МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
Український інститут клінічної генетики
Харківського державного медичного університету
Новікова Ірина Володимирівна
УДК: 616-074.614.254.575
Вільні амінокислоти крові в діагностиці спадкових
хвороб обміну у дітей високого генетичного ризику
03.00.15 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Харківській медичній академії післядипломної освіти МОЗ України.
Науковий керівник:
член-кореспондент АМН України,доктор медичних наук, професор
Гречаніна Олена Яківна,Харківський державний медичний університет
МОЗ України, завідувач кафедри медичної генетики, Український інститут клінічної генетики Харківського державного медичного університету, директор, м. Харків.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Гнатейко Олег Зиновійович,
Державна установа “Інститут спадкової патології АМН України”,
директор, м. Львів;
доктор медичних наук, доцент Галаган Віра Олексіївна,
Українська дитяча спеціалізована лікарня “ОХМАТДИТ” МОЗ України, завідувач медико-генетичним центром, м. Київ.
Захист відбудеться “18” лютого 2008 р. о 15.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради K 64.600.05 в Українському інституті клінічної генетики Харківського державного медичного університету МОЗ України за адресою: 61022, м. Харків, проспект Правди 13.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського державного медичного університету: 61022, м. Харків, проспект Леніна 4
Автореферат розісланий “26” січня 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради, к. мед. н. Л.С.Озерова
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Спадково обумовлена патологія набуває все більшої питомої ваги серед захворювань людини (Гречаніна О.Я, 2005, Хоффманн Г., 2005, Blau N., 2003, Новіков П.В., 2002). Частота виявлення генетичних захворювань у різних країнах коливається від 82 до 39,7 на 1000 живонароджених (Christianson A., 2006). Навіть при недосконалій системі діагностики в Україні, у 26 з 1000 новонароджених реєструється генетична патологія, а в кожного 7 з 1000 - інвалідність обумовлена генетичними причинами (Моісеєнко Р.О., 2002). Частота окремих нозологічних форм коливається в межах від 0,5 до 1,4% (Богатирьова Р.В., Гречаніна О.Я., 2003). Одночасно із цим відзначається зростання генетичного вантажу в людських популяціях: у 70-і роки обсяг генетичного вантажу з екстраполяцією на весь період життя становив 10,5%; у 2000-му році він збільшився до 74% (Гречаніна О.Я., 2004, Алтухов Ю.П., 2003).
Вивчення вроджених метаболічних захворювань (МЗ) розпочалося з відкриття Гарродом А. алкаптонурії на початку 20-го сторіччя. З того часу була накопичена велика кількість інформації щодо клініки й діагностики МЗ. У 1999 році ВООЗ оголосила генетичні захворювання і МЗ пріоритетним напрямком системи охорони здоров’я майбутнього. Кількість вроджених помилок метаболізму постійно зростає. На початку 21 сторіччя було описано біля 8000 МЗ (Shin Y.S., Podskabi T.,2003). У восьмому виданнi посібника “The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease” міститься інформація більше ніж про 50000 вроджених помилок метаболізму (Hoffmann J., et al., 2006).
Загальна частота МЗ у європейських популяціях дорівнює 1%. Серед пацієнтів педіатричних клінік МЗ виявляють більше ніж у 5 % (Shin Y.S., Podskabi T.,2003). У період новонародженості проявляється біля 25% МЗ, що не діагностовано й майже всі вони відрізняються тяжкістю стану дитини, нагадуючи нейроінфекції та нейродистрес-синдром (Бєлоусова О.Д, Ніколаєва О.О., 2000). За даними метаболічних центрів Західної Європи різні МЗ виявляють у 0,15-2,5% новонароджених в залежності від рівня діагностики (Stockler-Ipsiroglu S. еt al.,2004, Muntau A., Schulze A.2004, Хоффманн Г, 2005).
