Ефекти, обумовлені введенням у клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну А-1 людини

Експресія гена АРОА1 стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1. Для порівняння сили промоторів, крім транзиторної експресії трансгена у низці випадків досліджують експресію у пулі стабільно трансфікованих клітин (Xiaetal., 2006). Це дозволяє вилучити з аналізу клітини, в які при трансфекції не потрапив цільовий ген. З іншого боку, оскільки експресія трансгена відбувається з інтегрованих векторних послідовностей її рівень залежить від „ефекту положення”. Для зменшення впливу ефекту положення трансгена на рівень його експресії, досліджується експресія пулом стабільно трансфікованих клітин, а не окремими клонами.

Для дослідження синтезу АРОА1 людини у стабільно трансфікованих клітинах було проведено трансфекцію клітин СНО-К1 препаратами ДНК/ПЕІ з плазмідами: pTRhCMV-IEapo neo^R , pTRC AG apo neo^R та pTRhCMV-I A apo neo^R . Трансфіковані клітини відбирали на селективному середовищі, яке містило антибіотик G418. Після двох тижнів селективного відбору клітин, які були трансфіковані окремо кожною з плазмід, отримано не менш ніж 100 клонів стабільно трансфікованих клітин.

Оскільки селекцію клітин після трансфекції проводили лише за геном neo^R , важливо було встановити наявність гена АРОА1 людини в трансфікованих клітинах. Наявність трансгена визначали в пулі трансфікованих клітин ампліфікацією з різної кількості тотальної ДНК. При цьому визначали мінімальну кількість тотальної ДНК, продукт ампліфікації якої ще виявляли за допомогою електрофорезу. Встановлено, що різні пули стабільно трансфікованих клітин містять приблизно однакову кількість копій АРОА1 людини на клітину (рис. 3).

Для порівняння рівня експресії трансгена з різних регуляторних елементів у пулах стабільно трансфікованих клітин у чашки Петрі переносили по 1·10⁶ клітин, отриманих для кожної з одержаних рекомбінантних плазмід. Через добу середовище замінювали на безсироваткове, а через дві доби відбирали для аналізу. Аналіз проводили для пулів стабільно трансфікованих клітин (надалі стабільно трансфіковані клітини). Вміст АРОА1 у культуральному середовищі визначали методом ELISA (рис. 4).

Кількісний аналіз вмісту АРОА1 у культуральному середовищі проводили також Вестерн-блот аналізом (рис. 5). Встановлено, що рівні експресії гена АРОА1 людини клітинами, трансформованими pTRhCMV-IEapo neo^R , pTR CAG apo neo^R та pTRhCMV-I A apo neo^R , становили 156 нг/мл, 253 нг/мл та 634 нг/мл, відповідно. Одержані результати свідчать, що стабільно трансфіковані клітини СНО-К1, які були отримані для плазмід pTR CAG apo neo^R та pTRhCMV-I A apo neo^R , забезпечують вірогідно вищий рівень синтезу трансгена, порівняно з рівнем отриманим для pTRhCMV-IEapo-neo^R .

Аналіз тривалості знаходження трансгена АРОА1 людини in vivo . Важливим етапом при розробці генно-терапевтичних підходів до корекції генетичних дефектів людини є проведення експериментів на тваринах для встановлення таких характеристик системи доставки трансгена, як специфічність, ефективність, безпечність та інші.

Виходячи з результатів, одержаних на культурі СНО-К1, плазміда pTRhCMV-I A apo забезпечує найвищий рівень експресії гена АРОА1 людини порівняно з іншими сконструйованими нами плазмідами. Однак, із даних літератури відомо, що характер експресії з промоторів може відрізнятись для різних типів клітин, та для досліджень in vitro та in vivo (Xuetal., 2001; Xuetal., 2002). Тому, проводити вибір рекомбінантної плазміди для розробки підходу до ГТ атеросклерозу можливо лише після досліджень in vivo . Крім того, невідомо, який рівень експресії цільового білка можливо забезпечити запропонованим нами методом генно-терапевтичної корекції дефіциту АРОА1 людини in vivo та чи достатній цей рівень для отримання очікуваного терапевтичного ефекту. Тому перші експерименти на тваринах in vivo нами проводились з метою дослідження як характеристик запропонованої нами системи доставки трансгена (тривалість зберігання трансгена, його локалізація в організмі), так ідля вивчення можливого рівня експресії гена АРОА1 людини в організмі кролів та здійснювався з використанням базової плазміди – pTRhCMV-IEapo.

