Дослідження антивірусної активності 6-азацитидину та амізону в модельній системі: цитомегаловірус - культура клітин фібробластів легень ембріона людини

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКО

АБДУЛЛАЄВА МАЙЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК: 578.825.12:578.74[058.86+078.33]:615.281

ДОСЛІДЖЕННЯ АНТИВІРУСНОЇ АКТИВНОСТІ 6-АЗАЦИТИДИНУ ТА АМІЗОНУ В МОДЕЛЬНІЙ СИСТЕМІ: ЦИТОМЕГАЛОВІРУС – КУЛЬТУРА КЛІТИН ФІБРОБЛАСТІВ ЛЕГЕНЬ ЕМБРІОНА ЛЮДИНИ

03.00.06 – вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, член-кореспондент НАН та АМН України, РАМН, заслужений діяч науки і техніки України Фролов Аркадій Федорович

Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, завідувач відділу загальної вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Руденко Адель Вікторівна Інститут урології АМН України, завідувач лабораторії мікробіології, вірусології та мікології кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Нестерова Надія Віталівна Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України, завідувач лабораторії репродукції вірусів

Захист дисертації відбудеться “4” березня 2008 р. о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12, аудиторія 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченко за адресою: Україна, 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “ 28” січня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізовано вченої ради О.В. Молчанець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цитомегаловірусна інфекція (ЦМВІ) на сьогодні особливо актуальна проблема сучасності. За оцінюючими даними, рівень інфікування цитомегаловірусом, як у cвіті так і у нашій країні становить більше 90% ( Trincado D.E., 2000; Нисевич Л.Л., 2002 та інш.).

Особливо важливе місце ЦМВІ належить у патології плоду, новонароджених і дітей раннього віку. Вона є однією із причин самовільних викиднів, передранніх пологів, вроджених вад розвитку, фетопатій. Небезпечною ЦМВІ є і для реципієнтів органів та кісткового мозку, онкологічних хворих та ВІЛ-інфікованих (Чешик С.Г., 2001).

Широкий спектр клінічних проявів та розповсюдженість ЦМВ серед усіх верств населення, спонукає звернути увагу на своєчасну діагностику ЦМВІ, враховуючи яку, можливо у найкоротший термін скоректувати стратегію лікування для хворих. Найбільш розповсюджені методи виявлення ЦМВ імуноферментний та полімеразної ланцюгової реакції мають ряд недоліків, із яких найбільш значний полягає у складності диференційної діагностики первинної, персистентної чи реактивованої інфекції. Це обгрунтовує використання у світовій лабораторній практиці нових методів ранньої специфічної експрес діагностики ЦМВІ.

Хіміотерапія ЦМВІ є складним і в багатьох випадках не вирішеним завданням. Існуючі хіміотерапевтичні засоби поки не дозволяють досягти повної зупинки продуктивної реплікації ЦМВ. Основні препарати, які специфічно інгібують репродукцію ЦМВ (ганцикловір, валганцикловір, фоскарнет і цидофовір) мають побічні токсичні ефекти (Дзюблик И.В, 1999; DeSmet M.D., 1999). А тривале застосування ганцикловіру у великих дозах викликає формування резистентності до ЦМВ (Mendez J.C, 1999). Крім того, довготривалі курси лікування до цього часу залишаються надзвичайно дорогими при сумнівному ефекті.

Саме тому актуальним питанням дослідження ефективності методів лабораторної діагностики ЦМВІ, які дозволяють встановити форму інфекції та пошуку нових анти-ЦМВ засобів із вивченням механізмів їх дії і було присвячено дану дисертаційну роботу. Даний напрямок досліджень дасть можливість вдосконалити методи діагностики та лікування ЦМВІ.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.Роботу виконано у відповідності з напрямом наукових досліджень Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, лабораторії загальної вірусології, у рамках тематичного плану “Вивчення механізмів епідемічного процесу при грипі та цитомегаловірусній інфекції”, завдань: “Цитогенетичні дослідження гострої та персистентної форми ЦМВ-інфекції”, та “Вивчення механізмів дії амізону та 6-аzaC на репродукцію ЦМВ in vitro” у 2001-2004 роках (шифр: 084, номер держреєстрації 01.02.U 000631).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи — дослідження діагностичної цінності методів ранньої лабораторної діагностики ЦМВІ, а також вивчення анти-цитомегаловірусної активності 6-аzaC та амізону.

