Особливості патогенезу гіперметаболізму у системній запальній відповіді організму при тяжкій механічній травмі

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ДОНЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. М. ГОРЬКОГО

КРЮК ОЛЕКСАНДР ЮРІЙОВИЧ

УДК (616-001.5+616-001.36)-099

ОСОБЛИВОСТІ ПАТОГЕНЕЗУ ГІПЕРМЕТАБОЛІЗМУ У СИСТЕМНІЙ ЗАПАЛЬНІЙ ВІДПОВІДІ ОРГАНІЗМУ ПРИ ТЯЖКІЙ МЕХАНІЧНІЙ ТРАВМІ

14.03.04 – патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Донецьк – 2008

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Політравма вже давно є не тільки медичною, але і соціальною проблемою (Ельский В.Н., Кардаш А.М., Городник Г.А., 2004). В структурі травматизму мирного часу політравма досягає 12-15% (Поляченко Н.М. и др., 2004; Marik P.E., Varon J., Trask T., 2004). За даними ВОЗ, серед причин смертності травми займають третє, а серед населення до 40 років - перше місце (Селезнев С.А., Шапот Ю.Б., Багненко С. Ф., 2003). Смертність від нещасних випадків та травм постійно зростає - в середньому на 1% щорічно (Цибуляк Г.Н., 2005). У Донбасі, важливому промисловому регіоні України, травматизм досягає характеру епідемії. Йому сприяють техногенні катастрофи, аварії на дорогах, конфлікти повсякденності. Не зважаючи на те, що постраждалі з політравмою складають 8-10% всіх, що надходять на стаціонарне лікування, саме на них припадає до 70% літальних випадків (Pape B.C. et al., 2005), що є свідоцтвом недостатньої ефективності лікування таких хворих. Між тим, вдосконалення терапії постраждалих затримується недостатньою вивченістю механізмів формування травматичної хвороби (Ельский В.Н. и др., 2003; Зяблицев С.В., 2005). У тому числі, мало вивчений патогенез гіперметаболізму при тяжкій механічній травмі (Кнорринг Г.Ю., 2005). Потребують рішення питання, що стосуються участі в цьому механізмі прозапальних цитокинів ІЛ-6, ІЛ-8 та ФНП-б. Недостатньо висвітлені питання зв‘язку показників обмінних порушень (вуглеводів, білків, ліпідів) з транслокацією мікроорганізмів та структурою бактеріального сепсису. Потребують розробки способи точної діагностики наявності гіперметаболічних порушень обміну речовин, оцінки їх тяжкості та прогнозу у постраждалих з тяжкою механічною травмою та шоком (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А., 2004; Левит Д.А., Лейдерман И.Н., 2006; Никонов В.В., Феськов А.Э., Нудьга А.Н., 2003; Daurinas E. E. et al., 2005).

Зв‘язок праці з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційне дослідження належить до тематики науково-дослідних робіт Донецького національного медичного університету ім.М.Горького МОЗ України та виконане в рамках комплексної НДР “Дисфункція гуморальної регуляції в патогенезі травматичної хвороби” (№ держреєстрації 0105U008712). Дисертантом проведені дослідження біохімічних, імунологічних та бактеріологічних ланок патогенезу травматичної хвороби.

Мета дослідження: виявлення механізму зміни виразності гіперметаболічної реакції залежно від рівня прозапальних цитокінів, етіологічної структури і тяжкості бактерійного сепсису і встановлення прогностичної значущості гіперметаболізму при важкій механічній травмі та шоці.

Задачі дослідження:

1. Визначити найбільш інформативні і прості біохімічні показники, що характеризують гіперметаболізм у тварин з важкою механічною травмою і шоком в експерименті;

2. Уточнити зв'язок глюконеогенезу з гіперметаболізмом і встановити його патогенетичне значення при шоковому смертельному, шоковому несмертельному і нешоковому типах посттравматичної реакції;

3. Вивчити склад мікроорганізмів і виявити зміни в структурі бактеріємії і сепсису при шоковому смертельному, шоковому несмертельному і нешоковому типах посттравматичної реакції;

4. Провести кореляційну оцінку зв'язку між показниками цитокінової відповіді (ІЛ-6, ІЛ-8, ФНП-б), транслокації мікроорганізмів і гіперметаболізму при шоковому смертельному, шоковому несмертельному і нешоковому типах посттравматичної реакції;

5. Встановити мікробіологічні критерії діагностики сепсису і визначити прогностичне значення цих показників відносно особливостей перебігу і результату посттравматичної реакції в експерименті.