Мутації призводять до патохімічних порушень, унаслідок яких формується клінічний і біохімічний фенотип МЗ (Blau N.,1996, 2003, Гречаніна О.Я.,2003, 2004). МЗ проявляються порушеннями з боку різних органів і систем та маніфестують у будь-якому періоді життя, від плода до похилого віку (N.Blau, 2003, Hoffmann G.,2002, Гречаніна О.Я,2007). Більшість МЗ маскуються під зовні легкими формами, але нагадати про себе вони можуть після перенесених травм, інфекцій, операцій, метаболічної кризи, призводячи до важких клінічних наслідків, часто незворотних (Zschocke J., Hoffmann G., 1999, Гречаніна О.Я., 2001, 2004).
У сумі МЗ не є рідкісними, вони стають більш поширеними й усе частіше потребують медичної допомоги, часто впродовж усього життя (N.Blau, M.Duran та ін., 2003). Метаболічна медицина розвинулась із спеціалізованої діяльності лікарів і науковців, спрямованої на науковий пошук та індивідуальний підхід до сім’ї, що включав фахівців різних медичних та “споріднених” спеціальностей (Hoffmann J., et al., 2006). Розробка та впровадження сучасних генетичних технологій є складовою частиною діагностики спадкових захворювань (Гречаніна О.Я, 2002, 2005, Гнатейко О.З., 2002, Бариляк І.Р., 2002, Моісеєнко Р.О, 2002, Кузьмічова Н.О., Калінєнкова С.Г., Новіков П.В., 2002). Науковий і технологічний прогрес та впровадження сучасних досягнень науки в діагностику спадкових помилок метаболізму принесуть велику користь пацієнтам та допоможуть попередити тяжкі ускладнення патології (Hoffmann J.F., Lindner M., Shahbek N., Bariж I., Al Thani G.Hoffmann G.F., 2006).
Спадкові порушення обміну амінокислот (СПО АК) як однієї з ланок патології проміжного обміну, займають провідне місце серед МЗ. Одним з ускладнень СПО АК є затримка розумового розвитку у 20% випадків (Тьоміна П.А., Казанцева Л.З., 2001). Ця обставина змусила вчених розробити новий напрямок у профілактичній медицині – програми масового й селективного скринінгу для виявлення МЗ (Краснопольська К.Д., 1997, 2005, Harvey L., Levy M.D., 2000, Hoffmann G., 2002, 2006). Окремо взяті біохімічні показники не несуть повне інформативне навантаження про наявність тієї або іншої патології, але якщо додати оцінку клінічних ознак, можна розраховувати на визначення кореляції між ними, тобто отримати дані про причетність біохімічних розладів до порушень морфогенезу при МЗ. У більшості випадків тільки поєднана інтерпретація всіх отриманих результатів надасть можливість точно визначити форму захворювання (Краснопольська К.Д. 1997, 2005). ХХ сторіччя було чудовою епохою для вивчення метаболізму й генетики, і ця тенденція підтримується на високому рівні й у нашому сторіччі. Для проникнення в сутність біохімічних порушень необхідно розвивати нові технології, а їх використання вимагає постійного переосмислення одержаної інформації (Hoffmann G., 2005). Визначення патологічних метаболітів у поєднанні з клінічними проявами патологіївказує на актуальність запропонованої роботи.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Харківського державного медичного університету та Харківської медичної академії післядипломної освіти: "Напрямок сучасної діагностики, патогенетичної терапії та трьохрівневої профілактики спадкової патології" № 0106U001640, у рамках міжвідомчої комплексної програми „Здоров’я нації” на 2002-2011 рр., додатку до Національної Програми “Діти України”, затвердженої наказом Президента України №42/2001 від 24.01.2001. У рамках зазначених тем автором проводився аналіз результатів клінічного обстеження дітей з підозрою на спадкові порушення метаболізму, дослідження рівня вільних АК крові методом високоефективної рідинної хроматографії, статистична обробка та аналіз отриманих результатів.
Мета і задачі дослідження. Визначення діагностичної значимості кількісного аналізу вільних амінокислот крові в поєднанні з оцінкою фенотипу у виявленні спадкових порушень обміну в дітей.
Виходячи із загальної мети роботи, були поставлені наступні завдання:
1. Визначити кількісний вміст вільних АК крові у здорових дітей у популяції Харківського регіону.
2. Дослідити рівні вільних АК крові в дітей різного віку з клінічними ознаками МЗ.
3. Провести порівняльну оцінку фенотипу дітей з клінічними ознаками метаболічних порушень та контролю.
