Спочатку нами було проведено пошук амінокислотних послідовностей СD4 із найвищим рівнем гомології щодо відомих протеїнкіназ. Для такого аналізу використано банк генів протеїнкіназ KinBase та програму порівняння KinomBlastServer (www. kinase. com). Встановлено, що найвищим рівнем гомології до протеїнкіназ володіє послідовність довжиною 100 амінокислотних залишків, яка входить до структури двох імуноглобулінових доменів позаклітинної ділянки рецептора СD4. Отримані дані дозволили припустити, що позаклітинний фрагмент СD4 володіє протеїнкіназною активністю. Для перевірки цієї гіпотези було використано рекомбінантний розчинний рецептор rsCD4 (“Genentech”, США), послідовність якого гомологічна позаклітинному фрагменту СD4 (рис.23А). Аналіз протеїнкіназної активності rsCD4 показав (рис.23Б), що у присутності [g-32P] ATP відбувається фосфорилювання рецептора (доріжка 1). Фосфорилювання rsCD4 не відбувалося, коли білок попередньо прогрівали при 65 0С (доріжка 2) або коли до реакційної суміші додавали 3 мМ АТР (доріжка 3). Інкубація rsCD4 із [-32P] ATP також не призводила до його фосфорилювання (доріжка 4). Отримані дані вказують на те, що рецептор rsCD4 володіє протеїнкіназною активністю. Додатковим аргументом на користь цього можуть слугувати дані фосфорилювання казеїну коров’ячого молока у присутності rsCD4 та [g-32P] ATP (рис.23Б, доріжки 5, 6). Наступними дослідами було показано, що подібно до класичних протеїнкіназ, для фосфорилювання рецептора rsCD4 необхідною є наявність двовалентних катіонів. Їхній вплив на протеїнкіназну активність rsCD4 у порядку зростання виглядає наступним чином: Ca2+ > Zn2+> Mn2+> Ni2+> Mg2+ > Cu2+ >Co2+. Реакція фосфорилювання також інгібувалась діетилпірокарбонатом, що вказує на участь у каталізі залишків гістидину. Визначення амінокислотної специфічності фосфорилювання показало, що фосфорилювання казеїну за участю rsCD4 відбувається за залишками серину.
Встановлено, що інкубація rsCD4 із плазмою крові людини призводить до фосфорилювання двох білків із мол. масою 62 і 12 кДа. Це вказує на те, що у плазмі крові можуть бути присутні ендогенні субстрати протеїнкіназної активності цього рецептора.
Отже нами встановлено, що рекомбінантний аналог білка, який належить до надродини імуноглобулінів, а саме рецептора Т-гелперних клітин СD4 володіє протеїнкіназною активністю.
Біологічна роль протеїнкіназної активності рецептора СD4 залишається невідомою. Оскільки у протеїнкіназній активності задіяний позаклітинний фрагмент рецептора, за місцем локалізації ензиму в клітині СD4 можна віднести до ектопротеїнкіназ плазматичної мембрани лімфоїдних клітин. Очевидно, протеїнкіназна активність рецептора CD4 може бути направлена як на регуляцію біологічної активності Т-гелперних лімфоцитів, так і на регуляцію взаємодії білків плазми крові і лімфи із Т-лімфоцитами і лімфоїдними клітини, які також продукують цей рецептор. Той факт, що присутність АТР є необхідною умовою активації Т-лімфоцитів (Filippinietal., 1990; Redegeltetal., 1991), може також слугувати на користь цього припущення.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі вперше проведено комплексне дослідження з метою виявлення, очистки та функціональної характеристики аутологічних антитіл сироватки крові та молока людини у нормі та при деяких аутоімунних захворюваннях. Отримані дані свідчать про те, що у сироватці крові і молоці людини присутні аутологічні антитіла із антигенною специфічністю щодо клітин ссавців, здатні каталізувати деякі біохімічні реакції. Встановлено, що ці антитіла впливають на ріст і виживання клітин invitro, причому деякі з них можуть зв’язуватися з клітинами та інтерналізуватися ними. У молозиві деяких клінічно здорових жінок-породіль присутні аутоантитіла, які за антигенною специфічністю, каталітичною активністю і за впливом на клітини ссавців подібні до аутоантитіл сироватки крові хворих на розсіяний склероз і системний червоний вовчак. Це робить їх привабливими для подальшого дослідження з огляду на можливість їхнього використання як діагностичних та прогностичних маркерів аутоімунних порушень у породіль.
