Вплив N-стеароїлетаноламіну на ліпідний склад злоякісних та умовно нормальних клітин

Вплив NSE на ліпідний склад та рівень пероксигенації в метастазах та умовно нормальній легеневій тканині.

Практично всі захворювання супроводжуються гіперпродукцією активних форм кисню та розвитком окислювального стресу, внаслідок чого відбувається порушення балансу між прооксидантними та антиоксидантними процесами, що призводить до пошкодження макромолекул клітин, зокрема фосфоліпідів. Ліпіди, як структурні та регуляторні компоненти мембран, беруть участь у підтриманні життєдіяльності клітин, регулюючи процеси транспортування, механізми сигнальної трансдукції і міжклітинні взаємодії. Модифікація ліпідного мікрооточення, що обумовлена активацією процесів пероксидації ліпідів, призводить до змін функціонування клітини і, врешті решт, може сприяти апоптозу чи некрозу клітини. Злоякісна клітина під час свого росту набуває нових ознак, які обумовлюють її захист проти цитотоксичних реакцій організму, а саме експресія каталази та активація синтезу простагландинів E₂ забезпечують злоякісні клітини ефективними механізмами захисту проти ефекторів системи імунітету [Popov B.etal, 2003]. В той же час, в органах тварин пухлиноносіїв відбувається зниження антиоксидантної активності ліпідів і підсилення інтенсивності окисних процесів, що призводять до деструкції тканин у хворих тварин. Вільнорадикальні процеси, які в першу чергу впливають на поліненасичені жирні кислоти, порушують стабілізацію біологічних мембран нормальних клітин і призводять до порушень метаболізму.

Вивчення процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) показало, що в умовно нормальній легеневій тканині, яка межує з метастазами, підвищується рівень ТБК-реагуючих продуктів (табл.2), що супроводжується зниженням рівня каталазної активності порівняно з цими показниками для тканини легенів інтактних тварин (рис.3).

Введення NSE підвищує активність ферменту та запобігає накопиченню ТБК-реагуючих продуктів. Метастазна тканина характеризується високим рівнем каталазної активності, яка дозозалежно зменшується у разі перорального введення NSE (рис. 4).

Вивчення ліпідного складу досліджуваних тканин показало, що ліпідний склад карциноми Льюїс порівняно з ліпідним складом легенів інтактних тварин характеризується більш низьким рівнем фосфатидилетаноламіну (РЕ) та фосфатидилсерину (PS) (рис.5). Вміст лізофосфатидилхоліну (LPC) в досліджуваних зразках є значно вищим, ніж у легеневій тканині здорових мишей. Відомо, що лізофосфоліпіди беруть участь в стимуляції проліферативних та міграційних процесів ракових клітин [Raynal P, etal, 2005]. У разі перорального введення тваринам NSE підвищується рівень PS, але зменшується концентрація сфінгомієліну (SM), що може бути пов’язано з активацією сфінгомієлінового циклу та утворенням сфінгозину, відомого активатора апоптозу. Відомо, що PS впливає на активність сфінгомієлінази та індукує апоптоз, що є одним із механізмів гальмування проліферації злоякісних клітин [Дятловицкая Э.В., Кандыба А.Г., 2004.].

В легеневій тканині, що межує з метастазами, за умов пухлинного росту спостерігаються зміни у складі фосфоліпідів, а саме зниження вмісту фосфатидилхоліну (PC), PE, PS, підвищення рівня фосфатидилінозитолу (PI), LPC (рис. 6).

Важливо підкреслити, що LPC в концентраціях вищих за фізіологічні здатен викликати перебудову ліпідного бішару, яка призводить до порушення проникливості мембран. Введення тваринам NSE приводить до змін, спрямованих у бік нормалізації показників PC, PS, LPC.

За умов експерименту в досліджуваних тканинах спостерігаються кореляційні зміни кількості фосфатидилхоліну та лізофосфатидилхоліну. Зважаючи на те, що N-ацилетаноламіни з довжиною ланцюгу 12, 16, 18 атомів вуглецю підвищують активність цитозольної фосфоліпази А2, можна припустити, що введення NSE впливає на активність фосфоліпази А2, регулюючи тим самим процеси обміну РС та LPC. Рівень LPC також залежить від активності лецетин-холестерин-ацилтрансферази (ЛХАТ). Субстратом для ЛХАТ може бути і холестерол ліпопротеідів низької та дуже низької щільності.