Для досягнення поставленої в роботі мети передбачалось вирішення наступних задач:

1. Встановити ефективність виявлення ранніх білків ЦМВ швидким культуральним методом та у тесті на виявлення антигенемії;

2. Дослідити можливість диференціації персистентної та гострої форм ЦМВІ за допомогою експресних методів лабораторної діагностики (ШКМ, ІФА, ПЛР, тАГ);

3. Вивчити цитотоксичну дію 6-azaC та амізону в культурі клітин фібробластів легень ембріона людини;

4. Дослідити анти-ЦМВ активність 6-azaC та амізону у дослідах in vitro;

5. Визначити вплив 6-azaC та амізону на синтез ранніх (р72, рр65) та пізніх (gB) вірусних білків в інфікованих клітинах.

Об’єкти дослідження – цитомегаловірус людини АD 169, лейкоцити та сироватки периферичної крові пацієнтів, антивірусні препарати, інфіковані та неінфіковані ЦМВ клітини культури ФЛЕЛ, моноклональні антитіла направлені до р 72, рр 65, gB білків ЦМВ.

Предмет дослідження – імунні комплекси антиген-антитіло, репродукція ЦМВ, цитотоксичність та анти-ЦМВ активність 6-azaC та амізону.

Методи дослідження – для виконання поставлених завдань використовували вірусологічні, молекулярно-біологічні та імунологічні методи, а також методи статистичної обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Показано високу діагностичну цінність швидкого культурального методу, який підтверджує у 65% новонароджених і дітей раннього віку і у 70% хворих після трансплантації нирки - гостру форму ЦМВІ. Показано, що за допомогою тесту на виявлення антигенемії за 3-4 год. можливо виявити ранні білки вірусу і встановити форму перебігу ЦМВІ. Вперше встановлено анти-ЦМВ активність 6-аzaC та амізону in vitro, що дає змогу розглядати їх, як перспективні проти-ЦМВ агенти. Доведено, що механізм дії цих засобів полягає в інгібіції ситезу пізнього структурного білку gB.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані експериментально доводять високу ефективність застосування швидкого культурального методу та тесту на виявлення антигенемії, що дозволяє віддиференціювати гостру і персистентну форми ЦМВІ. За результатами досліджень було створено проект: “Модифікація і застосування швидкого культурального методу, як нової технології діагностики цитомегаловірусної інфекції” за №76/4 від 29.10.04 р. у напрямі: “Діагностика і методи лікування найпоширеніших захворювань”. Результати можуть бути використані в розробці методичних рекомендацій по діагностиці ЦМВІ у новонароджених та дітей раннього віку, а також у хворих після трансплантації органів чи тканин. Виявлена і підтверджена в дослідах анти-ЦМВ активність 6-azaC і амізону обґрунтовує необхідність наступних етапів оцінки препаратів, які можуть бути використані для клінічного впровадження, як нові проти-ЦМВ засоби. Результати даних досліджень відображені в деклараційних патентах: на винахід - №69986 А “Інгібітор цитомегаловірусу людини 2-b-D- рибофуранозил –5- аміно-1,2,4 – триазин –3 (2Н)- ОН”, на корисну модель - №10889 “Застосування 4-(N-бензил)амінокарбонілу –1-метилпіридинію йодиду як профілактичного інгібітора цитомегаловірусної інфекції людини”.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проаналізована наукова література по темі дисертації. Основний об’єм експериментальної роботи, обробка та аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи виконана пошукачем особисто. Здобувачем самостійно проаналізовано одержаний експериментальний матеріал, який викладений автором у ряді статей у фахових виданнях та тезах доповідей на вітчизняних та міжнародних конференціях. Планування основних напрямків досліджень дисертаційної роботи, обговорення отриманих результатів та їх узагальнення здійснені під керівництвом д.мед.н, професора, чл.-кор. НАН та АМН України, РАМН, заслуженого діяча науки і техніки України Фролова Аркадія Федоровича.