1. Імуноглобуліни сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молозива здорових жінок-породіль здатні індукувати апоптоз T-клітин лінії Jurkatабо стимулювати проліферацію цих клітин invitro. Значну цитотоксичну активність імуноглобулінів виявлено у 36% обстежених хворих на розсіяний склероз і 44% клінічно здорових породіль, тоді як промітогенну активність антитіл виявлено у 13,6% хворих на розсіяний склероз і 8% здорових породіль.
2. У молозиві 8% обстежених жінок-породіль встановлено підвищений рівень антитіл, які володіють спорідненістю до дволанцюгової ДНК (анти-ДНК АТ), а у 48% породіль, виявлено антитіла зі спорідненістю до гістонів ссавців (анти-гістонові АТ).
3. Розроблено комплексний підхід для виділення та аналізу антигенної специфічності та каталітичної активності аутологічних антитіл сироватки крові і молока людини. Він полягає у використанні афінної та іонообмінної хроматографії, а також гель-фільтрації за умов дисоціації імунних комплексів, і дозволяє отримати високоочищені препарати аутоантитіл певної каталітичної активності.
4. Анти-ДНК sIgA молока людини володіють рибонуклеазою активністю щодо рибосомної РНК, топоізомеразною та ендонуклеазною активністю щодо надспіралізованої і лінійної форм ДНК плазміди, а також протеїнкіназною активністю щодо власних поліпептидів і казеїну молока людини. АТР і dАТР інгібують нуклеазну активність цих sIgA-абзимів, а синтетичні дезоксирибоолігонуклеотиди стимулють протеїнкіназну активність цих антитіл.
5. Анти-ДНК sIgAмолозива породіль із різною ефективністю індукують загибель імунокомпетентних клітин (лінії Namalwa, Jurkat і L1210), а також трансформованих фібробластів миші (лінія L929). За чутливістю до цитотоксичної дії цих антитіл, досліджувані лінії клітин розподіляються наступним чином: L929 > Jurkat> L1210 > Namalwa.
6. У молоці клінічно здорових жінок-породіль і сироватці крові хворих на системний червоний вовчак уперше виявлено антитіла класів sIgA і IgG, які володіють ліпідкіназною і протеїнкіназною активністю. Ліпіди співвиділяються з цими антитілами під час їхньої очистки на протеїн А-сефарозі, ДЕАЕ-фрактогелі, АТР-сефарозі і фосфорилюються у складі імунних комплексів у присутності [g-32P] ATP. Гель-фільтрація даних антитіл у буфері, який містить 5% діоксан, призводить до дисоціації імунних комплексів і стимуляції протеїнкіназної активності антитіл.
7. У молоці клінічно здорових жінок-породіль і у сироватці крові хворих на розсіяний склероз вперше виявлено анти-гістонові sIgA - і IgG-антитіла, які каталізують гідроліз гістону Н1. Анти-гістонові антитіла обох ізотипів гідролізують корові гістони із значно нижчою ефективністю, ніж лінкерний гістон Н1, і не гідролізують альбумін сироватки крові бика і лізоцим курячого яйця.
8. Анти-гістонові IgG-антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз стимулюють проліферацію Т-лімфоцитів лінії Jurkat. Приріст кількості цих клітин порівняно з контролем складав 37% при дії 70 мкг/мл антитіл упродовж 72 год. У той же час, анти-гістонові sIgA-антитіла молозива породіль не впливають на проліферацію Т-клітин лінії Jurkat.