Об'єкт дослідження: стан гіперметаболізму в системній запальній відповіді при важкій механічній травмі.

Предмет дослідження: показники гіперметаболізму, запалення і бактеріємії, їх прогностична значущість в динаміці трьох типів посттравматичної відповіді.

Методи дослідження: патогенетичні (моделювання травми), фізіологічні (оцінка електропровідності тканин), біохімічні (визначення в сироватці крові електролітів - натрію, калію, кальцію, загального білку і його фракцій, показників ліпідного обміну - холестерину, тригліцеридів, фракцій липопротеідів, глюкози, сечової кислоти, сечовини, креатиніну; активностіферментів: a-амілази, АсАТ и АлАТ, ЛФ-ази і КФ-ази, КФК, ЛДГ, ГГТ, рівень маркеру ендогенної інтоксикації МСМ), імунологічні (кількість лейкоцитів, лімфоцитів, показники ІЛ-6, ІЛ-8, ФНП-б), бактеріологічні (посів мікроорганізмів на звичайні та селективні середовища, забарвлення за Романовським, Грамом, біохімічні тести для ідентифікації збудників), статистичні (комп'ютерний параметричний| аналіз, перевірка на відповідність законам Гаусового розподілу).

Наукова новизна отриманих результатів. Наукова новизна роботи полягає в поглибленні теоретичних основ концепції травматичної хвороби, зокрема:

- в уточненні ролі глюконеогенезу, як лімітуючої ланки гіперметаболізму в патогенезі важкої посттравматичної реакції. Найбільше значення при цьому має той факт, що рання летальність тварин при шоковому смертельному типі посттравматичної реакції обумовлена зниженням ефективності глюконеогенезу;

- у встановленні зв'язку гіперреактивного стану імунної системи з гіперметаболізмом, бактеріємією і сепсисом. При цьому показано, що в патогенезі сепсису беруть участь не патогенні бактерії, а умовно-патогенна аутофлора, що колонізує відкриті біоценози організму. При шокових типах посттравматичної реакції (шоковому смертельному і несмертельному) відбувається трансформація генералізованої запальної реакції в сепсис.

Практичне значення отриманих результатів. У роботі на основі простих і інформативних біохімічних показників розроблені критерії гіперметаболічних порушень обміну речовин при важкій механічній травмі і шоці. На підставі імунологічних і мікробіологічних показників розроблена медична технологія прогнозування тяжкості перебігу посттравматичної відповіді в експерименті.

Матеріали дисертації впроваджені в лікувально-діагностичний процес Інституту травматології на ортопедії, а також в педагогічний процес Донецького, Запорізького, Кримського, Харківського, Луганського медичних університетів та Дніпропетровської медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота повністю є результатом самостійного наукового дослідження здобувача. Особистий внесок здобувача полягає в інформаційному пошуку і аналізі літературних джерел, в розробці методів дослідження, плануванні роботи, моделюванні і тестуванні типів посттравматичної відповіді, виконанні більшості лабораторних аналізів, узагальненні етапів дослідження і результатів дисертаційної роботи в цілому. Автором проведений статистичний аналіз результатів дослідження, написані розділи дисертації, сформульовані висновки роботи, практичні рекомендації, оформлені наукові публікації і автореферат, виконано впровадження результатів дослідження в практику. Дисертантом не було використано результатів і ідей співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Дисертаційну роботу було апробовано на спільному засіданні кафедр патологічної фізіології, гістології, фізіотерапії і лікувальної фізкультури з курсом нетрадиційної медиціни, Центральної науково-дослідної лабораторії Донецького національного медичного університету ім. М. Горького (квітень, 2008). Основні положення дисертаційної роботи оприлюднені й обговорені на всеукраїнській науково-практичній та навчально-методичній конференції ”Фундаментальні науки – хірургії” (Полтава, 2007), на IХ международній конференції “Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы” (Донецьк-Слов’янськ, 2007), науковій конференції “VI читання ім. В.В. Підвисоцького” (Одеса, 2007), 70-ї міжнародної науково-практичної конференції молодих вчених “Актуальні проблеми клінічної, експериментальної, профілактичної медицини, стоматології та фармації” (Донецьк, 2008).