При проведенні даних досліджень автор використовувала моноклональні антитіла до білків ЦМВ, які були отримані раніше у відділі клітинної інженерії Науково дослідного інституту вірусології РАМН, с.н.с., к.б.н. Макаровою Н.Е..

Значну частину досліджень виконано на базі лабораторії клітинної інженерії Науково дослідного інституту вірусології РАМН, Москва (д.б.н., проф. Кущ А.А., к.б.н. Федорова Н.Е.), лабораторії контролю якості імунобіологічних препаратів Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України (д.мед.н. Рибалко С.Л., к.б.н. Дядюн С.Т.). Автор засвідчує глибоку повагу та щиру вдячність за співпрацю, корисні поради та сприяння у виконанні роботи.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які увійшли в дисертаційну роботу, доповідались і апробовані на семінарах відділу загальної вірусології Інституту епідеміології та інфекційних хвороб АМН України та відділу клітинної інженерії Науково дослідного інституту вірусології ім. Д.І. Івановського РАМН, ХI Російському національному конгресі “Человек и лекарство” (Москва, Росія, 2004); Х з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); IV Міжнародній конференції “Біоресурси і віруси” (Київ, 2004); XIV з’їзді мікробіологів, епідеміологів та паразитологів (Полтава, 2005).

За матеріалами дисертаційних досліджень було створено науково-технічний проект №76/4: “Модифікація і застосування швидкого культурального методу, як нової технології діагностики цитомегаловірусної інфекції людини” (Київ, 2004), за конкурсом автор отримав “Відзнаку” від Київської міської держадміністрації.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових праці, в тому числі, 3 статті у провідних фахових журналах, 2 патенти України на винаходи та 4 тези доповідей на наукових конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, методів і об’єктів досліджень, експериментальної частини, аналізу й узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел та додат­ків. Робота викладена на 125 сторінках основного тексту, містить 5 таблиць, 17 рисунків. Список використаних джерел включає 265 робіт вітчизняних та іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури складається із чотирьох розділів, в яких докладно викладено сучасні уявлення про структуру та біологічну активність ЦМВ, його роль в інфекційній патології людини, огляду сучасних методів лабораторної діагностики ЦМВ та ідеології профілактики та лікування ЦМВ-інфекції.

Матеріали та методи дослідженнь. У роботі використано цитомегаловірус людини (референс-штам ЦМВ AD 169) люб'язно наданий доктором L. Pereira (Медичний Центр, Університет Сан-Франциско, США). У дослідах використовували первинну культуру клітин ФЛЕЛ (фібробластів легень ембріона людини), яка входить до Каталогу Європейської колекції культур клітин. Культивування культури клітин ФЛЕЛ проводили використовуючи такі поживні середовища, як Ігла ДМЕМ, Ігла МЕМ, з використанням розчину Версену та Хенксу виробництва фірми “Панеко” (Росія) та Хімопсину фірми “Самсон-Мед” (Росія). Як стимулятор росту використовували ембріональної телячу сироватка виробництва фірми “Hy Clone” (США) чи “Biowest” (Франція) та пуповинну сироватку людини виробництва фірми “Панеко” (Росія). Дослiджували лімфоцити та сироватки периферичної крові від 50 дітей віком від одного дня до першого року життя, що перебували на лікуванні у Центрі корекціїрозвитку дітей раннього віку та від 17 реципієнтів нирки, що знаходились на лікуванні у Науково-дослідному інституті трансплантології та штучних органів.

