Вибірковість дії нуклеотидтрифосфатів на РНКазну, топоізомеразну й ендонуклеазну активність sIgA-абзимів вказує на те, що в основу регуляції їхньої активності можуть бути задіяні, щонайменше, два незалежних механізми. За першим механізмом, регуляція нуклеазної активності може відбуватися шляхом фосфорилювання поліпептидів sIgAза участю sIgA-абзимів, які володіють протеїнкіназною активністю (Kitetal., 1991, 1995). Можливо, що фосфорилювання певних ділянок цих антитіл призводить до втрати їхньої спорідненості до нуклеїнових кислот, зокрема до рРНК. За другим механізмом, інгібування ендонуклеазної активності ДНК-гідролізуючих sIgA може відбуватися через зміну конформації каталітичного центру абзимів при зв’язуванні АТР і dATP із певними ділянками поліпептидів цих антитіл, задіяних в алостеричній регуляції їхньої нуклеазної активності.
Про можливе існування цих ділянок у sIgA-абзимів свідчать результати аналізу спорідненості щодо олігонуклеотидів і АТР електрофоретично гомогенних препаратів sIgA, отриманих із молока людини послідовними хроматографіями на протеїн А-сефарозі і ДЕАЕ-фрактогелі (рис.9). Очищені у такий спосіб sIgA слугували основою для подальшої очистки АТ, які володіють фосфотрансферазною і нуклеазною активністю.
За допомогою афінної модифікації sIgA-антитіл 32Р-міченими алкілуючими похідними олігонуклеотидів і АТР у присутності конкурентів (dT14 і АТР) встановлено, що секреторний компонент sIgAвиявляє спорідненість до дезоксирибоолігонуклеотидів (рис.9, доріжки 3, 4), тоді як важкі і легкі ланцюги цих антитіл, головним чином, зв’язуються із АТР (рис.9, доріжки 5, 6).
На основі цього аналізу було зроблено припущення про те, що подібно до інгібувальної дії АТР на нуклеазну активність sIgA-абзимів, олігонуклеотиди можуть бути залучені до регуляції протеїнкіназної активності sIgA-абзимів молозива породіль. Підтвердженням цього припущення слугувало дослідження впливу олігонуклеотидів на протеїнкіназну активністю анти-ДНК sIgA молозива породіль.
Протеїнкіназна активність анти-ДНК sIgA молока людини. При інкубації sIgA, очищених на ДНК-целюлозі, із [g-32P] ATP було виявлено включення радіоактивного фосфату у поліпептиди цих імуноглобулінів (рис.10А, доріжка 1), що свідчить про можливу протеїнкіназну активність анти-ДНК sIgA-антитіл. Незначний рівень протеїнкіназої активності цих АТ спостерігали, коли субстратом фосфорилювання слугував казеїн молока людини (рис.10Б, доріжка 6). Отримані результати показали, що подібно до sIgA-антитіл, очищених із молока людини хроматографією на АТР-сефарозі (Kitetal., 1996), анти-ДНК sIgA також можуть володіти протеїнкіназною активністю. У присутності мікромолярних кількостей дезоксирибоолігонуклеотиду d(A) 12 спостерігається значне зростання фосфорилювання важких ланцюгів sIgA (рис.10А, доріжки 5–8) і казеїну (рис.10Б, доріжки 1–5). При цьому рибоолігонуклеотид r(A) 12 помітно не впливав на протеїнкіназну активність цих антитіл (рис.10Б, доріжки 7–11). Таким чином, нами було з’ясовано, що sIgA, очищені із молока людини афінною хроматографією на ДНК-целюлозі, крім нуклеотид-залежної нуклеазної активності, також володіють олігонуклеотид-залежною протеїнкіназною активністю.
Цитотоксична активність анти-ДНК sIgA молока людини клітин ссавців invitro. Важливою властивістю анти-ДНК АТ, виділених із сироватки крові хворих на СЧВ і розсіяний склероз, є їхня здатність індукувати загибель клітин шляхом апоптозу (Kozyretal., 2000; Nevinskyetal., 2002). Подібну цитотоксичну активність також було виявлено в анти-ДНК IgG, очищених із молока клінічно здорових жінок (Nevinskyetal., 2002).