Нами було показано, що введення NSE сприяє підвищенню рівня вільного холестеролу, який був вірогідно нижчим за умов пухлинного росту як в умовно нормальній легеневій тканині (рис.7, А), так і в метастазах (рис. 7, Б). Це може змінювати текучість мембран, і, тим самим, впливати на адгезивні властивості та інвазивний потенціал метастазуючих клітин, а також порушувати мережу сигналів, що регулюють життєдіяльність неоплазми.

Зміни ненасиченості жирних кислот, що входять до складу фосфоліпідів, як і зміни вмісту холестеролу, можуть впливати на текучість мембрани і порушувати різні метаболічні процеси та функції клітин.

Вивчення жирнокислотного складу сумарних фосфоліпідів за умов досліду показало, що NSE змінює співвідношення насичених / ненасичених жирних кислот і в метастазах і в умовно нормальній тканині легенів, що межує з ними (табл. 3, табл.4).

В умовно нормальній легеневій тканині за умов присутності метастазів спостерігаються зміни жирнокислотного складу в бік підвищення ненасиченості сумарних фосфоліпідів. NSE сприяє нормалізації цього показника у мишей в групі „Пухлина + NSE 1 мг”.

Цікаво, що в злоякісних клітинах карциноми рівень насиченості жирних кислот сумарних фосфоліпідів майже однаковий з цим показником в інтактних легенях. Введення NSE підвищує рівень ненасичених жирних кислот, що в подальшому може спонукати до порушень функціонування злоякісних клітин.

Проаналізувавши дані щодо рівню жирних кислот та кількості холестеролу в досліджуваних тканинах, можна припустити, що за умов введення NSE відбуваються компенсаторні явища, можливо для зберігання (або для відтворення) фізико-хімічних властивостей мембран, характерних здоровим клітинам.

Вплив N -стеароїлетаноламіну на вміст метаболітів перетворення

L -аргініну в печінці мишей з карциномою Льюїс.

Ендоканабіноїдна система в організмі тісно співпрацює з багатьма іншими механізмами, що беруть участь у регуляції низки фізіологічних процесів, зокрема з системою оксиду азоту (NO). Показано, що NO впливає на транспортування NAE крізь плазматичну мембрану клітин, регулюючи активність специфічних мембранних транспортерів [Maccarrone M, etal., 2000]. Доведено також, що анандамід та деякі інші ендогенні канабіноїди беруть участь у модуляції відповіді організму на запальні процеси, шляхом інгібування активності індуцибельної ізоформи NO-синтази [Stefano GB, etal., 1998]. Відомо, що метаболізм аргініну, а саме певний баланс між ферментами його перетворення відіграють ключову роль в прогресії пухлини. Підвищення рівня експресії індуцибельної NO-синтази призводить до генерації у великих кількостях оксиду азоту, який в такій ситуації виявляє цитотоксичну дію і індукує пошкодження ДНК. Активація аргінази призводить до продукції орнітина та поліамінів, відомих промоторів клітинної проліферації. Тому доцільно було дослідити вплив N-стеароїлетаноламіну на вміст метаболітів перетворення аргініну за умов розвитку пухлини in vivo . Результати досліджень показали, що в печінці мишей, яким було перещеплено карциному Люїс, спостерігається активація неокисного перетворення L-аргініну, що призводить до утворення поліамінів, відомих регуляторів проліфераційних процесів (рис. 8). Введення NSE з 4 дня після перещеплення пухлини сприяло зниженню вдвічі вмісту поліамінів і зростанню вмісту нітрит (NO₂ ^- ) та нітрат (NO₃ ^- ) аніонів в печінці у мишей пухлиноносіїв (табл. 5), а з 21 дня викликало нормалізацію вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту та поліамінів (див. рис.8 і табл.5).

Отримані результати дають можливість припустити, що ефекти N-стеароїлетаноламіну можуть бути обумовлені його регуляторним впливом на активність ізоформ NO-синтази.

Дослідження інтенсивності фрагментації ДНК в тканинах надниркових залоз людини при інкубації з N -стеароїлетаноламіном .

В результаті досліджень ліпідного складу тканин мишей виникло припущення, що зменшення вмісту сфінгомієліну в метастазах за перорального введення NSE може сприяти індукції проапоптотичних сигналів. Аналіз впливу N-стеароїлетаноламіну на розвиток пухлини ми продовжили на пухлинній тканині надниркових залоз людини. Вивчали інтенсивність фрагментації ДНК, вміст сфінгозину та склад фосфоліпідів при інкубації пухлинної тканини з NSE.

В результаті роботи було показано, що N-стеароїлетаноламін не посилює рівень апоптозу в пухлинних тканинах надниркових залоз людини in vitro (дані не представлені).

Дослідження дії NSE в комбінованій терапії з Цисплатином.

