Ліпофільні глікозиди мурамоїлдипептиду: синтез і антиінфекційна протективна дія

НацIональна академія наук України

Фiзико-хiмiчний iнститут iм. О.В. Богатського

Цикалова Вікторія Миколаївна

УДК 547.963.1

Ліпофільні глікозиди мурамоїлдипептиду: синтез і антиінфекційна протективна дія

02.00.10 - біоорганічна хімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Одеса – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі органічної і біологічної хімії Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського Міністерства освіти та науки України.

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор

ЗЕМЛЯКОВ Олександр Євгенович,

Таврійський національний університет

ім. В.І. Вернадського, професор

кафедри органічної і біологічної хімії

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор

ЯРМОЛЮК Сергій Миколайович,

Інститут молекулярної біології і

генетики НАН України,

завідувач відділу комбінаторної хімії

кандидат хімічних наук, доцент

ІЩЕНКО Валентина Василівна,

Київський національний університет

ім. Тараса Шевченка,

доцент кафедри органічної хімії

Захист відбудеться « 22 » травня 2008 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.219.02 у Фiзико-хiмiчному інституті iм. О.В. Богатського НАН України за адресою: 65080, Одеса, Люстдорфська дорога, 86.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Фiзико-хiмiчного інституту iм. О.В. Богатського НАН України.

Автореферат розісланий « 11 » квітня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, кандидат хімічних наук,

старший науковий співробітникЛ.О. Литвинова

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Похідні N-ацетилмурамоїл-L-аланіл-D-ізоглутаміну (мурамоїлдипептид, MDP) мають широкий діапазон імуномоделюючої дії. З декількох сотень синтезованих модифікацій мурамоїлдипептиду дотепер чотири препарати дозволено до медичного застосування і ще декілька знаходяться на завершенні клінічних випробувань. До високоактивних похідних MDP належать багато ліпофільних модифікацій мурамоїлдипептиду, зокрема, e-октадециламід MDP-L-лізину (ромуртид) і фосфатидилетаноламід MDP-L-аланіну (МТР-РЕ), які використовують як лікарські засоби для лікування вторинних імунодефіцитів і ряду пухлин.

Співробітниками кафедри органічної і біологічної хімії ТНУ було запропоновано використовувати O-глікозидування MDP для зміни гідрофільно-ліпофільних властивостей. При цьому глікозидний спосіб модифікації дозволяє виключити стадії постановки і видалення тимчасового захисту аномерного гідроксилу, що робить синтез коротшим і економічним; а також закріплює конфігурацію у С1 і, отже, у водних розчинах не утворюється аномерна суміш, яка характерна для мурамоїлдипептидів з вільним глікозидним гідроксилом. В результаті проведених досліджень було встановлено, що в-глікозиди мурамоїлдипептиду, аглікони яких додають глікопептидам амфіфільні властивості, мають порівняну імуностимулюючу дію в різних тестах in vitro та in vivo, що перевищує дію самого мурамоїлдипептиду і відповідних a-аномерів.

Також було встановлено, що на результати досліджень імуностимулюючої дії ліпоглікопептидів в тестах in vitro, значно впливає низька розчинність цих сполук у воді і схильність їх до агрегації. Тому вплив ліпофільних мурамоїлдипептидів на імунну систему коректніше оцінювати in vivo, наприклад, в тесті стимуляції антибактеріальної резистентності у мишей з внутрішньочеревинним введенням як збудника, так і глікопептиду.