Аналіз спорідненості FITC-мічених sIgA, очищених на ДНК-целюлозі, виявив їхню здатність зв’язуватися із фіксованими Т-клітинами лінії Jurkat (рис.11). Розподіл флуоресцентної мітки показав, що мішенню дії анти-ДНК sIgA можуть бути структури, локалізовані на плазматичній мембрані, або в цитоплазмі цих клітин (рис.11, картинки 1, 3). Це дозволило припустити, що анти-ДНК sIgA можуть впливати на ріст і виживання клітин.
Ми вивчили дію препаратів анти-ДНК sIgA молозива породіль на життєздатність трансформованих фібробластів лінії L929 миші, клітин лейкемії людини (лінії Namalwa, Jurkat) та клітин лінії L1210 лейкемії миші. Вплив АТ на ріст і виживання клітин invitroвизначали за індексом життєздатності (ІЖ), який вираховували за формулою, наведеною у розділі “Матеріали і методи досліджень”. Аналіз отриманих даних свідчить про те, що використані нами лінії клітин суттєво відрізняються між собою за чутливістю до дії препаратів анти-ДНК sIgA(рис.12). Найбільш чутливими були фібробласти лінії L929 (ІЖ ≤ 20). Значно меншою цитотоксичною дією ці імуноглобуліни володіли щодо T-клітин ліній Jurkat (ІЖ ≥ 40) та В-клітин лінії L1210 (ІЖ ≥ 30). В-клітини лінії Namalwa були найменш чутливими до дії анти-ДНК sIgA (ІЖ ≥ 60).
На підставі отриманих даних можна зробити висновок, що препарати sIgAзі спорідненістю до ДНК тимусу теляти, які містять абзими з нуклеазною і фосфотрансферазною активністю, можуть із різною ефективністю індукувати загибель ракових та трансформованих клітин invitro. Доведено, що цитотоксична дія анти-ДНК IgG сироватки крові хворих на системний червоний вовчак і на розсіяний склероз безпосередньо пов’язана із їхньою ДНКазною активністю АТ (Kozyretal., 2002). Тому можна припустити, що загибель клітин під дією анти-ДНК sIgA молозива людини відбувається за подібним механізмом.
Інший механізм біологічної дії каталітично активних sIgA молока людини може бути пов'язаний із особливістю транспортування секреторних АТ в організмі людини. В основі запропонованої моделі (рис.13) лежить механізм трансцитозу sIgA-антитіл через шар епітеліальних клітин слизових оболонок до секреторних рідин (жовч, слина, молоко і т.п.). Встановлено, що в процесі трансцитозу, sIgA-антитіла можуть бути залучені до внутрішньоклітинної нейтралізації вірусів (Lammetal., 1998; Masteskietal, 1997).
Базуючись на цих даних, можна припустити, що sIgA-абзими із нуклеазною активністю, здатні гідролізувати нуклеїнові кислоти вірусів у цитоплазмі епітеліоцитів і, таким чином, можуть бути задіяні у захисті епітеліальних клітин слизових оболонок людини від вірусних інфекцій. Наведені аргументи дозволяють припустити, що sIgA-абзими функціонують як фактори гуморального імунного захисту епітеліальних клітин від вірусних інфекцій.
Характеристика функціональної активності антигістонових антитіл сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молока людини. Антитіла, каталітично активні щодо гідролізу гістону Н1, було вперше виявлено нами під час дослідження протеазної активності препаратів IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз. Основою для проведення таких досліджень слугували дані про те, що при цьому аутоімунному захворюванні у спинномозковій рідині і сироватці крові хворих можуть бути присутні абзими із гідролізуючою активністю щодо основного білка мієліну (ОБМ) [Polosukhinaetal., 2005; Gabibovetal., 2006]. Важливою особливістю білків цієї родини є їхній високий позитивний заряд (рI=12-13). Це дозволило нам припустити, що у сироватці крові хворих на розсіяний склероз присутні абзими, які здатні гідролізувати, крім ОБМ, також інші позитивно заряджені білки. Для перевірки цього припущення як субстрати протеолітично активних антитіл було використано лінкерний та корові гістони хроматину тимусу теляти і лізоцим курячого яйця. Аналіз протеолітичної активності 20-ти препаратів IgG, очищених із сироватки крові хворих на розсіяний склероз хроматографією на протеїн А-сефарозі, виявив у зразках 3-х пацієнтів здатність каталізувати гідроліз гістону Н1. Аналіз 16-ти препаратів IgG сироватки крові здорових донорів не виявив у жодного з них гідролізуючої активності щодо цього білка. Дослідження протеолітичної активності 25-ти препаратів sIgA молозива породіль показало, що два з цих препаратів АТ виявляють гідролізуючу активність щодо гістону Н1.