4. Провести співставлення біохімічного та клінічного фенотипів дітей з ознаками МЗ.
5. Визначити спектр СПО, які поєднуються з підвищеним рівнем АК крові у дітей з клінічними ознаками МЗ.
Об'єкт дослідження – діти із СПО АК .
Предмет дослідження – рівні вільних АК крові та клінічні маркери СПО АК.
Методи дослідження: біохімічний аналіз АК з використанням високоефективної рідинної хроматографії, клініко-генеалогічний (сомато-генетичне дослідження родини); статистичні методи.
Наукова новизна отриманих результатів. Визначені і кількісно характеризовані рівні вільних АК крові у здорових дітей і дітей з ознаками МЗ у популяції Харківського регіону. Визначено умови проведення аналізу вільних АК крові, включаючи підготовку зразків для дослідження, хроматографічне поділення й аналіз отриманих даних. Вивчено фенотипові особливості в сполученні із вмістом вільних АК крові в дітей з клінічними ознаками МЗ. Визначено спектр СПО АК у дітей, родини яких звернулися за медико-генетичною допомогою до Харківського спеціалізованого медико-генетичного центру (ХСМГЦ). Показано можливість ранньої діагностики СПО АК за умови використання клініко-біохімічного підходу.
Розроблена й впроваджена система клініко-біохімічного підходу в діагностиці СПО АК, що дозволило збільшити кількість верифікованих нозологічних одиниць. На підґрунті комплексної оцінки клінічних і біохімічних показників були виявлені фенотипові особливості в дітей з підвищеним рівнем деяких АК крові: глютамінової кислоти (ГЛУ); гліцину (ГЛІ); аланіну (АЛА); проліну (ПРО). Встановлено особливості фенотипу дітей із СПО АК.
Практичне значення отриманих результатів. Упроваджений кількісний аналіз вільних АК крові з використанням високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) в практику медико-генетичного консультування. Урахування результатів дослідження рівнів вільних АК разом з результатами оцінки фенотипу дитини з ознаками МЗ надає можливість підвищити ефективність діагностики МЗ; збільшити кількість верифікованих нозологічних одиниць. Використання рівнів вільних АК крові, що були розраховані на підґрунті кількісного аналізу АК у дітей в популяції Харківського регіону, дозволило підвищити ступінь інформативності отриманих даних. Використання клініко-біохімічного підходу до обстеження дітей групи високого генетичного ризику дозволяє проводити адекватне генетичне консультування на основі лабораторно підтвердженого діагнозу.
Аналіз фенотипу, стану різних органів і систем у поєднанні з кількісним аналізом АК при медико-генетичному консультуванні дозволяє діагностувати не тільки СПО АК, а й підійти до уточнюючої діагностики інших порушень проміжного обміну. Визначення індивідуального вмісту вільних АК надає можливість проводити патогенетичну терапію й контроль за лікуванням.
Результати дослідження використовуються в роботі ХСМГЦ, Криворізького Центру медичної генетики та пренатальної діагностики, відділення дитячої психоневрології та клінічної нейрогенетики інституту неврології, психіатрії та наркології АМНУ; кафедр педіатрії та клінічної генетики, медичної біології, генетики та гістології Буковинського державного медичного університету, Державної установи “Науково-дослідного інституту медико-екологічних проблем” МОЗ України, що підтверджено відповідними актами про впровадження.
За матеріалами дисертації отримано один патент України на винахід (№24837), видано три методичні рекомендації, які використовуються в педагогічному процесі при підготовці лікарів різного фаху.
Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно складений план дослідження, проведений пошук, збір та аналіз літератури вітчизняних та зарубіжних авторів з питань діагностики спадкових МЗ, проаналізовані існуючі методи досліджень та відібрані найбільш актуальні; проведено дослідження рівнів вільних АК крові в дітей різних вікових категорій з використанням ВЕРХ; проаналізовані результати клініко-генеалогічного обстеження сімей, що мають дітей з ознаками МЗ і знаходяться на обліку в ХСМГЦ. Для оцінки фенотипу дітей з ознаками МЗ і статистичної обробки результатів клінічного обстеження й лабораторного дослідження розроблено карти на базі генетичної, що використовується для медико-генетичного консультування сімей в ХСМГЦ; визначені показання до дослідження рівня вільних АК у дітей з ознаками МЗ. Дисертантом було проведено зіставлення результатів клінічного обстеження й лабораторного дослідження та визначені клінічні ознаки, що поєднуються з підвищеним рівнем деяких АК. Дисертант особисто виконала науковий аналіз отриманих результатів та їх статистичну обробку.