Хоча окремі раніше отриманні ліпофільні глікозиди MDP, наприклад, в-гексадецил-, в-холестерил- або в-(адамантил-1-метил)-глікозиди MDP, показали високий імуностимулюючий ефект в деяких тест-системах, але систематичного вивчення цієї групи глікопептидів не було проведено. Тому направлений синтез ліпоглікопептидів, вивчення їх імуностимулюючої дії і встановлення взаємозв'язків між структурою глікозидів MDP та їх біологічною активністю є актуальним науковим завданням.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукова робота виконувалась відповідно до координаційних планів Міністерства освіти і науки України в рамках кафедральних досліджень за програмою «Вивчення будови і біологічних властивостей вуглеводів і вуглеводовмісних сполук і біополімерів» (№ Держ. реєстрації 0101U005083 - 2001-2005 рр., 0106U003974 - 2006-2010 рр.). Частина досліджень виконана в рамках проекту Ф7/376-2001 «Створення нових імуномодуляторів, що володіють захисною дією проти вірусу імунодефіциту людини і опортуністичних інфекцій» Державного фонду фундаментальних досліджень (№ Держ. реєстрації 0101U005981 - 2003-2005 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є синтез нових ліпофільних О- і S-глікозидів N-ацетилмурамоїл-L-аланіл-D-ізоглутаміну з різною структурою агліконів і конфігурацією глікозидного зв'язку, а також встановлення впливу структури глікозидів MDP і їх ліпофільності на протективну антиінфекційну активність.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити ряд завдань:

-здійснити синтез двох груп нових ліпофільних О-в-глікозидів MDP з первинними і симетричними вторинними аліфатичними агліконами;

-синтезувати нові ліпофільні О-в-глікозиди MDP з агліконами аліциклічної, арилаліфатичної і алкілароматичної будови;

-отримати нові ліпофільні О-a-глікозиди MDP з агліконами аліфатичної і аліциклічної будови, ізомерні відповідним в-глікозидам;

-розробити схему і провести синтези нових S-в-арилглікозидів MDP;

-вивчити протективну дію синтезованих сполук при поразці мишей грампозитивними і грамнегативними бактеріями, а також вірусом грипу.

Об'єкт дослідження - O- і S-глікозиди N-ацетилмурамоїл-L-аланіл-D-ізоглутаміну.

Предмет дослідження - реакції глюкозамідування спиртів, фенолів і тіофенолів; розробка методик синтезу ліпоглікопептидів; скринінг біологічної активності отриманих сполук.

Методи дослідження - органічний синтез, тонкошарова хроматографія, ¹ Н ЯМР спектроскопія (одновимірна, двовимірні COSY и NOESY), біологічні випробування in vivo.

Наукова новизна.

-Здійснено синтез нових ліпофільних в-алкілглікозидів MDP з різною довжиною вуглецевого ланцюга.

-Запропоновано новий тип ліпофільних похідних мурамоїлдипептиду - діалкілметилглікозиди MDP. Отримано ряд глікопептидів цього типу, що відрізняються ліпофільністю.

-Синтезовано алкілфенільні і арилетильні глікозиди мурамоїлдипептиду: в-п-толіл-, в-п-трет-бутилфеніл- і в-п-ди-трет-бутилфеніл-, в-2,2-дифенілетил- і в-2-п-біфенілетил-MDP.

-Отримані в-глікозиди мурамоїлдипептиду з агліконами, що містять аліциклічни компоненти: в-2-(адамантил-1)етил-, в-циклододецил- і 4-трет-бутилциклогексил-MDP.

-Здійснено синтез нових ліпофільних б-глікозидів мурамоїлдипептиду: a-додецил-, a-(ундецил-6) - і a-циклододецил-MDP.

-Вперше здійснено синтез в-арилтіоглікозидів MDP.

-Встановлено, що на відміну від глікозидів MDP, які мають переважно амфіфільні властивості, у ліпофільних глікозидів MDP з різною конфігурацією аномерного центру не спостерігається достовірних відмінностей в стимуляції протективної дії проти бактерійних інфекцій.

Практичне значення отриманих результатів.

-Результати роботи можуть знайти застосування в синтезі вуглеводів і вуглеводовмісних комплексів. Відпрацьовано методики синтезу глікозидів N-ацетилглюкозаміну з агліконами різноманітної будови.

-Виявлені ліпофільні глікозиди MDP, які стимулюють стійкість мишей до поразки грампозитивними і грамнегативними бактеріями.

-Встановлено, що в-децил-MDP має протективний ефект відносно заражених грипом мишей.