На рис.14 наведено результати аналізу субстратної специфічності протеолітичної активності препаратів IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз (рис.14А) і sIgA молозива клінічно здорових породіль (рис.14Б).
Встановлено, що IgG - і sIgA-антитіла ефективно розщеплюють гістон Н1 (доріжки 2) і не гідролізують лізоцим курячого яйця (доріжки 6). У той же час препарати IgG і sIgAвідрізнялися між собою за здатністю гідролізувати корові гістони тимусу теляти. Із рис.14А видно, що у присутності IgG сироватки крові хворого на розсіяний склероз відбувається суттєве зменшення кількості деяких гістонів із паралельним зростанням вмісту низькомолекулярних продуктів їхнього гідролізу (доріжка 4). Присутність sIgA молозива у реакційному середовищі не впливала на рівень цих гістонів (рис.14. Б, доріжка 4), хоча певний приріст кількості низькомолекулярних поліпептидів на електрофоретичній доріжіці 4 вказує на те, що деякі із корових гістонів також можуть руйнуватися цими антитілами.
Щоб переконатися, що протеолітична активність препаратів імуноглобулінів дійсно належить АТ, а не домішкам ензимів, які можуть знаходитися у комплексі із АТ, каталітично активні препарати IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз і sIgA молозива породіль піддавали гель-фільтрації за умов дисоціації імунних комплексів (рН-шок-аналізу) (рис.15а). Виявлено, що гістон Н1-гідролізуюча активність хроматографічних фракцій каталітично активних препаратів IgG (рис.15А) і sIgA (рис.15Б) відповідає фракціям, які містять поліпептиди цих імуноглобулінів. Відсутність протеолітичної активності в інших хроматографічних фракціях свідчить про те, що гідроліз гістону Н1 відбувається саме за участю IgG і sIgA, а не під дією домішків протеаз сироватки крові чи молозива породіль у препаратах цих імуноглобулінів.
Присутність значного рівня антигістонових-АТ, виявлених нами у препаратах Ig молозива породіль і сироватки крові хворих на розсіяний склероз (рис.5), дозволяє припустити, що саме цим антитілам властива протеолітична активність щодо гістону Н1.
Для перевірки цієї гіпотези із каталітично активних препаратів IgG і sIgA хроматографією на гістон Н1-сефарозі виділили антигістонові антитіла (рис.16А) і проаналізували їхню протеолітичну активність. Електрофоретичний аналіз хроматографічних фракцій (рис.16Б) показав, що у складі препаратів IgG і sIgA присутні антитіла зі спорідненістю до гістону Н1 (антигістонові-АТ), які володіють гідролізуючою активністю щодо цього білка (рис.16В).
Отже, нами вперше встановлено, що у сироватці крові хворих на розсіяний склероз і в молозиві клінічно здорових породіль містяться абзими, здатні гідролізувати гістон Н1. Показано, що IgG - і sIgA-абзими різняться між собою за чутливістю до дії інгібіторів відомих протеаз.
Вплив антигістонових АТ на ріст і виживання клітин invitro. Оскільки анти-гістон Н1 антитіла, очищені із сироватки крові хворих на розсіяний склероз та із молока людини за антигенною специфічністю можна віднести до ауто-АТ, важливо було визначити їхній вплив на ріст і виживання клітин invitro. Мішенями тут слугували Т-клітини лінії Jurkat. Встановлено, що анти-гістонові sIgA-антитіла молозива породіль і анти-гістонові IgG-антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз відрізняються між собою за дією щодо цих клітин. Із рис.17 видно, що дія анти-гістонових sIgA-антитіл упродовж 72 год суттєво не вливає на ріст Т-клітин лінії Jurkat. У той же час, під впливом антигістонових IgG-антитіл спостерігався помітний приріст кількості цих клітин.
|
Отримані нами дані вказують на те, що анти-гістонові IgG-антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз можуть володіти промітогенною активністю щодо Т-клітин лінії Jurkat. Тому було припущено, що відмінність у дії антигістонових АТ сироватки крові хворих на розсіяний склероз та антигістонових АТ молозива породіль на Т-клітини лінії Jurkat може бути пов’язана із їхньою здатністю до інтерналізації. Підставою для цього припущення слугували дані про те, що IgG-антитіла, специфічні до деяких ядерних антигенів, можуть не лише проникати у клітини ссавців, але й транспортуватися в ядро цих клітин (Maetal., 1993; Avrameasetal., 1998).