Для дослідження тривалості знаходження трансгена АРОА1 людини, в організм піддослідних тварин ін’єкцією в паренхіму печінки вводили препарат плазміди pTRhCMV-IEapo . При цьому кількість плазмідної ДНК, яку вводили тваринам (щур – 100 мкг, кріль – 240 мкг), була максимально можлива для цього методу, та обмежена сумарним об’ємом препарату, який можливо ввести в паренхіму печінки тварин без видимих її пошкоджень. Тривалість зберігання трансгена в організмі аналізували за його наявністю у фракції тотальної ДНК тканин печінки через різні проміжки часу після введення плазміди pTRhCMV-IEapo . Аналіз проводили методом «nested» ПЛР з використанням пар праймерів Ap-f/Ap-r, Ap(n)-f/Ap(n)-r та Ap(h-Rab)-f/Ap(h-Rab)-r, Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r), розрахованих нами для виявлення ДНК АРОА1 людини на фоні тотальної ДНК клітин щура та кроля, відповідно (Гільчук та співав., 2006).

Ген АРОА1 людини виявлено в клітинах печінки всіх щурів піддослідної групи на 3-ю та 25-у добу після ін’єкції, у той час, як при подальшому аналізі на 90-у добу, трансген не виявлений в усіх проаналізованих тварин (табл. 1). Одержаний результат може свідчити про те, що у зазначений період часу після ін’єкції препарату ДНК/ПЕІ відбуваються процеси, що призводять або до зменшення у клітинах плазмідної ДНК до рівня, який нижчий за чутливість методу аналізу, або до загибелі трансфікованих клітин. Варто зазначити, що в усіх випадках трансген виявляли лише за результатом другого раунда ампліфікації, однак при цьому спостерігали гетерогенність проб за кількістю синтезованого амплікону та за наявністю чи відсутністю продукту першого раунда ампліфікації.

Таблиця 1

Тривалість знаходження трансгена АРОА1 у тотальній ДНК клітин печінки щурів, визначена методом « nested » ПЛР

Дослідження наявності гена АРОА1 людини у тотальній ДНК клітин печінки кролів виявило тривале збереження цільової ДНК в клітинах (табл. 2). Так, трансген виявляли і на 85-у добу після введення ДНК, в той час, як на 150-у добу АРОА1 людинине детектували. Через годину після введення плазмідної ДНК у паренхіму печінки трансген був детектований у першому раунді «nested» ПЛР, в той час, як в усі наступні часові періоди його наявність детектували за продуктами другого раунда ампліфікації. При цьому не спостерігали значної гетерогенності за кількістю продуктів ампліфікації, що можна значною мірою пояснити особливістю аналізу наявності гена АРОА1 людини саме з використанням пар праймерів Ap(h-Rab)-f/Ap(h-Rab)-r та Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r: було показано інгібування другого раунда ПЛР з використанням прймерів Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r при більшій за 10⁶ кількості копій цільової ДНК у реакційній суміші.

Таблиця 2

Тривалість знаходження трансгена АРОА1 у тотальній ДНК клітин печінки кролів, визначена методом « nested » ПЛР

Встановлення локалізації введеного трансгена in vivo. Дослідження розповсюдження плазмідної ДНК в органах піддослідних тварин проводили на щурах та кролях, яким ін’єкцією в паренхіму печінки вводили препарат ДНК/ПЕІ. Тварин забивали на 6-у та 85-у добу після ін’єкції плазміди pTRhCMV-IEapo . Для проведення аналізу відбирали у щурів проби тканин печінки, серця, легенів та нирок, а у кролів, окрім цих органів − також лімфатичні вузли та стінку аорти.