Публікації. Основні матеріали дисертаційної роботи опубліковані в 12 наукових працях, серед яких 6 статей в журналах, 2 статті у складі збірок наукових праць, визнаних ВАК України, і 4 роботи в матеріалах наукових конференцій.

Структура и об’єм дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 141 сторінках тексту, складається зі вступу, 4 розділів (зокрема огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, 2 розділів власних досліджень), узагальнення і аналізу отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел літератури, який містить 220 найменувань (139 кирилицею і 81 латиницею). Роботу ілюстровано 11 таблицями і 18 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на 194 білих безпородних щурах-самцях вагою 250-300 г, які утримувалися на стандартному раціоні при вільному доступі до їжі і води в умовах віварію НДІ травматології і ортопедії Донецького національного медичного університету ім. М. Горького. Підготовка тварин до експерименту, травмування і виведення з експерименту здійснювали при дотриманні загальних вимог і положень Європейської Конвенції з захисту хребетних тварин, що використовуються для дослідницьких і інших наукових цілей (Страсбург, 1986), а також вирішень Першого національного конгресу біоетики (Київ, 2000) і за узгодженням з комісією з біоетики ДонНМУ.

Важку механічну травму і шок моделювали за допомогою модифікованого методу Кеннона (нанесення 50 ударів електромагнітним ударником по стегнах силою 250 Н/см² ) (Ельский В. Н. и др., 2002). Вивчали тривалість життя, біохімічний статус, бактеріологічні показники, імунологічні показники і зв'язок між окремими біохімічними, імунологічними і мікробіологічними показниками при трьох типах розвитку посттравматичної реакції. Індивідуальну реактивність організму в динаміці ПТР визначали за допомогою модифікованого методу вимірювання шкірно-гальванічного рефлексу за допомогою показника “К”. Характер змін індивідуальної реактивності тварин, що визначався за вказаним способом, лежав в основі визначення типів посттравматичної реакції і мав важливе прогностичне значення.

Для оцінки об'єктивного статусу, ступеня розладів обмінних процесів в організмі експериментальних тварин при травмі, визначали ряд біохімічних параметрів. Їх спектр включав визначення в сироватці крові (на апараті Microlit) електролітів (натрію, калію, кальцію), загального білка та його фракцій, показників ліпідного обміну (холестерину, тригліцеридів, фракцій ліпопротеїдів), глюкози, СК, сечовини, креатиніну, а також активності ферментів: a-амілази, АсАТ та АлАТ, ЛФ-ази і КФ-ази, КФК, ЛДГ, ГГТ. Рівень маркера ендогенної інтоксикації МСМ визначали в сироватці крові скринінговим методом (Калашников В. С., 2002).

Посів крові на живильні середовища, виділення з неї мікроорганізмів і їх ідентифікацію проводили згідно вимогам, що пред'являються до бактеріологічних досліджень, які виконуються в клініко-діагностичних лабораторіях лікувально-профілактичних установ (Кочеровец В. И. и др., 1996). Кількісну оцінку складу мікробів і окремих структур грибів (уривки міцелія, макро- і мікроконідії, спори, конідіеносци і тому подібне), що виявляються в мазках крові, проводили шляхом прямого підрахунку згаданих об'єктів мікроскопії впродовж 4 см поверхні мазка. Число мікроскопічних об'єктів, що виявляються, виражали в% по відношенню до стандартного числа полів зору (100).

У периферичній крові у щурів підраховували загальну кількість лейкоцитів і визначали їх морфологічний склад (еозинофіли, базофіли, моноцити, нейтрофіли паличкоядерні, нейтрофіли сегменто-ядерні, лімфоцити) (Ярилин А. А., 1999).

Для оцінки виразності запальної відповіді організму вивчали в сироватці крові концентрацію прозапальних цитокінів: ІЛ-8, ІЛ-6 та ФНП-б. Вказані цитокіни виявляли методом твердофазного імуноферментного аналізу із застосуванням як індикаторний фермент пероксидази хрону.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили на IBM PC/AT із застосуванням ліцензійних пакетів Statistica 5.5 (Stat Soft Rus) та Stadia 6.1 (“Информатика и компьютеры”, Москва) (Кулаичев А. П., 1999; Лапач С. Н., 2000).

