У роботі проведено аналіз антигенної специфічності, каталітичної та цитотоксичної активності імуноглобулінів, отриманих із молозива клінічно здорових породіль. На основі отриманих результатів зроблено висновок про те, що функціональні властивості імуноглобулінів молозива залежать від індивідуальних особливостей стану гуморального імунітету у породіль. Ці властивості важливо врахувати під час комплексного визначення показників ранніх аутоімунних порушень у жінок, пов’язаних із їхньою вагітністю та пологами.

Особистий внесок здобувача. Авторові належить формулювання теми й мети досліджень, вибір об’єктів, а також вибір і розробка методів дослідження, постановка експериментів. Експериментальні визначення, обробка даних, їхній теоретичний аналіз виконані автором самостійно, або за його безпосередньою участю. Автором проведено аналіз даних літератури за темою роботи, сформульовано та обґрунтовано висновки та узагальнення.

Науковим консультантом здійснювалося загальне керівництво проведенням досліджень та обговорення отриманих результатів у період роботи дисертанта в Інституті біології клітини НАН України.

Апробація одержаних результатів. Основні результати дисертації обговорювались на ІІ міжнародній конференції “Catalytic Antibodies and Antibody Engineering” (Шантілі, Франція, 1996); X міжнародному імунологічному конгресі (Нью-Делі, Індія, 1998); Кістоунському симпозіумі з молекулярної і клітинної біології (Брекенрідж, США, 1999); III Парнасівській конференції “Mechanismsofcellularsignaltransductionandcommunication” (Львів, 2000); Міжнародній конференції “RNAasTerapeuticandGenomicTarget” (Новосибірськ, Росія, 2001); конференції НАТО “Frontiersinautoimmunity: fundamentalaspectsandclinicalperspectives” (Кеслей, Угорщина, 2002); Установчому з’їзді українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); V Парнасівській конференції (Київ, 2005); XI Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006); ІІІ Міжнародній конференції “Фундаментальные науки – медицине” (Новосибірськ, Росія, 2007); ІІ з’їзді українського товариства клітинної біології (Київ, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 38 наукових робіт, із них 25 статей у фахових вітчизняних і міжнародних журналах, 1 огляд та тези 12 доповідей на наукових конференціях.

Зміст та обсяг роботи. Дисертація включає вступ, огляд літератури, матеріали і методи, результати власних досліджень, що складаються із 9 розділів, аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки, список використаної літератури, який нараховує 300 найменувань. Текст дисертації викладено на 290 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 118 рисунками і 5 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідженя. Отримання електрофоретично гомогенних препаратів антитіл є однією із найбільш важливих умов дослідження їхньої функціональної активності. У першу чергу, це стосується каталітично активних антитіл, які володіють аналогічною із ензимами каталітичною активністю. Виділення та очистка абзимів є досить складним завданням. Це зумовлено сукупністю факторів. Відомо, що сумарні препарати імуноглобулінів є поліклональними, складаються із різноманітних за ізотипом антитіл, які мають спорідненість до великої кількості різноманітних антигенів, серед яких є й ензими. Останні можуть знаходитися у комплексі із антитілами, що може бути причиною артефактів при дослідженні їхньої каталітичної активності. Тому на перших стадіях очистки ауто-АТ необхідно відділити антитіла від різноманітних антигенів, у першу чергу від білків. Наступним кроком повинно бути виділення фракції антитіл, яка володіє спорідненістю до антигену – потенційного субстрату каталітичної реакції.

На рис.1 наведено узагальнену схему очистки ауто-АТ із сироватки крові та молока людини, яка дозволяє отримати препарати антитіл із заданою антигенною специфічністю, збагачені каталітично активними антитілами.

На першій стадії очистки імуноглобуліни осаджували 50% сульфатом амонію. Це дозволяє відділити фракцію імуноглобулінів від основної маси білків сироватки крові чи молока. Наступна стадія включає афінну хроматографію на колонці, яка містить протеїн A - або протеїн G - агарозу (або сефарозу). Для видалення домішок колонки промивали розчинами із підвищеною концентрацією NaCl (0,3–0,5 М) у присутності неіонних детергентів (NP-40, тритон Х-100). Елюцію імуноглобулінів із колонки проводили буфером із низьким значенням рН (1 M оцтова кислота або 0,1 М гліцин-HCl, рН 2,6). Використання цих сорбентів дозволяє уже на перших стадіях очистки отримати препарати, які на 90-95% складаються із імуноглобулінів. Для подальшої очистки антитіл або їхнього розділення на субкласи (наприклад, sIgAта IgG молозива) використовували іонообмінну хроматографію або напівпрепаративну гель-фільтрацію (Невинский та ін., 2000). Препарати антитіл, очищені таким методом, є електрофоретично гомогенними (рис.1А, Б) і придатні для виділення антитіл зі спорідненістю до певних антигенів чи субстратів каталітичної реакції.

Отримані препарати імуноглобулінів у подальшому слугували для виділення моноспецифічних поліклональних антитіл із сироватки крові і молока людини афінною хроматографією на колонках, які містять сорбенти із ковалентно зв’язаними лігандами. Сорбентами слугували: АТР-сефароза, ДНК-целюлоза, гістон Н1-сефароза. Залежно від спорідненості до сорбентів, антитіла елюювали градієнтом концентрації 0–1 М NaCl (анти-АТР IgG сироватки крові хворих на системний червоний вовчак), 3,5 MMgCl2 (анти-АТР sIgA молозива породіль), 50 мМ NaOH (анти-ДНК sIgA молозива породіль), 0,1 М гліцин-HCl, рН 2,6 (антигістонові АТ субкласів IgGта sIgA сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молозива породіль).

Визначення протеїнкіназної активності. Для аналізу протеїнкіназної активності АТ і rsCD4 донором фосфату був [g-32P] ATP (5000 Ki/ммоль, “Изотоп”, Російська Федерація). Реакційне середовище містило 0,3 – 3 мкг


8-09-2015, 21:51