9. Анти-гістонові IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз зв’язуються з Т-клітинами ліній Jurkat і L929, які здатні їх інтерналізувати. Взаємодія цих аутоантитіл із Т-клітинами лінії Jurkatупродовж 2 год або з клітинами лінії L929 упродовж 6 і 24 год призводить до значного їх накопичення у цитоплазмі клітин-мішеней. За таких умов анти-гістонові sIgA-антитіл молозива жінок-породіль не інтерналізуються клітинами вказаних ліній.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Кит Ю.Я. Фосфорилирование рецептора rsCD4 в присутствии клеток и плазмы крови человека / Ю.Я. Кит, В.А. Якубов, В.А. Рихтер, В.В. Власов // Доклады Академии Наук. - 1995. - Т.340, № 3. - С.412-415. (Автором визначено завдання досліджень, проведено фосфорилювання rsCD4 за участю протеїнкіназ і підготовлено статтю до друку)
2. Kit Y. Y. Phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobylin A / Y. Y. Kit, D. V. Semenov, G. A. Nevinsky // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1996. - V.36, No 3. - P.521-527. (Автором проведено виділення й аналіз протеїнкіназної активності sIgA-абзимів).
3. Кит Ю.Я. В препаратах человеческого α-лактальбумина, индуцирующих апоптоз трансформированных клеток, присутствуют рибоолигонуклеотиды / Ю.Я. Кит, Е.В. Кулигина., И.В. Романникова, Д.В. Семенов, В.А. Рихтер, В.В. Власов // Доклады Академии Наук. - 1998. - Т.360, № 3. - С.406-408. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз досліджень і підготовлено статтю до друку).
4. Кит Ю.Я. Фосфорилирование липидов, прочно связанных с иммуноглобулином А, в препаратах антител из молока человека, обладающих протеинкиназной активностью / Ю.Я. Кит, М.В. Шипицин, Д.В. Семенов, В.А. Рихтер, Г.А. Невинский // Биохимия. - 1998. - Т.63, № 6. - С.852-858. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз ліпідкіназної активності sIgA молозива породіль).
5. Yakubov L. A. The extracellular domain of CD4 receptor possesses a protein kinase activity / L. A. Yakubov, Y. Y. Kit, V. A. Richter, A. Y. Andreeva, V. N. Karamyshev, C. A. Stein, V. V. Vlassov // FEBS Lett. - 1998. - V.431, No 1. - P.45-48. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз протеїнкіназної активності rsCD4).
6. Семенов Д.В. Иммуноглобулин G молока человека гидролизует нуклеотиды / Д.В. Семенов, Т.Г. Канышкова, Ю.Я. Кит, Д.Ю. Хлиманков, А.М. Акимжанов, Д.А. Горбунов, В.Н. Бунева, Г.А. Невинский // Биохимия. - 1998. - Т.63, № 8. - С.1097-1106. (За участю автора сплановано мету досліджень і проаналізовано отримані результати).
7. Nevinsky G. A. Secretory Immunoglobulin A from human milk catalyzes milk protein рhosphorylation / G. A. Nevinsky, Y. Ya. Kit, D. V. Semenov, D. Y. Khlimankov, V. N. Buneva // Appl. Biochem. Biotechnol. - 1998. - V.75, No 1. - P.77-91. (За участю автора сплановано завдання досліджень, проведено аналіз субстратної специфічності протеїнкіназної активності sIgA-абзимів).
8. Кит Ю.Я. Секреторные иммуноглобулины А молока человека обладают сродством к олигонуклеотидам и нуклеиновым кислотам / Ю.Я. Кит, Д.В. Семенов, Т.Г. Канышкова, Е.В. Кулигина, И.В. Романникова, О.В. Морозова, В.А. Рихтер // Биохимия. - 1999. - Т.64, № 1. - С.52-59. (Автором сформульовано завдання досліджень, проведено виділення АТ, підготовлено статтю до друку).
9. Кит Ю.Я. Эндогенные олигонуклеотиды молока человека и их возможная биологическая активность / Ю.Я. Кит, Е. В Кулигина, А.М. Онищенко, Л.В. Юрченко, И.В. Романникова, В.А. Рихтер, В.В. Власов // Биохимия. - 1999. - Т.64, № 8. - С.59-64. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз протеїнкіназної активності білків молозива породіль, підготовлено статтю до друку).