Результати власних досліджень та їх обговорення. Встановлено, що після нанесення важкої стандартної травми, розвиваються три типи посттравматичної реакції, названі С. Є. Золотухіним (Золотухин С. Е., 1998): “шоковим смертельним” (з тривалістю життя 18,2±2,5 години), “шоковим несмертельним” (з тривалістю життя 61,3±4,8 години) та “нешоковим” (з тривалістю життя 100,1±7,5 години). Відповідно, їх частота реєстрації знаходилася в співвідношенні (%): 38:31:31.

Для виявлення особливостей порушення метаболізму при важкій механічній травмі, що протікає у тварин з різними типами посттравматичної реакції, були визначені біохімічні показники крові у 40 експериментальних тварин. 10 щурів були в групі контролю (інтактні).

Особливості зміни показників, що характеризують електролітний, вуглеводний і білковий обмін у контрольних і тварин з I-III типами посттравматичної реакції містяться в таблиці 1.

У тварин з травмою показники калія, кальцію, сечовини і МСМ у сироватці крові змінювалися більшою мірою, чим показники натрію, креатиніну, СК, загального білка і його фракцій. Найбільших значень при шоковому смертельному типі досягали показники МСМ і сечовини. Вони, відповідно, на 129% і 108% перевищували рівень контролю. Найменших значень при шоковому смертельному типі посттравматичної реакції досягали показники кальцію. Вони знижувалися на 52% в порівнянні з даними контролю.

У тварин з травмою показники КФК, ЛДГ, АсАТ, АлАТ змінювалися сильніше, ніж б-амілаза, ГГТ, ЛФ- і КФ-аз. Ці показники мали менші відхилення від показників норми при не шоковому типі і великі – при шоковому смертельному. Зокрема, при шоковому смертельному типі посттравматичної реакції активність АсАТ, АлАТ, КФК і ЛДГ перевищувала рівень контролю більш, ніж в 6 разів.

Таблиця 1. Біохімічні показники сироватки крові, що характеризують електролітний, вуглеводний і білковий обмін у контрольних і тварин з I-III типами посттравматичної реакції (M±m)

Примітки:

1. ¹ – відмінності статистично достовірні в порівнянні з контрольною групою (p<0,05);

2. ² – відмінності статистично достовірні в порівнянні з не шоковим типом посттравматичної реакції (p<0,05);

3. ³ – відмінності статистично достовірні в порівнянні з шоковим несмертельним типом посттравматичної реакції (p<0,05).

У тварин з травмою показники загального білірубіну, ДК, тригліцеридів змінювалися сильніше, ніж МДА, холестерину і фракцій ліпопротеїдів. Ці показники мали менші відхилення від показників контролю при не шоковому типі і великі – при шоковому смертельному типі посттравматичної реакції. При шоковому смертельному типі найбільш високих значень досягали показники білірубіну і ДК, що перевищували відповідно на 182% і 119% значення контролю.

Для виявлення ролі гіперметаболізму в патогенезі і для розробки прогностичних критеріїв тяжкості перебігу посттравматичної реакції у тварин в експерименті, нами були відібрані зі всіх вивчених біохімічних показників 11. Ці показники з різних сторін характеризували гіперметаболізм. Ось ці показники: “креатинін”, “сечовина”, “СК”, “глюкоза”, “загальний|спільний| білок”, “МСМ”, “холестерин”, “тригліцеріди|”, “МДА”, “ДК”, “білірубін”.

Для приведення значень цих показників до єдиної шкали змін щодо рівня контролю (показників інтактних тварин) нами обрані величини відносних коефіцієнтів “К_i ”, які визначали за формулою:

,

де: - середнє арифметичне значення величини одного з одинадцяти згаданих біохімічних показників при важкій механічній травмі; - середнє значення однойменного біохімічного показника, шо визначався в контрольній групі тварин. У чисельнику представлена різниця значень біохімічних показників, узята по абсолютній величині.

З урахуванням того, що величини відносних показників “К_i ” відображали ступінь виразності гіперметаболізму, показник “К_i ” був названий нами “гіперметаболічним показником”.