Щоб перевірити цю гіпотезу, анти-гістонові-АТ обох ізотипів інкубували із Т-клітинами лінії Jurkat і визначали їхню субклітинну локалізацію за допомогою анти-IgG і анти-IgA антитіл, кон’югованих із пероксидазою хрону. Результати мікроскопії фіксованих препаратів клітин показали (рис.18), що після 2-годинної інкубації значна кількість анти-гістонових IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз потрапляє у цитоплазму клітин-мішеней
У той же час, присутність анти-гістонових sIgA-антитіл у клітинах була незначною. Здатність анти-гістонових IgG-антитіл інтерналізуватися у клітини ссавців було також підтверджено при використанні трансформованих фібробластів лінії L929 (рис. 19).
Отримані результати свідчать про те, що на відміну від анти-гістонових sIgA-антитіл молозива породіль, антигістонові IgG–антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз можуть інтерналізуватися клітинами ссавців.
Зв'язок між стимулюючим ефектом анти-гістонових IgG на ріст лейкемічних лімфоцитів людини лінії Jurkatinvitro, їхньою протеолітичною активністю щодо гістону Н1 та здатністю до інтерналізації цих АТ дозволяє запропонувати гіпотезу про механізм активації проліферації клітин під дією цих антитіл. В основі цього механізму може лежати деконденсація хроматину, викликана гідролізом лінкерного гістону Н1 під впливом IgG-абзимів, які за певного функціонального стану клітин-мішеней можуть проникати в їхнє ядро.
Характеристика фосфотрансферазної активності АТ молозива породіль і сироватки крові хворих на СЧВ. Фосфорилювання білків і ліпідів є ключовими реакціями, задіяними у регуляції життєдіяльності клітин. Раніше нами було встановлено, що sIgAмолока жінок володіють спорідненістю до АТР і казеїнкіназною активністю (Kitetal., 1995). У наступних дослідженнях ми показали, що sIgA молока жінок також можуть володіти ліпідкіназною активністю. Ліпідкіназну активність антитіл було виявлено при аналізі продуктів фосфорилювання хроматографічних фракцій, отриманих гель-фільтрацією препаратів sIgA, очищених із молока жінок послідовними хроматографіями на протеїн А-агарозі і ДЕАЕ-фрактогелі (рис.7А).
Для дисоціації можливих імунних комплексів у препаратах sIgA гель-фільтрацію проводили у присутності 50 мМ NaOH (рис. 20А). Хроматографічний пік було розділено на 2 фракції і після нейтралізації рН було проаналізовано їхню протеїнкіназну активність. У sIgA–антитіл фракції 2 виявлено фосфорилювання секреторного компоненту (SC) і важких ланцюгів (Н) 
цих імуноглобулінів (рис. 20В, доріжка 2). На відміну від фракції 2, у sIgA фракції 1, при низькому рівні фосфорилювання поліпептидів імуноглобулінів, спостерігали також утворення низькомолекулярного 32P-міченого продукту (рис. 20В, доріжка 1), який не фарбувався Coomassie (рис. 20Б, доріжка 1).
На підставі даних було зроблено припущення, що виявлені нами фосфорильовані продукти належать до фосфоліпідів. Це припущення було підтверджене після екстракції цих продуктів розчином хлороформ-метанол (2: 1) і їхнім розділенням ТШХ у буферній системі, яку використовують для аналізу фосфоліпідів (рис. 20Г). Отже, sIgA-антитіла молока породіль можуть володіти як протеїнкіназною, так і ліпідкіназною активністю. При цьому ліпіди знаходяться у комплексі із імуноглобулінами і не дисоціюють при високих значеннях рН. На основі комбінованого аналізу цих сполук із застосуванням методів ензиматичної та хімічної деградації було зроблено висновок (Gorbunovetal., 2000, 2005), що субстратами каталізу sIgA-абзимів молока є 2 гліколіпіди, до складу яких входить один залишок сіалової кислоти та 4–5 залишків жирних кислот.
