Молекулярно-цитогенетична характеристика синдромів сегментних анеусомій

НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АМН УКРАЇНИ

ЄВСЕЄНКОВА ОЛЕНА ГЕННАДІЇВНА

УДК 575:577.21:576.316:616-076

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА

СИНДРОМІВ СЕГМЕНТНИХ АНЕУСОМІЙ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика (м.Київ), МОЗ України

Науковий керівник :

- доктор медичних наук, професор, член-кор. АМН України, Горовенко Наталія Григорівна , Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л.Шупика, завідувач кафедри медичної генетики

Офіційні опоненти :

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Лукаш Любов Леонідівна , Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділом генетики людини;

- доктор медичних наук, провідний науковий співробітник, Налєскіна Леся Анатоліївна , Інститут експериментальної патології, онкології, і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України провідний науковий співробітник відділу механізмів протипухлинної терапії

Захист відбудеться „20” березня 2008 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.02 в Науковому центрі радіаційної медицини АМН України (04050, м.Київ, вул. Мельникова, 53)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Наукового центру радіаційної медицини АМН України (04050, м.Київ, вул. Мельникова, 53)

Автореферат розісланий „19”лютого2008 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Г.В.Стефанович

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Впровадження в практику клінічної цитогенетики високочутливих та молекулярно-цитогенетичних методів дало можливість визначити генетичні чинники понад 20 клінічно окреслених нозологічних форм хромосомної патології (ХП) та виділити їх в окрему групу захворювань – синдромів сегментних анеусомій (ССА), які супроводжуються мікроструктурними змінами ділянок певних хромосом (Кулешов, 2001; Иванов, 2004). До групи ССА зараховують синдром Вольфа-Хіршхорна (СВХ), синдром „котячого крику”, синдром Вільямса-Бойрена (СВБ), синдром Прадера-Віллі (СПВ), синдром мікроделеції 22q11.2, синдром „котячого ока” та інші. Більшість ССА зустрічаються рідко (1:50 000 – 1:100 000) (Бочков, 2001; Залетаев, 2001).

ССА є тяжкою патологією, яка обумовлює наявність множинних вроджених вад розвитку (МВВР), відставання хворих у розумовому, фізичному розвитку, зниження рівня життя та інвалідизацію у подальшому (Антоненко, 2001). Окрім того, однією з основних ознак ССА є наявність у пацієнтів вроджених вад серця (ВВС) різного ступеню важкості. Причому більшість пацієнтів з ССА та ВВС потребують кардіо-хірургічної корекції вже одразу після народження. В той же час ураження різних органів та систем, порушення імунної системи, що спричинені змінами в хромосомному наборі дитини при ССА, ускладнюють проведення кардіо-хірургічних втручань та перебіг післяопераційного періоду. Саме тому рання верифікація діагнозу ССА дозволяє передбачати та запобігати можливим ускладненням при оперативному лікуванні, що знижує показники смертності у пацієнтів з ССА, а також проводити адекватну медичну, психологічну допомогу та соціальну реабілітацію дітей з ССА (Сенаторова, 2006; Wernovsky, 2001).

Клінічна картина більшості ССА є досить чіткою, але, в той же час, варіабельною (Wernovsky, 2001). Так, при деяких синдромах з даної групи, окремі характерні клінічні ознаки можуть виявлятися як одразу після народження, так і через декілька років потому, на противагу певні характерні ознаки з часом зникають або стають менш виразними. Це не дає можливості встановити діагноз лише за клінічними ознаками та призводить як до гіподіагностики, так і до гіпердіагностики синдрому з групи ССА. При ССА має місце і цитогенетична варіабельність, яка пов’язана з різною довжиною делеції або дуплікації певних ділянок хромосом, а також з різним батьківським походженням мікроперебудов, які і призводять до розвитку певних клінічних ознак синдрому (Бочков, 2001; Пішак, 2004; Morrisetal., 2003). Тому швидкість та якість підтвердження діагнозу залежить від чутливості та специфічності застосованих методів. Так, деякі пацієнти з ССА мають значну за розміром делецію/дуплікацію, яку видно у світловий мікроскоп, хоча, у більшості випадків каріотип пацієнтів з підозрою на ССА відповідає нормі. У зв’язку з цим для остаточного підтвердження діагнозу ССА необхідним є використання молекулярно-цитогенетичних технологій, а саме методу флуоресцентної insitu гібридизації (FISH), який є одним із найбільш високоспецифічих методів діагностики ХП в сучасній цитогенетиці (Юров, 2000). В Україні молекулярно-цитогенетичне підтвердження/спростування діагнозу ССА досі не проводили, а верифікація діагнозу ССА базувалася лише на клінічному досвіді лікарів.