Значення показників гіперметаболзму при трьох типах перебігу посттравматичної реації зазначені в таблиці 2. Найбільшими гіперметаболічними показниками були показники білірубіну, МСМ, ДК, сечовини, найменшими – глюкози, МДА, загального білка. При шоковому смертельному типі посттравматичної реакції високий рівень білірубіну, МСМ, ДК і сечовини свідчив про те, що на цьому етапі дослідження, коли були визначені ці однойменні біохімічні показники у тварин, в патогенезі посттравматичної реакції відбувалися зміни, які можна було описати за допомогою концепції “лімітуючих ланок” (Селезнев С. А., 1984). Зростання білірубіну в сироватці крові відображало порушення проникності клітинних мембран гепатоцитов і накопичення в печінці продуктів руйнування міоглобіну, що поступали із зруйнованих м'язових тканин. Високий рівень ДК і сечовини вказував на посилення процесів перекисного окислення ліпідів і розпаду білків. Саме ці порушення обміну домінували на даному етапі патогенезу і складали лімітуючі ланки.

Таблиця 2. Значення показників гіперметаболізму (“К_i ”) у тварин трьох типів перебігу посттравматичної реакції,%

При гіперметаболізмі основним джерелом енергії стають амінокислоти і жирні кислоти. Вони утворюються в результаті цитолізу клітин покривних тканин, опорно-рухового апарату і внутрішніх органів, в першу чергу, органів шлунково-кишкового тракту, печінки, нирок, легенів і серця. Цитоз в наших дослідженнях підтверджувався гіперкаліємією і гіперферментемією. Зокрема, розпад м'язової тканини підтверджувався високою активністю КФК і КФ. Висока активність КФ-ази також говорила про руйнування еритроцитів і тромбоцитів. Гипертрансаміназемія і ГГТ свідчили про цитоліз кардиоцитов і гепатоцитов. Про руйнування епітеліальної тканини говорили зміни активності в-амилаз і ЛДГ. При шоковому смертельному типі посттравматичної реакції, на відміну від шокового несмертельного і нешокового типів, ефективність глюконеогенезу знижувалася, що приводило до ранньої летальності. На зниження ефективності глюконеогенезу при такому типі посттравматичної реакції вказувала низька величина глюкози і високі значення гіперметаболічних показників загального білка і тригліцеридів.

На ранньому етапі патогенезу посттравматичної реакції, зокрема при шокових типах цієї реакції, ми не побачили ознак, підтверджуючих положення про те, що при гіперметаболізмі гіперпотреба в субстратах метаболізму поєднується з толерантністю тканин до цих субстратів.

Найменший рівень коливання гіперметаболічних показників мав місце при нешоковому типі посттравматичної реакції.

У щурів контрольної серії при бактеріологічному дослідженні крові висівалися грампозитивні коки і мікродиплококи тільки в одиничних випадках (до 6%). У тварин з травмою збільшувалася частота висівання не тільки грампозитивних коків, але і грамнегативних паличок. У великій кількості висівалися E.coli, E.faecalis. Щільність посіву цих мікроорганізмів також була великою і складала 10⁷ -10⁸ КОЕ. Із збільшенням тяжкості перебігу посттравматичної реакції, збільшувалася і частота висівання вказаних мікроорганізмів. При шоковому несмертельному типі посттравматичної реакції в крові з'являлися S.epidermidis і Candidae sp., а при шоковому смертельному - S.aureus і N.flavescens.

Показники висіваємості мікроорганізмів з крові у тварин свідчили про ендогенну міграцію ентеробактерій і грибів Candidae sp. з кишечника, а також із слизових оболонок дихального тракту (мікрококи, стафілококи, нейссерії). Явище міграції мікроорганізмів з кишечника в лімфатичні вузли черевної порожнини і далі в інші органи лімфатичної системи, а потім в кровотік, називають транслокацією (Deich E.A., Bridges R., 1987). Певною мірою транслокація грає важливу позитивну роль в захисті організму від інфекції, оскільки кишкові мікроби передають імунокомпетентним клітинам, що знаходяться в лімфатичних вузлах, антигени або інформацію про антигени збудників інфекційних захворювань, а ті синтезують специфічні антитіла, що беруть участь в механізмах імунітету. Надлишок мікроорганізмів кишкового походження в біологічних тканинах організму вказує на їх патогенне значення (Голосова Т.В., Файнштейн Ф.Э., Мартынова В.А., 1980). Виражена транслокація обумовлюється зниженням кислотності шлункового соку і моторики кишечника, зменшенням концентрації жовчних кислот,


8-09-2015, 22:38