Апробація результатів дисертації. Основні положення й результати дисертації були представлені та обговорені на Міжнародному Форумі “Відродження можливе, якщо…” (Харків, 1998); 2 Конгресі “Плід як частина сім’ї (Харків, 2000); конференції молодих вчених “Медицина третього тисячоліття ” (Харків, 2001), семінарі, присвяченому проблемам дієтотерапії при фенілкетонурії (Київ, 2001), Українсько-Баварському симпозіумі невропатологів (Київ, 2001), 8-му Європейсько-Азіатському об’єднаному Конгресі з метаболічних порушень, (Вільнюс, 2002); 3-му з’їзді медичних генетиків України (Львів, 2002); I та II Українському Конгресі з міжнародною участю “Метаболічні захворювання” (Харків, 2003,2005), міжнародній конференції з медичної генетики “Плід як частина сім’ї” (Харків, 2007); V Європейському Конгресі з неонатального скринінгу ISNS (Рейк’явік, Ісландія, 2007); науково-практичній конференції з міжнародною участю “Актуальні питання медичної генетики” (Київ, 2007); Міжнародному Конгресі з метаболічних захворювань (Гамбург, Німеччина, 2007).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 31 наукову працю, з них 12 статей у наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, 5 статей написано без співавторів, 1 патент, 18 – тез конгресів, симпозіумів, конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, трьох розділів отриманих результатів, заключення, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел. Робота викладена на 154 сторінках комп’ютерного друку, ілюстрована 35 таблицями та 18 малюнками. Перелік літературних джерел нараховує 235 джерел: 135 кирилицею, 100 – латиною, що складає 18 сторінок.
Основний зміст роботи
Матеріали та методи дослідження. Для дослідження рівнів вільних АК у дітей, що мешкають у м. Харкові та Харківській області, був безвибірково проведений аналіз вільних АК крові 165 дітей з клінічними ознаками МЗ і 26 дітей, які станом на час обстеження були здоровими.
Для вивчення клінічного й біохімічного фенотипів дітей з ознаками СПО АК проведено обстеження 88 родин – основна група (ОГ). Усі вивчені родини ОГ були поділені на 3 підгрупи. Першу ОГ (1ОГ) склали родини, що мають дітей зі спадковим порушенням обміну АК, N=28 (середній вік - 4,2±0,7 роки); другу ОГ (2 ОГ) - діти із клінічними ознаками МЗ, що супроводжувалась ГААЕ, N=36 (4,3±0,7 роки); третю ОГ (3ОГ) - діти із клінічними ознаками МЗ при відсутності підвищення рівнів вільних АК крові, N=24 (7,7±1,1 років).
Контрольну групу (КГ) склали 20 родин, що мають дітей, які на час обстеження були здоровими (7,4±0,7 років).
Клініко-лабораторне обстеження сімей було проведене на базі ХСМГЦ. Збір інформації проводився лікарями-генетиками ХСМГЦ, відповідно до генетичної карти, прийнятої при медико-генетичному консультуванні. Для клініко-статистичного аналізу результатів обстеження родин на основі генетичної була розроблена карта, що включала 150 ознак. При оцінці фенотипу контролювали наявність патологічних змін і малих аномалій розвитку (МАР). Сума МАР для кожної дитини була представлена як "інтегральний показник", були виділені найбільш інформативні ознаки.