Особистий внесок дисертанта. Особистий внесок автора в роботи, які виконані в співавторстві, полягає у виконанні синтетичного експерименту, аналізу і трактуванні отриманих результатів, формулюванні висновків. Співавторами робіт є Земляков О.Є., Чирва В.Я., Цикалов В.В.(визначення напряму дослідження, вибір об'єктів синтезу, керівництво експериментом і участь в узагальненні результатів). Дослідження біологічної активності проводили спільно з Малигіною В.Ю., Кацевим А.М., Криворутченко Ю.Л. (Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського), Мулик Є.Л., Кузовлевим Ф.М., Калюжиним О.В. (Інститут морфології людини РАМН, м. Москва), Киселевським М.В. (НДІ експериментальної діагностики і терапії пухлин Російського онкологічного наукового центру ім. М.М. Блохіна РАМН, м. Москва).

¹ Н ЯМР дослідження виконані спільно з к.х.н., с.н.с. Пироженко В.В. (Інститут органічної хімії НАН України, м. Київ), експерименти COSY і NOESY - спільно з д.х.н., с.н.с. Туровим O.В. і д.х.н., проф. Брусиловцем А.I. (Київський національний університет ім. Тараса Шевченка).

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені на XX і XXI Українських конференціях з органічної хімії (Одеса, 2004 р., Чернігів, 2007 р.); на Міжнародному симпозіумі “Advanced science in organic chemistry” (Судак, 2006 р.); на XVIII Менделєєвському з'їзді з загальної і прикладної хімії (Москва, 2007); а також на науково-практичних семінарах Координаційної ради відділення хімії НАН України з проблеми «Наукові основи створення лікарських засобів» (Гурзуф, 2003-2005 рр.) і професорсько-викладацьких наукових конференціях ТНУ (2003-2006 рр.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 статей і тези 4 доповідей.

Обсяг і структура роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, обговорення результатів, експериментальної частини, висновків і списку цитованої літератури (165 найменувань). Робота викладена на 148 стор. і включає 24 рисунка, 13 таблиць і 8 схем.

Зміст роботи

Стартовими сполуками в синтезі глікозидів MDP 9a-i,k-s, 16b,f,l, 23r,s (рис. 1) служили відповідні перацетильовані глікозиди N-ацетилглюкозаміну. Подальша схема включала послідовне дезацетилювання сполук 3a-i,k-s, 10b,f,l, 17r,s за Земпленом і введення 4,6-О-ізопропіліденового захисту в триоли 4a‑i,k‑s, 11b,f,l, 18r,s дією 2,2-диметоксипропану.

Алкілювання С3-ОН групи в ацеталях 5a-i,k-s, 12b,f,l, 19r,s проводили L-2-бромопропіоновою кислотою у діоксані у присутності гідриду натрію в умовах, сприяючих зверненню конфігурації асиметричного центру в похідному пропіонової кислоти. Отримані захищені мурамові кислоти 6a-i,k-s, 13b,f,l, 20r,s активували дією дициклогексилкарбодііміду (DCC) і N-гідроксисукциніміду (HOSu) і конденсували з бензиловим естером дипептиду. У глікопептидах 7a-i,k-s, 14b,f,l, 21r,s ацетальний захист віддаляли нагріванням з 70% оцтовою кислотою, а бензилові естери в похідних 8a-i,k-s, 15b,f,l – каталітичним гідрогенолізом. У разі тіоглікозидів 21r,s проводили омилення естерного захисту.

Рис. 1. Загальна схема синтезу глікозидів MDP.

Синтез в-глікозидів MDP з агліконами аліфатичної, аліциклічної і арилаліфатичної природи

На імуностимулюючу дію ліпофільних похідних MDP значно впливає структура ліпофільної компоненти. Тому разом з синтезом в-глікозидів MDP 9а-е з лінійними ліпофільними агліконами з різною довжиною вуглецевого ланцюга нами отримано нові ліпоглікопептиди 9f-i, для яких агліконами використані симетричні вторинні аліфатичні спирти (діалкілметаноли).