За допомогою підібраних для кожної з тварин наборів праймерів проведено «nested» ПЛР аналіз наявності гена АРОА1 людини у тотальній ДНК, що була виділена з тканин різних органів щурів та кролів. За результатами другого раунда «nested» ПЛР встановлено наявність трансгена в усіх проаналізованих зразках тканин тварин (табл. 3) (чутливість «nested» ПЛР у присутності ДНК щура 10 копій гена АРОА1 людини/500 нг ДНК, у присутності ДНК кроля − 10³ копій гена/500 нг ДНК). Це свідчить про ефективність доставки плазмідної ДНК ін’єкцією in vivo у складі комплексів ПЕІ/ДНК.

Таблиця 3

ПЛР аналіз розповсюдження в організмі піддослідних тварин гена АРОА1 після введення плазмідної ДНК

Примітки: + трансген виявлено; –трансген не виявлено; н/п – дослідження не проводили.

Результати аналізу локалізації трансгена in vivo показали, що частина плазмідної ДНК, яку було введено в печінку, потрапляє з міжклітинною рідиною та лімфою, або через капіляри з венозною кров’ю, у кровообіг, і таким чином, розповсюджується по організму. Але в даному випадку, методом ПЛР, важко визначити, чи потрапляє плазмідна ДНК у клітини тканин інших органів (серце, легені, нирки, лімфовузли), чи виявляється лише плазмідна ДНК, яка знаходиться у крові в капілярах цих органів або у клітинах ендотелію судин. Звичайно, при локальному введенні плазмідної ДНК з катіонними ліпідами спостерігають зберігання переважної кількості трансгена біля місця введення (Eliyahuetal., 2007), що з високою вірогідністю вірно і для комплексів ДНК/ПЕІ. Однак, використаний нами для аналізу локалізації трансгена метод «nested» ПЛР, з метою підвищення чутливості аналізу, не дозволяє робити висновок щодо кількісного розподілу введеної плазміди та відображає лише якісно здатність трансгена потрапляти до певних тканин організму після введення плазміди запропонованим нами методом.

Дослідження синтезу АРОА1 та очікуваного терапевтичного ефекту при повторних введеннях плазміди pTRhCMV-IEapo тваринам. Вивчення ефектів, обумовлених введенням трансгена АРОА1 людини in vivo здійснювали на експериментальній моделі атеросклерозу, яку одержували при утримуванні кролів на холестериновій дієті. Відомо, що метаболізм ліпопротеїдів кролів більш подібний до метаболізму людини порівняно з метаболізмом мишей та щурів (Moghadsianetal., 2001). Саме тому кролі з експериментально індукованим атеросклерозом є адекватною моделлю для вивчення ефектів від введення трансгена людини на метаболізм ліпопротеїдів та сприйнятливості до атеросклерозу. При утриманні кролів на холестериновій дієті вже на другий тиждень спостерігається зростання вмісту холестерину у крові піддослідних тварин і надалі таке зростання продовжується щонайменше 4 місяці (Цинциадзе и соавт., 1981). Це призводить до гістологічних та морфологічних змін тканин органів, зокрема: печінки, легенів, нирок, серця, стінок судин та інших. Виходячи з вищезазначеного, у даній роботі аналізували вплив введення у складі комплексів з ПЕІ трансгена АРОА1 людинина вміст тотального холестерину у плазмі крові, морфологію тканин печінки, серця та стінки аорти у кролів з експериментально індукованим атерослерозом.

Досліди проводили на кролях, які були поділенні на дві групи: тваринам першої групи (n=4) тричі вводили плазміду pTRhCMV-IEapo , дотримуючись проміжку один місяць між ін’єкціями; другій, контрольній, групі (n=4) вводили плазміду pTR , що не містить цільовий ген за такою ж схемою. Після першого введення плазмідної ДНК всіх кролів утримували на холестериновій дієті. На шосту добу після кожного введення препарату плазмідної ДНК у тварин відбирали кров для аналізу наявності АРОА1 людини. Одночасно визначали концентрацію тотального холестерину у плазмі крові тварин.