Дослідження рівнів вільних АК крові проводили на амінокислотному аналізаторі (Waters: 486 детектор, 717 аутосамплер, 2 насоси високого тиску Waters 510, хроматографічна колонка із зворотною фазою 3,9х30 см, США). Метод включав доколонну дериватизацію АК з фенілтіоізоціанатом (метод PІCO TAG). Поділення фенілтіокарбамілових похідних АК проводили на аналізаторі з використанням зворотно-фазної ВЕРХ та градієнту концентрацій розчинників (KruggW.G.1985, Cohen,S.A. etal., 1994). Швидкість потоку розчинників складала 1 мл/хв. Детекцію результатів проводили з використанням абсорбційного детектора при л=254 нм. Кількісний розрахунок рівнів вільних АК проводили на ПЕОМ з використанням програмного забезпечення “Millenium”, США. Відповідні контрольні й стандартні розчини АК включали в кожну серію зразків. Збір зразків крові проводили методом венепункції натщесерце. У дітей першого року життя забір крові проводили через 3-4 години після останнього годування (перед черговим прийняттям їжі).
Статистичний аналіз даних, які отримали, проводили відповідно до інформативних методів розрахунку емпіричних даних, що включав параметричні і непараметричні, а також кореляційний методи аналізу. Вибірки значень, що досліджувались, перевірені на несприятливість результатів спостережень. Результати дослідження підлягали обробці з використанням критеріїв 
, Стьюдента, таблиць сукупності ознак. З огляду на те, що ознаки, внесені до карти, були описовими (наприклад, блідість шкірних покривів, м'язова гіпотонія тощо) у роботі застосований ранговий коефіцієнт кореляції Спірмена. Математичну обробку основних показників проводили на ЕОМ БЕСМ-6 обчислювального центру НВО "Хартрон". На підґрунті лінійних комбінацій був використаний дисримінантний аналіз і розраховані класифікаційні коефіцієнти. Ротаційний метод (Варімакс із нормуванням Кайзера) і екстракційний метод (принциповий аналіз компонентів) були використані для зіставлення результатів оцінки фенотипу й дослідження рівня вільних АК крові. Статистичний аналіз з використанням програми SPSS8 був проведений разом з педіатром ХСМГЦ І.Г.Гольдфарбом, пам’яті якого автор низько вклоняється.
Результати дослідження та їх обговорення. Визначені рівні вільних АК крові дітей з ознаками МЗ і здорових дітей у популяції Харківського регіону (табл.1). На підґрунті результатів дослідження рівнів вільних АК з використанням ВЕРХ було отримано карти розподілу для 34 АК, визначено розбіжності у їх вмісті залежно від віку й виділено 4 вікові категорії. Першу категорію склали діти до 1 місяця життя, середній вік яких становив 0,1±0,01 (4,3 % спостережень); другу категорію - від 1 місяця до 1 року життя, середній вік - 0,44±0,04 (21,6%); третю - від 1 року до 6 років, середній вік - 3,12±0,2 (34,6%); четверту - від 6 до 16 років, середній вік – 10,9±0,4 (28,6%). Вік дітей, які на час обстеження були здоровими, становив старше 6 років, середній вік – 10,2±0,5.
При порівнянні результатів дослідження вільних АК крові здорових дітей і дітей 4 вікової категорії відзначено: зменшення рівня б–аміноадипінової кислоти на 64%, цистіну - на 27,2%; збільшення коефіцієнту співвідношення метіонін/цистін на 69,8%, наявність в-аміноізомасляної кислоти у кількості 7,4±2,6 мкмоль/л (Р<0,05). Ураховуючи, що шлях метаболізму метіоніну через гомоцистін із наступним перетворенням у цистін є піридоксальзалежним, дефіцит піридоксину може бути однією із причин зниження рівня цистіну. З лізину в пероксисомах печінки утворюється піпеколінова кислота, та б–аміноадипінова кислота в присутності вітаміну B6 і б-кетоглутарату. Можна вважати, що зниження рівня б–аміноадипінової кислоти є наслідком недостатнього надходження лізину із їжею або порушення функції пероксисом. Тіамін, що звільнюється при деградації РНК і ДНК, включається в метаболічний шлях утворення в-аміномасляної кислоти. Ці дані свідчать на наявність в-аміно- ізомасляної кислоти в крові дітей з ознаками МЗ можливо, у результаті підвищеної деградації РНК унаслідок порушення епігенетичної регуляції.
Таблиця 1
Рівні вільних АК крові здорових дітей і дітей
8-09-2015, 19:08