Глікозиди 9f-i подібно до таких високоактивних ліпоглікопептидів, як фосфатидилетаноламід MDP-L-аланіну і 6-О-(2-тетрадецилгексадеканоїл)-MDP, здатні за рахунок вуглецевих ланцюгів, що зближуються в просторі, утворювати в розчинах відносно жорсткі гідрофобні стрижнеподібні структури. Присутність такого «ліпідного якоря» сприяє вбудовуванню цих глікопептидів в аналогічним чином організовані фосфоліпідні мембрани імунних клітин.

У третю групу синтезованих нами глікопептидів увійшли в-4-трет-бутилциклогексил-, в-циклододецил-, в-2-(адамантил-1)етил-, в-2,2-дифенілетил- і в-2-п-бифенілетилглікозиди MDP (9k-o), що містять у якості аглікону аліциклічні і ароматичні спирти з числом атомів Карбону від 10 до 14. Не дивлячись на невеликі відмінності в числі атомів Карбону, ліпофільність цих агліконів значно відрізняється: значення СlogP* змінюється від 2,77 у 2,2-дифенілетанолу до 4,52 у циклододеканолу.

Для вибору методу глікозилювання первинних і вторинних спиртів було проведено порівняльне вивчення реакцій глікозилювання додеканолу-1, ундеканолу-6 і циклододеканолу найбільш простими і доступними глікозил-донорами - a-D-глюкопіранозилхлоридом 1 в умовах реакції Кенігса-Кнорра у присутності промоторів меркурій(II) ціаніду або іодиду і оксазоліном 2.

Глікозил-донор і глікозил-акцептор бралися в еквімольних кількостях. На підставі результатів цих експериментів (табл. 1) був вибраний оксазоліновий метод. Він разом з більш високими виходами глікозидів відрізняється отриманням виключно 1,2-транс-глікозидів, тоді як при використанні Hg(CN)₂ спостерігалося додаткове утворення оксазоліну 2, а у разі HgI₂ . - відповідних a-аномерів.

Препаративну кількість перацетильованих в-глікозидів N-ацетилглюкозаміну 3а-i,k-o отримали дією на спирти надлишку оксазоліну 2. Виходи склали 62-88% для первинних спиртів, 26-68% для вторинних аліфатичних спиртів і 45-81% для циклододеканолу і заміщених етанолів.

Таблиця 1

Глікозилювання спиртів хлоридом 1 і оксазоліном 2

* До зникнення за даними ТШХ глікозил-донорів 1 і 2.

** Середнє значення з трьох експериментів.

Будова глікозидів 3а-i,k-o підтверджена даними ¹ Н ЯМР спектрів. ^. Проведено повне віднесення сигналів протонів глікозидного залишку і агліконів. Наявність дублетів аномерних протонів з хім. зсувом 4,67-4,85 м.ч. і КССВ 8,0-8,5 Гц підтверджує утворення в-D-глюкозамінідів.

У разі цис-,транс-4-трет-бутилциклогексанолу глікозилювання проводили недостатністю оксазоліну 2. У реакційній суміші за даними ТШХ знаходяться два продукти глікозилювання: більш рухомий мінорний глікозид 3j і основний компонент – глікозид 3k, які були виділені колонковою хроматографією. Виходячи з більшої реакційної здатності транс-4-трет-бутилциклогексанолу з екваторіальним розташуванням гідроксильної групи для сполуки 3k запропонована транс-конфігурація циклогексанового циклу, а для його ізомеру 3j - цис-конфігурація.

Протони сполук 3k,j мають близькі значення хімічних зсувів і КССВ (рис. 2), що підтверджує їх ізомерну будову. Основні відмінності пов'язані із зсувом в слабкіше поле сигналів Н2 в глікозидному залишку і метинового протона аглікону для глікозиду 3j.

Попередньо запропоновані конфігурації замісників в циклогексановому фрагменті агліконів сполук 3j,k підтверджуються даними спектрів COSY і 2D NOESY. Зокрема, в спектрі 2D NOESY (рис. 3) глікозиду 3k присутні крос-піки між аксіальними протонами Н1’ і Н3’, Н5’, що є просторово зближуючими.