Маловивченим залишається питання про етапність та доцільність застосування стандартного та високочутливого цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичного методів для верифікації ССА, кожен з яких є високовартісним та потребує спеціальної підготовки висококваліфікованого персоналу. У зв’язку з цим актуальним є визначення рівня інформативності цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичних методів та послідовності їхнього застосування для підтвердження або спростування попереднього клінічного діагнозу ССА.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами . Роботу виконано в рамках тематичного плану Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика „Визначення ролі ендогенних та екзогенних факторів у виникненні та перебігу генної та хромосомної патології на різних етапах онтогенезу” (номер держреєстрації 0101U000231, 2001–2005 рр.) та спільного гранту між НМАПО імені П.Л.Шупика, Київ, Україна та Інститутом медичної генетики, Цюріх, Швейцарія (№7 IP 62652, 7 IP 051778).

Мета роботи – визначити інформативність використання цитогенетичних і молекулярно-цитогенетичного методів при верифікації діагнозу у пацієнтів з підозрою на синдроми сегментних анеусомій та створити алгоритм для оптимізації лабораторного етапу їх генетичного обстеження.

Задачі дослідження:

1. Дослідити каріотип хворих із підозрою на ССА за допомогою стандартного та високочутливого цитогенетичних методів діагностики.

2. Провести молекулярно-цитогенетичний аналіз хромосомних препаратів у осіб з підозрою на ССА, в каріотипі яких не було виявлено змін у критичних ділянках досліджуваних хромосом 4, 5, 7, 15, 17, 22 при застосуванні стандартного цитогенетичного методу.

3. Визначити рівень інформативності застосування цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичного методів для підтвердження/спростування окремих клінічних діагнозів у пацієнтів з підозрою на ССА.

4. Охарактеризувати диференційно-діагностичний підхід з цілеспрямованим використанням цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичного методів для підтвердження/спростування попереднього клінічного діагнозу при ССА.

5. Розробити алгоритм генетичного обстеження дітей з ССА для оптимізації лабораторного етапу діагностування цієї патології.

Об’єкт дослідження – синдроми сегментних анеусомій (синдром Вольфа-Хіршхорна, синдром „котячого крику”, синдром Вільямса-Бойрена, синдром Прадера-Віллі, синдром Сміта-Мадженіса, синдром мікроделеції 22q11.2, синдром „котячого ока”).

Предмет дослідження – метафазні, прометафазні хромосоми та інтерфазні ядра лімфоцитів периферичної крові пацієнтів з підозрою на ССА, мікроделеції критичних ділянок хромосом 4, 5, 7, 15, 17, 22.

Методи дослідження –стандартний цитогенетичний метод, високочутливий цитогенетичний метод, молекулярно-цитогенетичний метод (FISH).

Наукова новизна одержаних результатів. Систематизовано структурні та мікроструктурні зміни у критичних ділянках хромосом 4, 5, 7, 15, 17, 22 у пацієнтів з ССА та визначено рівень інформативностіметодів, що були використані для виявлення цих порушень. Вперше в Україні та вдруге в світі визначено поєднання у одного пацієнта двох наступних синдромів: синдрому трисомії довгого і, частково, короткого плеча хромосоми 12 з синдромом мікроделеції 22q11.2 (каріотип 46,XX,der(12)t(12;22)(q13.2;q11.2)mat,-22). Доведено необхідність використання стандартного цитогенетичного методу як першого етапу діагностики у всіх випадках верифікації діагнозу при підозрі на ССА. Встановлено, що використання FISH-методу дає можливість проводити диференційну діагностику між спадковим судинним захворюванням – ізольованим надклапанним стенозом аорти (MIM 185500) та СВБ (МІМ 194050). Вперше запропоновано диференційно-діагностичний підхід для підтвердження або спростування попереднього клінічного діагнозу ССА з цілеспрямованим застосуванням цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичного методів дослідження.