10. Кулигина Е.В. Олигонуклеотиды и олигонуклеотидсвязывающие белки спинномозговой жидкости человека / Е.В. Кулигина, А.Ю. Андреева, А.С. Могельницкий, Ю.Я. Кит, Л.А. Якубов, В.А. Рихтер, В.В. Власов // Доклады Академии Наук. - 1999. - Т.364, № 6. - С.832-834. (Автором розроблено схему виділення олігонуклеотидів із спинномозкової рідини людини, проведено аналіз олігонуклеотид-звязувальних білків, підготовлено статтю до друку).
11. Кит Ю.Я. Влияние нуклеиновых кислот и полисахаридов на фосфотрансферазную активность препаратов sIgA, выделенных из молока человека / Ю.Я. Кит, Д.В. Семенов, Е.В. Кулигина., В.А. Рихтер // Биохимия. - 2000. - Т.65, № 1. - С.59-64. (Автором визначено завдання досліджень, проаналізовано вплив чинникив на фосфотрансферазну активності sIgA молозива породіль, підготовлено статтю до друку).
12. Kit Y. Y. Human anti-DNA secretory immunglobulins A possess endonuclease activity and they are able to cause the destruction of nuclear chromatin in vitro / Y. Y. Kit, E. E. Mitrofanova, O. E. Shestova, E. V. Kuligina, I. V. Romannikova, V. A. Richter // Укр. біохім. журн. - 2000. - Т.72, № 3. - С.73-76. (Автором сформульовано завдання досліджень, очищені анти-ДНК sIgA і досліджено іх ДНКазну активність, підготовлено статтю до друку).
13. Gorbunov D. V. Phosphorylation of Minor Lipids of Human Milk Tightly Bound to Secretory Immunoglobulin A / D. V. Gorbunov, D. V. Semenov, M. V. Shipitsin, Yu. Yu. Kit, T. G. Kanyshkova, V. N. Buneva, G. A. Nevinsky // Rus. J. Immunol. - 2000. - V.5, No 3. - С.267-278. (За участю автора сформульована мета роботи і проведено аналіз результатів досліджень).
14. Kit Y. Oligodeoxyadenylate stimulates the protein kinase activity of anti-DNA sIgA from human milk / Y. Kit, E. Kuligina, D. Semenov, V. Richter // Acta Biochim. Pol. - 2002. - V.5, No 1. - С.291-294. (Автором сформульована мета роботи, проведено дослідження впливу олігонуклеотидів на протеїнкіназну активність sIgA-абзимів, підготовлено статтю до друку).
15. Філяк Є.З. Дослідження впливу оксиду азоту на нуклеазну активність імуноглобулінів крові здорових людей / Є.З. Філяк, В.М. Коробов, Ю.Я. Кіт // Біологія тварин. - 2002. - Т.4, № 1-2. - С.157-162. (Автором визначено завдання досліджень, проаналізовано отримані дані і підготовлено статтю до друку).
16. Кит Ю.Я. Фосфотрансферазная активность препаратов IgG из сыворотки крови больных системной красной волчанкой / Ю.Я. Кит, В.А. Ковалева, В.А. Рихтер // Біополімери і клітина. - 2003. - Т. 19, № 2. - С.185-189. (Автором отримані IgG із спорідненістю до АТР і досліджено іх фосфотрансферазну активність, підготовлено статю до друку).
17. Кит Ю.Я. Взаимодействие олигонуклеотидов и АТР с препаратами sIgA, обладающими протеинкиназной активностью / Ю.Я. Кит, В.А. Якубов, Е.В. Кулигина, В.А. Рихтер // Укр. біохім. журн. - 2003. - Т.75, № 2. - С.63-66. (Автором отримано препарати sIgA і досліджена їх спорідненість до олігонуклеотидів і АТР, підготовлена стаття до друку).
18. Кіт Ю.Я. Метод визначення протеїнкіназної активності в поліакриламідному гелі з використанням системи двомірного розділення білків / Ю.Я. Кіт, В.А. Ковальова, Я.П. Бобак, Л.Б. Дробот // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т.74, № 4. - С.129-132. (Автором розроблено метод визначення протеїнкіназної активності білків у сиворотці крові і лізатах клітин після їхнього розділення ізоелектричним фокусуванням, підготовлено статтю до друку).