Для лікування багатьох злоякісних пухлин використовується Цисплатин. Порушення функціонування нирок є основним фактором токсичності цього препарату. Тому необхідно підкреслити важливість застосування в лікуванні онкозахворювань супровідної терапії, що передбачає використання засобів, які гальмують пухлинний ріст та сприяють поліпшенню стану організму, послаблюючи дію токсичних речовин. Посилаючись на мембранопротекторні та антиоксидантні властивості N-ацилетаноламінів, доцільним було дослідити вплив N-стеароїлетаноламіну на розвиток пухлини у мишей з карциномою Льюїс на фоні цитотоксичної терапії Цисплатином. В таблиці 6 показано, що введення Цисплатину гальмує ріст основного вузла і зменшує кількість метастазів в легенях та об’єм метастатичного ураження легеневої тканини у мишей, порівняно з тваринами пухлиноносіями в групі „Контроль”. Введення NSE не впливає на ефект Цисплатину.

Як видно з рисунку 11 за умов введення NSE на фоні терапії Цисплатином рівень сечовини дозозалежно знижується, що демонструє антитоксичний ефект N-стеароїлетаноламіну.

Таким чином, при використанні в комплексній протипухлинній терапії NSEне погіршує цитостатичний ефект Цисплатину. Також NSE здатний зменшувати рівень токсичної дії Цисплатину, що виражається в зниженні рівня сечовини.

ВИСНОВКИ

Проведений комплекс досліджень показав, що N-стеароїлетаноламін (NSE) гальмує ріст карциноми Льюїс, зменшує кількість метастазів і об’єм метастатичного ураження легенів за умов його введення на різних стадіях розвитку пухлини та виявляє різноспрямовані ефекти на злоякісні та умовно нормальні тканини в організмі пухлиноносія.

1. Введення NSE призводить до зменшення активності каталази в метастазах у мишей з карциномою Льюїс, що порушує антиоксидантний захист пухлини і робить її більш вразливою до дії захисних реакцій організму. В той же час в умовно нормальній тканині легенів NSE підвищує рівень каталази і гальмує накопичення продуктів перекисного окислення ліпідів, що сприяє нормалізації окисних процесів в легенях.

2. Встановлено здатність NSE коригувати ліпідний склад умовно нормальної тканини легенів в бік нормалізації вмісту фосфоліпідів і вільного холестеролу. Одночасно NSE змінює ліпідну організацію злоякісних клітин: спостерігається підвищення рівня вільного холестеролу та зростає відсоткове співвідношення поліненасичених жирних кислот ω-6 / ω-3 рядів в сумарних фосфоліпідах.

3. Встановлено здатність NSE зменшувати рівень сумарних поліамінів в печінці пухлиноносіїв та нормалізувати вміст стабільних метаболітів оксиду азоту.

4. Показано, що в сумісній антипухлинній терапії з Цисплатином NSE не погіршує цитостатичний ефект Цисплатину і знижує рівень сечовини в крові мишей пухлиноносіїв, що вказує на послаблення токсичної дії Цисплатину.

5. Інкубація лейкемічних клітин миші з NSE призводить до гальмування клітинного росту та знижує рівень виживання цих клітин.

Отже, вперше встановлено, що NSEвпливає на обмін речовин в пухлині та умовно нормальних тканинах таким чином, що в результаті в організмі розвивається “послаблена” пухлина, а показники умовно нормальних тканин змінюються в бік нормалізації.

АНОТАЦІЯ

Хмель Т.О. Вплив N-стеароїлетаноламіну на ліпідний склад злоякісних та умовно нормальних клітин. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2008.

В дисертаційній роботі досліджено вплив N-стеароїлетаноламіну (NSE)на ріст злоякісних клітин in vivo та in vitro , а також їх метастазування і з’ясовані можливі шляхи реалізації гальмуючої дії NSEна розвиток пухлини.

Вперше показано, що NSEздатен гальмувати ріст та метастазування карциноми Льюїс у мишей за умов його введення на різних етапах розвитку пухлини. З’ясовано, що NSEсприяє зменшенню активності каталази в метастазах у мишей з карциномою Льюїс. В той же час в умовно нормальній тканині легенів NSE підвищує активність каталази і гальмує накопичення продуктів перекисного окислення ліпідів. Встановлено здатність NSEмодулювати ліпідний склад умовно нормальної тканини легенів, що призводить до змін в бік нормалізації фосфоліпідного спектру і вільного холестеролу. Одночасно NSE змінює ліпідну організацію злоякісних клітин: спостерігається підвищення рівня вільного холестеролу та змінюється склад жирних кислот в сумарних фосфоліпідах. Встановлено здатність NSEгальмувати накопичення поліамінів та нормалізувати вміст стабільних метаболітів NO в печінці мишей-пухлиноносіїв.