При дослідженнях використовували буферні розчини: 0.01 М фосфатно-сольовий буфер рН 7,5, який містить 0,1 М NaCl, 0,025M KCl, 0,025M KH₂ PO₄ , 0,036M Na₂ HPO₄ x12H₂ O; 0,005 М розчин Трис- HCl рН 7,4, який містить 0,1 М Na Cl та оригінальні очищені МКА до білків р72, рр65, gВ ЦМВ, що були отримані Макаровою Н.Е. в НДІ вірусології ім. Д.І. Івановського РАМН, у робочих розведеннях 1:100. Як контроль використовували комерційні діагностичні МКА фірми “Ortho” (США). Як кон'югат використовували поліклональні кролячі анти-мишачі імуноглобуліни, мічені пероксидазою хрону “DakoCytomation” (Данія) у робочому розведенні 1:100. Як субстрат використовували диамінобензидин “Bioscinces” (США) в концентрації 10 млг DAВ розведеного в 20 мл 0,005 М розчині буферу ТРИС рН 7.4 з додаванням 20 мкл 30% перекису водню (розрахунок на один планшет). При проведенні досліджень використовували комерційні тест-системи “Enzygnost Anti-CMV/Ig” фірми Behring та ELISa фірми “HUMAN” Німеччина, для визначення специфічних антитіл класів М і G у сироватках крові до ЦМВ методом ІФА.

ДНК ЦМВ в зразках сироваток крові дітей та реципієнтів нирки виявляли за допомогою реактивів набору ЦИТОПОЛ (ТУ-9398-428-17253567-01) виробництва ТОВ НПФ "Літех" Москва і ТОВ НПФ "ГЕНтех" Москва. ІФА та ПЛР у цих випадках та облік результатів здійснювали відповідно до інструкцій фірм-виробників.

Антигенвмісні включення у клітинах ЦМВ виявляли методом імуноцитохімічного забарвлення (кількісний варіант), досліджуючи препарати лейкоцитів периферичної крові хворих, забарвлених МКА до рр65.

Антивірусну дію 6-azaC чи 2-ß-Д-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-ОН (Інститут молекулярної біології і генетики НАН України) та амізону чи 4-(N-бензил)амінокарбоніл-1-метилпіридиній йодид (Інститут фармакології і токсикології АМН України) щодо ЦМВ вивчали за методичними рекомендаціями (Щербинська А.М., Дяченко Н.С., Рибалко С.Л. та інш., 2000 ). Як контрольний препарат застосовували ганцикловір “Roche” (Швейцарія). Антивірусні сполуки досліджували в системі in vitro у трьох схемах: 1. терапевтична (робочі концентрації вносились після 24 г. інфікування клітин); 2. профілактична (робочі концентраціях вносились за 24 год. до інфікування клітин); 3. профілактична накопичувальна (робочі концентрації вносились за 48, 24 та 1 год. до інфікування клітин). Отримані дані виражали графічно у вигляді дозозалежної кривої, за допомогою якої визначали 50% ефективну дозу (ЕD₅₀ ), що зменшує кількість сформованих включень у клітинах на 50%. В результаті проведених досліджень визначали цитотоксичну дозу (CD50), ефективну дозу (ED50) та індекс селективності (IS) досліджуваних сполук, який розраховували за формулою: ІS = CD50 / ED50.

Результати були оброблені статистично за допомогою ком’ютерної програми Microsoft Excel-2000.

Виявлення ранніх білків ЦМВ за допомогою методів експрес діагностики.На першому етапі досліджень виявляли антиген ЦМВ у 50 новонароджених та дітей раннього віку. Дослідження проводили двома методами – швидким культуральним та ІФА, використовуючи лейкоцитарні фракції та сироватки крові отримані від дітей. Відповідно до класифікації клінічних проявів ЦМВІ, немовлят було розділено на дві групи. До першої - віднесли 23 дитини з клінічними симптомами перинатального інфікування ЦМВІ. До другої групи віднесли 27 дітей, яким діагноз ЦМВІ неонатологами та педіатрами поставлено не було.