Для імунохімічного визначення вмісту АРОА1 людини у плазмі крові піддослідних кролів досліджували специфічність комерційних моноклональних та поліклональних антитіл проти АРОА1 людини та оптимізували метод Вестерн-блот аналізу.

З використанням методу Вестерн-блот аналізу на шосту добу після першої ін’єкції препарату ДНК/ПЕІ в плазмі крові трьох тварин першої групи було виявлено АРОА1 людини, в той час, як у плазмі тварин контрольної групи він не визначався (рис. 6). Порівняння рівнів експресії трансгена показало, що концентрація АРОА1 людини в плазмі крові відрізнялась від тварини до тварини і становила від ~ 1,6 мкг/мл до ~ 20,2 мкг/мл.

Аналіз зростання рівня тотального холестерину у плазмі крові тварин виявив достовірні розбіжності між контрольною та піддослідною групами тварин (табл. 4, рис. 7).

Таблиця 4

Зростання рівня холестерину у кролів, яким вводили плазміди, %

Попередні результати морфологічного дослідження тканин кролів контрольної групи виявило потовщення інтими у ділянці дуги аорти, а у тканинах печінки − інфільтрацію ліпідами різного ступеня в центральних та периферійних зонах органа. У той же час аналіз тканин кролів, яким водили плазміду pTRhCMV-IEapo , не виявив атеросклеротичних змін аорти та печінки тварин (рис. 8).

ВИСНОВКИ

У результаті виконання дисертаційної роботи досліджено експресію трансгена АРОА1 людини, розміщеного у векторах експресії під регуляцією різних промоторів, у клітинах ссавців in vitro ; вивчено тривалість збереження, локалізацію та експресію трансгена in vivo , що був введений ін’єкцією у паренхіму печінки тварин у складі комплексу плазміди pTRhCMV - IEapo з ПЕІ.

1. Вперше сконструйовано серію рекомбінантних плазмід, які містять повнорозмірний варіант гена АРОА1 людини під транскрипційним контролем промоторів hCMV-ІA та CAG:pTRhCMV - IAapo , pTRCAGapo , які, здатні забезпечити високий рівень експресії трансгена в клітинах ссавців.

2. У транзиторній системі експресії для трансфікованих плазмідами pTRhCMV - IEapo та pTRhCMV - IAapo клітин СНО-К1 показано синтез АРОА1 людини на рівні ~ 0,4 нг/мл і ~ 3 нг білка/мл середовища, відповідно.

3. На культурах стабільних трансформантів СНО-К1 підтверджено, що гібридні промотори hCMV-ІA та CAG забезпечують вищий рівень експресії АРОА1 людини порівняно з промотором hCMV-ІЕ.

4. Експериментально показано можливість підвищення рівня експресії трансгенів, які є повнорозмірними геномними варіантами, введенням до складу елементів регуляції транскрипції послідовності інтрону.

5. Продемонстровано, що трансген, введений в організм піддослідних тварин ін'єкцією у паренхіму печінки у складі комплексів плазміди з розгалуженим поліетиленіміном, може потрапляти крім печінки до тканин інших органів, зокрема: легенів, серця, нирок, лімфовузлів та клітин стінки аорти.

6. Встановлено збереження трансгена у клітинах печінки щурів та кролів щонайменше 25 діб та 85 діб у разі введення цільової ДНК ін'єкцією у паренхіму печінки у комплексі з поліетиленіміном.

7. На 6-ту добу після трансфекції плазмідою pTRhCMV - IEapo показано накопичення АРОА1 людини на рівні 1,6-20 мкг/мл у плазмі крові кролів.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гільчук Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К., Кордюм В. А. Вивчення транзиторної експресії гена АРОА1 людини під регуляцією різних гібридних послідовностей в клітинах СНО-К1 // Біополімери і клітина. – 2006. – Т. 22, № 3. – С. 210–217. Особистий внесок здобувача – конструювання рекомбінантних плазмід; визначення рівня синтезу АРОА1 людини клітинами СНО-К1, трансфікованими препаратами ДНК/ПЕІ; ПЛР аналіз трансгена.