Будова глікопептидних похідних 8а-i,k-o і 9а-i,k-o підтверджувалася ¹ Н ЯМР спектроскопією. Ідентифіковані характеристичні сигнали, що відносяться до протонів аглікону, вуглеводного залишку і лактилдипептидного фрагмента (наприклад, рис. 4). Спектр COSY (рис. 5) сполуки 8b дозволив точніше віднести ряд сигналів протонів глікопептидів, зокрема аномерного протона і метинових протонів лактилпептидного залишку.

Синтез ліпофільних a -глікозидів мурамоїлдипептиду

З метою вивчення впливу конфігурації аномерного центру, а також структури і природи агліконів глікозидів мурамоїлдипептиду на їх імуностимулюючу дію нами на додаток до в-додецил-, в-(ундецил-6) - і в-циклододецилглікозидів мурамоїлдипептиду 9b,f,l були синтезовані відповідні a-аномери 16b,f,l, які містять аліфатичні лінійний первинний і симетричний вторинний, а також циклоаліфатичний аглікони.

Ці аглікони, з одного боку, мають близьку ліпофільність – СlogP для відповідних спиртів 4,95, 4,20 і 4,52, а з іншого, в цьому ряду агліконів зменшується конформаційна рухливість вуглеводневих ланцюгів і ефективна поверхня, що може впливати на взаємодію з біомембранами.

Вихідні перацетильовані a-N-ацетилглюкозамініди 10b,f,l синтезували взаємодією відповідних спиртів з a-глюкозамінілхлоридом 1 в нітрометані при температурі ~90°С у присутності меркурій(II) іодиду. Структура глікозидів 10b,f,l підтверджується даними ¹ Н ЯМР спектрів (рис. 6).

Рис. 6. Фрагменти ¹ Н ЯМР спектрів a- і b-(ундецил-6)глікозидів 10f (А) і 3f (В).

Для a-D-глюкозамінідів дублети аномерного протона зміщені в слабкіше поле (d 4,75-4,87 м.ч.) в порівнянні з відповідними сигналами b-D-аномерів 3b,f,l (d 4,68-4,77 м.ч.) і мають КССВ 3,5 Гц, властиву 1,2-цис-глікозидам, на відміну від КССВ 8,5 Гц, характерної для 1,2-транс-глікозидного зв'язку. Крім того, для a-ізомерів спостерігається характерний зсув в слабке поле сигналу протона у С2 (d 4,25-4,27 м.ч. в порівнянні з 3,64-3,80 м.ч. у відповідних в-аномерів) і амідного протона (d 5,56-5,59 і 5,45-5,50 м.ч. відповідно).

Далі за розглянутою вище схемою (див. рис. 1) синтезували a-глікозиди MDP 16b,f,l. Будова глікопептидів 15b,f,l і 16b,f,l підтверджувалася ¹ Н ЯМР спектроскопією.

Синтез О- і S-в-п-алкілфенілглікозидів мурамоїлдипептиду

Раніше (Земляков А.Е. и др. // Биоорган. химия. - 2001.- С .439) було встановлено, що в-фенілмурамоїлдипептид має високу імуностимулюючу дію в тестах in vitro та in vivo. У розвитку цих робіт, а також для визначення впливу природи аглікону на імуностимулюючу дію глікозідних похідних мурамоїлдипептиду, нами виконаний синтез в-п-толіл-, в-п-трет-бутилфеніл- і в-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенілглікозидів MDP 9p-s - нових алкілфенілглікозидів мурамоїлдипептиду з агліконами різної ліпофільності.

На відміну від широко досліджуваних О-глікозидів мурамоїлдипептиду дотепер було отримано тільки три S-в-алкілтіоглікозиди MDP (Hasegawa A., et al // J. Carbohydr. Chem.-1982-1983.- P.317), ад'ювантна активність яких поступалася MDP. Нами з метою вивчення впливу природи гетероатома біля глікозидного центру на біологічну активність здійснено синтез раніше не описаних в-п-толілтіо- і в-п-трет-бутилфенілтіоглікозидів MDP 23p,r.