Визначення класів Ig показало, що 96+0,82% зразків сироваток крові дітей 1-ої групи містили IgG, у той час, як у дітей 2-ої групи вони були зафіксовані у 59+0,49% обстежених (рис. 1). Найбільшу зацікавленість представили результати виявлення анти-ЦМВ IgМ, які розглядались як показник початкової стадії або гострої форми інфекції. IgМ були виявлені в сироватках крові 17+0,47% дітей з клінічними ознаками та у 22+0,51% дітей без клінічних ознак ЦМВІ (p<0,05). Швидким культуральним методом у дітей першої групи антиген ЦМВ було виявлено у 17 осіб, що складало 74%. Тоді як у дітей другої групи антиген ЦМВ виявлено не було. Останнє свідчить про високий рівень безсимптомних форм цитомегаловірусної інфекції, і спостерігається навіть у її гострій формі.

Рис. 1. Виявлення маркерів ЦМВ ІФА та ШКМ у крові дітей раннього віку

Проведене нами порівняння результатів 2-х лабораторних методів, що використовувались для діагностики ЦМВІ у обох групах дітей раннього віку, показало, що у обстежених дітей 1-ої групи (з клінічними ознаками ЦМВІ) IgМ та антиген ЦМВ одночасно було виявленj швидким культуральним методом у 3-х випадках, що складало 13+0,47% (табл. 1). Наявність у сироватках дітей цієї групи імуноглобулінів класу G супроводжувалося виявленням антигену ЦМВ швидким культуральним методом у 15 дітей (65%). У дітей другої групи (без клінічних ознак ЦМВІ) IgM було виявлено у 6 осіб, що сладало 22+0,47%, а IgG у 12 осіб, що складало 59+0,49%, тоді як антиген ЦМВ швидким культуральним методом виявлено не було (табл. 2). Одночасно IgG та IgM у дітей 2-ої групи було виявлено у 4 осіб, що складало 15+0,81% від загальної кількості дітей у групі.

Таблиця 1

Порівняльне дослідження виявлення ЦМВ у крові немовлят та дітей раннього віку з клінічними проявами ЦМВІ ІФА та ШКМ

Примітки:

1. ^1,2 Значення позитивного результату вираховували згідно інструкції виробоника тест-системи;

2. *О/О – оптичні одиниці

Таблиця 2

Порівняльне дослідження виявлення ЦМВ у крові немовлят та дітей раннього віку без клінічних проявів ЦМВ-інфекції ІФА та ШКМ

Примітки:

1. ^1,2 Значення позитивного результату вираховували згідно інструкції виробоника тест-системи;

2. *О/О – оптичні одиниці

Підсумовуючи отримані дані можна заключити, що метод ІФА для визначення анти-ЦМВ АТ не є надійним методом для діагностики ЦМВІ у немовлят і дітей раннього віку; швидкий культуральний метод у 65% немовлят та дітей раннього віку виявляє ранні білки ЦМВ, що підтверджує гостру форму ЦМВІ.

Детекція раннього білку рр 65 ЦМВ у тесті на виявлення антигенемії. Наступним етапом нашої роботи було адаптувати та застосувати експрес-тест на виявлення антигенемії у клітинах крові людини та порівняти ефективність даного методу з ШКМ та методом ПЛР.

Проведена нами адаптація даного тесту, на відміну від відомого “Clonab CMV HCMV pp 65-Antigen” фірми Biotest (Німеччина), ґрунтувалась на виявленні раннього антигену у лейкоцитах крові людини за допомогою оригінальних моноклональних антитіл та спрямована на спрощення, прискорення і здешевлення даної методики. У результаті проведених досліджень, нами було запропоновано:

- застосовувати предметні скельця з полілізиновим покриттям (найбільш ефективні для отримання препаратів розпластаних клітин);

- використовувати оптимальну концентрацію лейкоцитів 2х10⁵ на


8-09-2015, 22:02