Практичне значення одержаних результатів. Показано межі застосування стандартного і високочутливого цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичного методів діагностики ХП для підтвердження або спростування попереднього клінічного діагнозу ССА. Розроблено диференційований підхід до використання цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичного методів у вигляді алгоритму, що дає можливість визначити етапність генетичного обстеження пацієнта з підозрою на ССА. Доведено, що використання алгоритму генетичного обстеження пацієнтів з попереднім клінічним діагнозом ССА сприяє оптимізації верифікації діагнозу та покращує ефективність подальшої медико-генетичної допомоги в родині. Застосування FISH–методу дозволяє високоспецифічно проводити диференційну діагностику двох різних генетичних захворювань – СВБ та моногенного ізольованого надклапанного стенозу аорти та, відповідно, підвищити точність медико-генетичного консультування. Виявлення випадків структурних перебудов в каріотипі батьків, які спричинили розвиток ССА у їхніх дітей, обґрунтовує необхідність проведення пренатальної діагностики в таких родинах. За матеріалами дослідження підготовлено та видано дві методичні рекомендації та інформаційний листок. Результати роботи впроваджено в практику хірургічних відділень Інституту серцево-судинної хірургії імені М.М.Амосова АМН України, Дитячої обласної клінічної лікарні та Обласної медико-генетичної консультації м.Івано-Франківська, медико-генетичної консультації Рівненського обласного клінічного лікувально–діагностичного центру ім. В.Поліщука та у навчальний процес на кафедрі медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика.

Особистий внесок здобувача. Дисертант проаналізувала літературні джерела за обраною темою. Автором особисто було отримано та проаналізовано первинні матеріали дисертаційного дослідження, а саме: було проведено цитогенетичне дослідження з аналізом хромосомних препаратів лімфоцитів периферичної крові пацієнтів із підозрою на ССА і, вибірково, членів їхніх родин та молекулярно-цитогенетичне дослідження з аналізом отриманих препаратів пацієнтів з підозрою на ССА. Дисертантом було проаналізовано отримані дані, підготовлено публікації до друку. Самостійно написано та оформлено всі розділи дисертаційної роботи. Автор щиро вдячна професору Альберту Шинцелю (Інститут медичної генетики, Цюріх, Швейцарія) за допомогу в проведенні молекулярно-генетичної діагностики у частини пацієнтів з функціональною делецією хромосоми 15при СПВ.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на І Всеросійському конгресі „Современные технологии в педиатрии и детской хирургии” (Москва, 2002), I Українському конгресі з клінічної генетики з міжнародною участю „Метаболічні спадкові захворювання” (Харків, 2003), 14^th EuropeanStudents’ Conference (Berlin, 2003), Науково-практичній конференції з міжнародною участю „Сучасні лабораторні методи дослідження спадкової патології” (Київ, 2004), Науковій конференції „Сучасна біотехнологія в сільському господарстві та медицині” (Київ, 2005), 7^th BalkanMeetingonHumanGenetics (Skopje, RepublicofMacedonia, 2006), SecondEasternEuropeanConferenceonRareDiseasesandOrfanDrugs “Fosteringresearchonrarediseasesineasterneuropeancountries” (Plovdiv, Bulgaria, 2006), П’ятому Російському конгресі „Современные технологии в педиатрии и детской хирургии” (Москва, 2006), VIII Всеукраїнській науково-практичній конференції „Актуальні питання педіатрії” (Київ, 2006), на науково-практичній конференції з міжнародною участю „Актуальні питання медичної генетики” (Київ, 2007), XI Ювілейному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2007), на Всеукраїнській науково-практичній конференції „Сучасні методичні підходи до аналізу здоров’я” (Луганськ, 2007), на конференції з медичної генетики з міжнародною участю „Плід – як частина родини” (Харків, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 друкованих праць, серед них: 3 статті у виданнях, затверджених ВАК України, 1 стаття – у закордонному журналі, 2 статті у збірниках наукових праць, 10 тез, опублікованих у матеріалах з’їздів, симпозіумів та конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 129 сторінках машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, що включає описання матеріалів та методів, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел. Дисертація містить 14 таблиць та 11 рисунків. Список використаних джерел охоплює 182 найменування, з них 50 – кирилицею та 132 роботи латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження . Було досліджено матеріал від 78 пацієнтів з попереднім клінічним діагнозом одного з ССА, а саме: СВХ – 3 пацієнта, синдром „котячого крику” – 1 пацієнт, СВБ – 21 пацієнт, ССМ – 2 пацієнта, СПВ – 19 пацієнтів, с-м мікроделеції 22q11.2 – 31 пацієнт, синдром „котячого ока” – 1 пацієнт. Вік пацієнтів коливався від 10 днів до 12 років. Також було досліджено матеріал від 6 батьків та 4 членів родин пробандів.