Аналіз експериментальних даних показав, що NSE порушує регуляцію обміну в злоякісних клітинах, а в умовно нормальних тканинах виявляє протекторні властивості і покращує загальний стан тварин пухлиноносіїв. Показано, що в сумісній антипухлинній терапії з Цисплатином NSE не погіршує цитостатичний ефект Цисплатину і знижує рівень сечовини в крові мишей пухлиноносіїв, що вказує на послаблення токсичної дії Цисплатину.

Ключові слова: N-стеароїлетаноламін, злоякісний ріст, фосфоліпіди, жирні кислоти, холестерол, пероксидне окислення ліпідів, оксид азоту.

АННОТАЦИЯ

Хмель Т.А. Влияние N-стеароилэтаноламина на липидный состав злокачественных и условно нормальных клеток. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2008.

В диссертационной работе исследовано влияние N-стеароилэтаноламина (NSE) на рост злокачественных клеток in vivo и in vitro , а такжеих метастазирование и выяснены возможные механизмы реализации антипролиферативного еффекта NSE. Впервые было показано, что NSE способен тормозить рост и метастазирование карциномы Льюис у мышей при его введении на разных сроках развития опухоли и проявляет разнонаправленные эффекты на злокачественные и условно нормальные ткани в организме опухоленосителя. При этом NSEснижает уровень каталазной активности, что нарушает антиоксидантную защиту карциномы Льюис и в то же время в условно нормальной легочной ткани активирует каталазу и снижает уровень продуктов перекисного окисления липидов, что способствует нормализации перекисных процессов в легких опухоленосителя.В условно нормальной легочной ткани при условии развития в ней метастазов увеличивается уровень ненасыщенных жирных кислот в составе суммарных фосфолипидов.

Установлено, что NSE способен модулировать липидный состав условно нормальной ткани легких, нормализуя фосфолипидный спектр и его жирнокислотный состав, а также уровень свободного холестерола.

Одновременно NSE изменяет липидную организацию злокачественных клеток:наблюдается увеличение уровня свободного холестерола и изменяется спектр жирных кислот в составе суммарных фосфолипидов. Показано, что в печени мышей опухоленосителей под действием NSEснижается уровень суммарных полиаминов, известных активаторов пролиферации и изменяется в сторону нормализации содержание стабильных метаболитов оксида азота.

Анализ экспериментальных данных показал, что NSE влияет на обмен веществ в злокачественных клетках, а в условно нормальных тканях проявляет протекторные свойства и улучшает общее состояние животных опухоленосителей. Антиопухолевый эффект NSE наблюдается также на мышиных лейкемичных клетках линии L1210.

Показано, что при сопровождающей антиопухолевой терапии с Цисплатином NSEне влияет на цитостатический эффект Цисплатина, но при этом снижает уровень мочевины в плазме крови опухоленосителя и тем самым уменьшает токсический эффект Цисплатина на организм.

Ключевые слова: N-стеароилэтаноламин, злокачественный рост, фосфолипиды, жирные кислоты, холестерол, перекисное окисление липидов, оксид азота.

SUMMARY

Khmel T.O. The influence of N-stearoylethanolamine on the lipid composition of malignant and conditionally normal cells.– Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 – Biochemistry. Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

This manuscript is devoted to the study of the influence of N-stearoylethanolamine (NSE) on the growth and metastasis of malignant cells in vivo and in vitro. It is directed to elucidation of possible mechanisms of realization of the antiproliferativity effect of NSE. For the first time it was shown that NSE arrests the growth and metastasis of Lewis carcinoma in mice at the different stages of tumor development. It was demonstrated that NSE disturbs the antioxidant protection of cells of the Lewis carcinoma and at the same time it inhibits processes of peroxidation in the adjacent conditionally normal lung tissue.

It was found that under tumor development NSE modulated the lipid composition of the adjacent lung tissue. NSE normalized the phospholipid content as well as the level of free cholesterol. Simultaneously NSE changed the lipid organization of malignant cells: the level of free cholesterol increased and the content of fatty acids esterified in phospholipids changed. It was shown that NSE administration normalized the content of NO metabolites in liver of tumor-bearing mice. The analysis of experimental data has shown that NSE was possessed by the protective properties: it disturbs the metabolism of malignant cells and improves the state of tumor-bearing animals.

N-stearoylethanolamine was shown in decreasing the toxic effect of antitumor cisplatin treatment.

Keywords: N-stearoylethanolamine, malignant growth, phospholipids, fatty acids, cholesterol, lipid peroxidation, nitric oxide.