19. Кит Ю.Я. Протеинкиназная активность иммуноглобулинов плазмы крови человека / Ю.Я. Кит, А.А. Ким, Н.Р. Гут, В.А. Рихтер // Укр. біохім. журн. - 2005. - Т.77, № 3. - С.49-55. (Автором досліджено протеїнкіназну активність різних ізотипів імуноглобулінів сироватки крові людини).
20. Кіт Ю.Я. Виділення з молока людини секреторних імуноглобулінів класу А з різною спорідненістю до ДНК та дослідження їх ДНК-гідролізуючої активності / Ю.Я. Кiт, Р.С. Стойка // Імунологія та алергологія. - 2005. - № 1. - С.53-55. (Автором сплановано завдання досліджень, проведено аналіз спорідненості sIgA молозива породіль до ДНК і полісахаридів, підготовлено статтю до друку).
21. Kit Yu. Ya. Comparative analysis of the similarity between primary sequenses of receptor CD4 and protein kinases / Yu. Ya. Kit // Ukrainica Bioorganica Acta. - 2005. - No 1. - P. 20-24. (Автором проведено аналіз рівня гомології між амінокислотними послідовностями рецептора CD4 і протеїнкіназ).
22. Старикович М.А., Цитотоксическая активность иммуноглобулинов плазмы крови клинически здоровых людей и больных рассеянным склерозом / М.А. Старикович, Ю.Я. Кит, М.Я. Хавунка, Т.И. Негрич, Р.С. Стойка // Цитокины и воспаление. - 2006. - Т.5, № 4. - С.26-31. (За участю автора сплановано завдання дослідження, проведена очистка антитіл, підготовлено статтю до друку).
23. Кіт Ю.Я. Каталітично активні антитіла (абзими) молока людини / Ю.Я. Кіт, Р.С. Стойка // Укр. біохім. журн. - 2007. - Т.79, № 2. - С.5-16. (Автором проведено збір та аналіз літератури, підготовлено статтю до друку).
24. Kit Yu. Ya. Secretory IgAs from human milk with affinity to mammalian DNA are capable of hydrolyzing ribosomal RNA / Yu. Ya. Kit, E. V. Kuligina, V. A. Richter. Укр. біохім. журн. - 2007. - Т.79, № 3. - С.8-13. (Автором проведено дослідження впливу нуклеотидів на нуклеазну активність анти-ДНК sIgA).
25. Козак М.Р. Зниження життєздатності клітин селезінки та цитотоксичної активності імуноглобулінів сироватки крові мишей за умов тривалого згодовування їм мозку великої рогатої худоби / М.Р. Козак, Д.Д. Остапів, Ю.Я. Кіт, В.В. Влізло, Р.С. Стойка // Експ. клін. фізіол. і біохім. - 2007. - № 1. - С.11-15. (За участю автора визначено мету дослідження, проаналізовано отримані результати).
26. Козак М.Р. Індукція апоптозу та некрозу лейкемічних клітин очищеними препаратами IgG сироватки крові мишей, яким тривалий час згодовували мозок великої рогатої худоби / М.Р. Козак, В.В. Влізло, Ю.Я. Кіт, Р.С. Стойка // Біополімери і клітина. - 2008. - Т.24, № 1. - С.1-5. (За участю автора встановлено завдання досліджень, проаналізовано отримані дані, підготовлено статтю до друку).
27. Kit Yu. Oligodeoxynucleotides stimulate protein kinase activivity of the anti-DNA sIgA from human milk / Kit Yu., D. Semenov, E. Kuligina, V. Richter // Mechanisms of cellular signal transduction and communication: 3rd Parnas Conf., October 14 – 18, 2000.: Abstract Book. - Lviv, 2000. - P.101.
28. Kuligina E. Oligonucleotides and oligonucletotide-binding proteins of human extracellular fluids / E. Kuligina, Y. Kit, I. Romannikova, D. Semenov, V Richter // RNA as Terapeutic and Genomic Target: Internat. Conf., 30th August – 2nd September 2001.: Abstract Book. - Nоvosibirsk, 2001. - P.17.
29. Kit Yu. Study of phosphotranspherase activity of IgG fraction possessing affinity to ATP from blood serum of humans with lupus erytromatosis / Yu. Kit, V. Kovaleva,
8-09-2015, 21:51