Матеріалом дослідження були лімфоцити периферичної крові осіб з різних регіонів України, у яких з 1998 по 2006 рік під час медико-генетичного консультування та/або знаходження на лікуванні було запідозрено ССА. Пацієнти проходили консультування на кафедрі медичної генетики НМАПО імені П.Л. Шупика, у медико-генетичному центрі УДСЛ „ОХМАТДИТ”, у медико-генетичному відділенні Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, Дитячої клінічної лікарні №1 та знаходилися на лікуванні у 3-му та 4-му хірургічних відділеннях Інституту серцево-судинної хірургії ім. М.М.Амосова АМНУ, у відділенні новонароджених Науково-практичного медичного центру дитячої кардіології та кардіохірургії МОЗ України. При виявленні у пробандів структурних перебудов хромосом досліджували каріотип їх батьків.

Для вирішення поставлених завдань у генетичній лабораторії кафедри медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика було отримано та проаналізовано препарати хромосом метафазної і прометафазної конденсації у 78 пацієнтів з підозрою на ССА та у 6 батьків і 4 членів родин. Для отримання хромосом метафазної конденсації до культуральної суміші PBmax (Gibco) додавали по 0,5 мл цільної крові пробанда (по 0,4 мл крові від новонародженої дитини). Культивування проводили за стандартною методикою (Hungerfordetal., 1965).

Для отримання хромосом прометафазної конденсації додатково використовували метотрексат на 50-й годині культивування та 5-бром-дезоксиуридин на 67-й годині культивування (Зерова-Любимова, Горовенко, 2003). При дослідженні метафазних та прометафазних пластинок для ідентифікації хромосом та виявлення структурних перебудов використовували забарвлення за допомогою барвника Гімза на фосфатному буфері з рН 6,8 (GTG-метод) (Захаров и др., 1982) з попередньою обробкою трипсином. Метафазні та прометафазні пластинки для цитогенетичного аналізу відбирали за загальноприйнятими стандартами (Захаров и др., 1982; Зерова-Любимова, Горовенко, 2003).

Для проведення кількісної та якісної оцінки каріотипу хромосомні препарати після їхнього диференційного забарвлення аналізували за допомогою світлового мікроскопу ARISTOPLAN („Leica”) при збільшенні х1125. FISH-аналіз матеріалу від 71 пацієнта з підозрою на мікроструктурні зміни критичної ділянки досліджуваних хромосом 7, 15, 22 виконано у генетичній лабораторії кафедри медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика та, частково, в Інституті медичної генетики, Цюріх, Швейцарія, в межах спільного гранту (№7 IP 62652, 7 IP 051778). Препарати хромосом метафазної та прометафазної конденсації отримували за вищенаведеною методикою. Передгібридизаційну, гібридизаційну та післягібридизаційну обробку препаратів було проведено відповідно до стандартного протоколу, що рекомендовано фірмою-виробником ДНК-зондів. Для FISH-аналізу були використані локус-специфічні зонди.