У попередньому експерименті оцінювалися найбільш прості і доступні методи отримання перацетильованих О- і S-в-арилглюкозамінідів (табл. 2). п-трет-Бутилфенол і п-тіокрезол глікозилювали еквімолярною кількістю a-хлориду 1 в умовах міжфазного каталізу (МФК) четвертинними амонієвими солями в системі «рідина - рідина», а також каталізу краун-етером в системі «рідина - тверде тіло». Для п-тіокрезолу глікозилювання також проводили у присутності надлишку триетиламіну.

Зважаючи на те, що у всіх вивчених методах глікозилювання виходи продуктів 3r і 17p достатньо великі, в препаративних цілях використовували надлишок фенолів, які глікозилювали a-хлорідом 1 в більш економічних умовах МФК четвертинними амонієвими солями, а реакцію тіофенолів з a-хлоридом 1 проводили при кімнатній температурі у присутності триетиламіну, а також в умовах МФК з BnEt₃ NCl. Після кристалізації з ізопропілового спирту отримали арилглікозиди 3p-s з виходами 61-77%, а арилтіоглікозиди 17p,r - з виходами 78 і 52%, відповідно. Будова сполук 3p-s і 17p,r була доведена ¹ Н ЯМР спектроскопією (рис. 7).

Таблиця 2

Глікозилювання п-трет-бутилфенолу і п-тіокрезолу хлоридом 1

* До зникнення за даними ТШХ глікозил-донору 1.

** Середнє значення з трьох експериментів.

Сигнали аномерного протона тіоглікозидів (d 4,78-4,82 м.ч.) зміщені в сильне поле в порівнянні з відповідними сигналами О-в-глікозидів (d 5,20-5,24 м.ч.). КССВ складає 10-10,5 Гц, що характерно для S-1,2-транс-D-глюкозамінідів і суттєво відрізняється від J_1,2 8 Гц у О-в-арилглікозидів.

Подальший синтез глікопептидів проводився звичайним шляхом відповідно до схеми, представленої на рис. 1. Структура глікопептидів 8p-s, 22p,r і 23p,r підтверджена ¹ Н ЯМР спектроскопією.

Вивчення антивірусної дії в-алкілглікозидів MDP

Моделі інфекцій людини на лабораторних тваринах, зокрема грипу, широко використовуються для вивчення антиінфекційної дії та імунотоксичних характеристик різних речовин. На кафедрі мікробіології Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгіївського (завідувач проф. Криворутченко Ю.Л.) було досліджено вплив на експериментальну грипозну інфекцію мишей чотирьох похідних MDP 9а-d (рис. 8).

в-Децил-MDP 9а в профілактичній схемі в дозі 2 мкг/мишу сприяв виживанню тварин, надаючи помірний протективний ефект. У дозі 20 мкг/мишу речовина прискорювала загибель тварин, але до кінця експерименту різниця в числі тварин, що вижили, в контрольній і експериментальній групі зникала. Введення речовини за терапевтичною схемою демонструвало помірний протективний ефект.

в-Додецил-MDP 9b при обох формах введення і концентраціях має імунотоксичний ефект. Профілактичне введення в-тетрадецил-MDP 9с приводило до імунотоксичної дії в обох концентраціях, а для в-гексадецил-MDP 9d порівнянна імунотоксична дія спостерігалася в концентрації 2 мкг/мишу. У вищій дозі глікозид 9d практично не впливав на летальність заражених тварин, що, напевно, було пов'язано з його практичною нерозчинністю у вказаній концентрації. Таким чином з цієї групи глікопептидів захисний ефект спостерігався тільки для в-децил-MDP 9а.

Вивчення антибактеріальної протективної дії глікозидів MDP

У Інституті морфології людини РАМН (м. Москва) під керівництвом проф. О.В. Калюжина було вивчено дія ліпофільних мурамоїлдипептидів на імунну систему в тесті стимуляції антибактеріальної резистентності у мишей при внутрішньочеревинному введенні свідомо летальної дози бактерійного збудника. Перший експеримент включав вивчення протективної дії 15


8-09-2015, 22:21