2. Гільчук Ю. М., Іродов Д. М., Старокадомський П. Л., Пішель І. М., Топорова О. К., Новікова С. М., Кордюм В. А. Розповсюдження по органам та експресія гена АРОА1 людини у складі введеної плазмідної ДНК in vivo // Біополімери і клітина. – 2006. – Т. 22, № 6. – С. 439 – 445. Особистий внесок здобувача – оптимізація умов проведення ПЛР аналізу гена АРОА1 людини в ДНК трансфікованих клітин кролів та свиней; виділення РНК із зразків печінки кролів; ПЛР аналіз ДНК тканин піддослідних тварин; тестування специфічності зв’язування моноклональних та поліклональних антитіл до АРОА1 людини у плазмі крові різних тварин методом Вестерн-блот аналізу; детекція АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів.

3. Гільчук Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К., Кордюм В. А. Експресія гена аполіпопротеїна А-1 людини під контролем різних регуляторних послідовностей стабільними трансформантами СНО-К1 // Доповіді академії наук України. – 2007. – Т. 23, № 4. – С. 169–172.Особистий внесок здобувача – конструювання рекомбінантних плазмід; дослідження методами ELISA та Вестерн-блот аналізу культуральних середовищ клітин СНО-К1, трансфікованих препаратом ДНК/ПЕІ; проведення ПЛР аналізу ДНК тварин.

4. Гільчук Ю. М., Топорова О. К., Новікова С. М., Кордюм В. А. Вплив введення трансгена аполіпопротеїну А-1 людини на рівень холестерину та морфологію тканин у кролів, які утримувалися на холестериновій дієті // Біополімери і клітина. – 2008. – Т. 24, № 1. – С. 78–81.Особистий внесок здобувача – приготування препарату плазмідна ДНК/ПЕІ.

5. Kordyum V., Toporova O., Novikova S., Kozel Iu . (Gilchuk Iu .), Lihachova L., Morgunov P., Irodov D. In vivo gene transfer of human APOA1 genomic DNA results in markedly high transient expression in model animal // XXX Annual ESAO Congress, Abstract book. – Aachen (Germany), 2003. – P. 664. Особистий внесок здобувача – тестування специфічності зв’язування моноклональних та поліклональних антитіл до АРОА1 людини методом Вестерн-блот аналізу; визначення наявності АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів.

6. Kozel Iu . (Gilchuk Iu .), Suchorada H., Toporova O., Irodov D. Expression of human APOA1 gene in mammalian cells in vitro // Conference for students, PhD students and young scientists, Abstract book. – Kiyv (Ukraine), 2003. – P. 168.Особистий внесок здобувача – визначення методом ELISAрівня синтезу АРОА1 людини трансфікованими клітинами СНО-К1.

7. Kozel Iu . (Gilchuk Iu .), Morgunov P., Toporova O., Irodov D., Novikova S., Kordyum V. Testing of transgene delivery and biodistribution by PCR-analysis // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology, Abstract book. – Lviv (Ukraine), 2004. – P. 226.Особистий внесок здобувача – оптимізація умов ПЛР аналізу гена АРОА1 людини в ДНК трансфікованих клітин щурів; виділення ДНК із зразків тканин різних органів піддослідних тварин; ПЛР аналіз тотальної ДНК тканин різних органів піддослідних щурів.

8. Kozel Iu . (Gilchuk Iu .), Morgunov P., Toporova O., Irodov D., Novikova S. Testing of transgene delivery and biodistribution by PCR-analysis // XXXI Annual ESAO Congress ”Towards medicaltechnology of the future”, Int. J. Artif. Organs. – 2004. –Vol. 27, № 7. – Р. 591. Особистий внесок здобувача – виділення ДНК із зразків тканин різних органів піддослідних тварин; ПЛР аналіз ДНК тканин різних органів піддослідних щурів.

9. Гільчук Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К. Вивчення експресії гена ароА-1 людини під регуляцією різних гібридних послідовностей в СНО-К1 // Матеріали


8-09-2015, 22:03