Для ідентифікації мікроделецій в критичних ділянках хромосом 7q11.23, 15q11.2-q13, 22q11.2 отримані препарати аналізували за допомогою люмінесцентного мікроскопу Axioplan 2 (“Zeiss”), з 100-ватною люмінесцентною лампою та набором спеціальних фільтрів (DAPI/FITC/Rhodamine, “Zeiss”).

Запис результатів цитогенетичного аналізу та FISH-аналізу проводили згідно ISCN(1995, 2005).

Результати дослідження та обговорення

Стандартним цитогенетичним методом проаналізовано метафазні пластинки лімфоцитів периферичної крові від 74 пробандів Для 4 пацієнтів застосування стандартного цитогенетичного аналізу було неможливим внаслідок відсутності метафазних пластинок на хромосомних препаратах при неодноразовому повторі культивування матеріалу. У зв’язку з цим подальшу верифікацію діагнозу у цих пробандів проведено із застосуванням FISH-аналізу на інтерфазних ядрах. Також проаналізовано каріотип 6 батьків і 4 родичів пацієнтів.

Результати наведено в табл. 1

Таблиця 1

Співставлення попереднього клінічного та остаточного діагнозів з результатом стандартного цитогенетичного аналізу у пацієнтів з підозрою на ССА

Як видно із результатів, наведених у табл.1 у 6 пробандів з підозрою на ССА та одного пробанда з підозрою на ХП були виявлені типові зміни каріотипу, що дозволило одразу поставити остаточний діагноз. Так, у двох випадках із клінічними ознаками, характерними для СВХ, було підтверджено діагноз – СВХ. В обох випадках делеція охоплювала критичну для розвитку СВХ ділянку 4p16. У першого пацієнта ідентифіковано втрату близько двох третин короткого плеча хромосоми 4 – del(4)(p14.1). Дитина мала важкі ВВР та померла у віці 1 міс. Рання верифікація діагнозу дозволила провести медико-генетичне консультування батьків дитини з приводу планування подальшої вагітності. У другого пацієнта з характерною для СВХ, однак, менш виразною клінічною картиною виявлено делецію у ділянці 4p16.2 та підтверджено діагноз СВХ. У іншого пацієнта з підозрою на ХП виявлено мозаїчний варіант СВХ. Ймовірно, наявність del(4)(p16.2) лише в 50% клітин обумовила стерту клінічну картину, що не дозволило лікарю запідозрити СВХ. Таким чином, наші дослідження збігаються та підтверджують загально прийняте наукове поняття про те, що при СВХ розмір делетованої хромосомної ділянки корелює з фенотиповою картиною та важкістю перебігу захворювання (Zollino, 2000).

Дослідження каріотипу у одного пацієнта з підозрою на синдром „котячого крику” виявило делецію половини короткого плеча хромосоми 5 із залученням критичної ділянки 5р15.2. Отже, було підтверджено попередній клінічний діагноз. Діагноз дитині верифіковано у віці 1 року та 3 міс. Однією з причин того, що батьки дитини звернулися за медичною допомогою, окрім розумового відставання дитини, була наявність у пробанда ВВС, а саме - відкритого артеріального протоку. Наші дані збігаються з літературними (Marinescuetal., 1999), згідно яких клінічна картина при синдромі „котячого крику” не корелює з розміром інтерстиціальної делеції.

Вперше в Україні стандартним цитогенетичним методом підтверджено попередній діагноз ССМ у двох пацієнтів. Обидва пробанди мали типовий для ССМ фенотип, який і дозволив запідозрити наявність цього синдрому. В той же час, поведінка дітей не була характерною для ССМ, однак, враховуючи їхній ранній вік на момент обстеження, можливо припустити, що характерні ознаки можуть з’явитися пізніше. Особливістю нашого дослідження було те, що обидві пацієнтки мали ВВС, які за даними деяких авторів зустрічаються лише у третини хворих з ССМ (Wongetal., 2003). В одному з цих випадків ВВС потребував оперативної корекції. За даними аналізу літератури це п’ятий випадок опису тетради Фалло при ССМ (Myersetal., 2004). Згідно GirirrajanS., ВВС зустрічаються серед пробандів із делецією короткого


8-09-2015, 19:29