Результати наших досліджень показали, що ліпідкіназна активність властива також IgG-антитіламсироватки крові хворих на СЧВ (рис.21).
При електрофоретичному аналізі продуктів фосфорилювання препаратів IgG, очищених із сироватки крові хворих на СЧВ хроматографією на протеїн А-сефарозі (рис.21Б, доріжка 1), як і у випадку sIgA-антитіл молока людини, спостерігали утворення низькомолекулярних 32Р-мічених сполук небілкової природи (рис.21В, доріжка 1), які також екстрагувалися із реакційного середовища розчином хлороформ-метанол (2: 1) і розділялися ТШХ на три фракції (рис.21Г, доріжка 1). Радіоактивно мічені продукти ліпідної природи було також виявлено при фосфорилюванні препаратів IgG(рис.21Г, доріжка 2), очищених на колонці із АТР-сефарозою (рис.21А). При цьому фосфорилювання ліпідів не спостерігалося у випадку, коли із [g-32P] ATP інкубували IgG, які не володіли спорідненістю до АТР (рис.21В, доріжка 2).
Отримані дані дозволяють припустити, що у сироватці крові хворих на СЧВ, подібно як у молоці людини, можуть бути присутні IgG-абзими, які володіють фосфотрансферазною активністю. Ми також припустили, що ліпіди можуть впливати на протеїнкіназну активність IgG-антитіл. Для перевірки цього припущення IgGпіддавали гель-фільтрації у буферній системі, яка містила 5% діоксану (рис.22). При інкубації IgG, очищених у такий спосіб від ліпідів, із [g-32P] ATP було виявлено включення 32Р у важкі (Н) і легкі (L) ланцюги IgG. При цьому рівень фосфорилювання їхніх поліпептидів значно зростав у випадку, коли до реакційної суміші додавали 1 мкМ нерадіоактивногоАТР.
Нами також проаналізовано, як впливає видалення ліпідів на рівень фосфорилювання АТ, очищених із молозива породіль і сироватки крові хворих на склеродермію. Встановлено, що руйнування комплексів ліпід-АТ гель-фільтрацією у присутності іонного розчинника діоксана стимулює фосфорилювання, не тільки IgG сироватки крові хворих на СЧВ, але й sIgA-антитіл молозива породіль і IgG-антитіл сироватки крові хворих на склеродермію. Очищені у такий спосіб від ліпідів препарати IgG здорових донорів не виявляли протеїнкіназної активності.
Отже у молоці клінічно здорових жінок і у сироватці крові хворих на СЧВ присутні абзими із фосфотрансферазною активністю. Характерною ознакою цих каталітично активних антитіл є їхня спорідненість до АТР і ліпідів. Висока спорідненість АТ до ліпідів дозволяє класифікувати виявлені абзими як антифосфоліпідні IgG. Підтвердженням цього можуть слугувати дані про те, що АТ із спорідненістю до фосфоліпідів можуть перехресно реагувати із АТР (Wasefetal., 1993; Chapmanetal., 2005). Можна припустити, що за рахунок конкуренції цих сполук за антиген-зв’язувальні ділянки молекул АТ відбувається перенос макроергічного гамма-фосфату молекули АТР на акцепторні групи ліпідів, і, можливо, білків. Крім того, не виключено, що фосфотрансферазна активність властива деяким ізотипам імуноглобулінів сироватки крові. На це вказують дані про те, що афінно-очищені IgA сироватки крові клінічно здорових донорів можуть фосфорилювати казеїн у присутності [g-32P] ATP. Для виявлення ділянок АТ, які залучені у фосфотрансферазну реакцію, ми використали комп’ютерний аналіз рівня гомології первинних структур білків імуноглобулінової надродини і відомих протеїнкіназ. За допомогою цього підходу було встановлено, що Fc-фрагменти імуноглобулінів містять послідовності, гомологічні до деяких протеїнкіназ. Отримані результати слугували поштовхом для дослідження протеїнкіназної активності рецептора Т-гелперних клітин СD4.
Протеїнкіназна активність rsCD4. Рецептор
8-09-2015, 21:51