ДЕРЖАВНА УСТАНОВА
"ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ
ІМ. Л.В. ГРОМАШЕВСЬКОГО
АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ"
ТИМКОВИЧ МИРОСЛАВА АНДРІЇВНА
УДК: 616.36 – 002: 578. 891 – 07: 575. 22 (477, 87)
Генетична гетерогенність НВ V та її вплив на
імунопатогенез і перебіг НВ V -інфекції
14.01.13 – інфекційні хвороби
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Харківській державній медичній академії післядипломної освіти.
Науковий керівник:
доктор медичних наук, професор Малий Василь Пантелійович, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, завідувач кафедри інфекційних хвороб.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Герасун Борис Абрамович, Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України, професор кафедри інфекційних хвороб;
кандидат медичних наук, доцент Корчинський Микола Чеславович, Київський національний медичний університет ім. О. О. Богомольця МОЗ України, доцент кафедри інфекційних хвороб.
Захист відбудеться "13" березня 2008 р. о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.614.01 при ДУ “Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України” за адресою: 01015, м. Київ, вул. Мазепи,23.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ДУ “Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України” за адресою: 03038, м. Київ, вул. Миколи Амосова, 5.
Автореферат розіслано "12" лютого 2008 р.
Учений секретар спеціалізованої вченої ради
кандидатмедичних наук Панасюк О.Л.
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Початок ХХI століття відзначається періодом значних досягнень у вивченні проблеми вірусних гепатитівз парентеральним шляхом передачі і HBV-інфекції в тому числі. Прогресуючий інтерес до HBV-інфекції зумовлений її глобальним розповсюдженням, несприятливими близькими та віддаленими наслідками (Возіанова Ж.І., 2000; Андрейчин М.А., 2001; Барштейн Ю.А., 2001; Громашевська Л.Л., 2001; Федорченко С.В., 2001).Хронічна форма ГВ оцінюється багатьма авторами як найрозповсюдженіша хронічна вірусна інфекція в світі, що вказує на глобальність та незавершеність у вирішенні проблеми HBV-інфекції (Соринсон С.Н., 1998; Андрейчин М.А., 2001; Громашевська Л.Л. з співавт., 2001; SherlockS., DooliD., 2002).
Не дивлячись на те, що в останні роки в Україні рівень захворюваності на HBV-інфекцію має тенденцію до зниження, епідемічна ситуація залишається складною, а територія України продовжує належати до регіонів з високим рівнем розповсюдження ГВ. В основному це пов’язано з економічними та фінансовими труднощами, великими міграційними процесами населення на окремих територіях, у тому числі і на Закарпатті, зростанням наркоманії, поширенням інструментальних інвазивних ендоскопічних досліджень, трансплантаційних операцій, які сприяють розповсюдженню інфекцій з парентеральним механізмом передачі. Як наслідок, разом з ВІЛ-інфекцією та ГС, ГВ на сучасному етапі – одна із небезпечних вірусних інфекцій, що викликає занепокоєння за здоров'я населення, скорочення середньої тривалості життя людей у всьому світі, призводить до значних матеріальних збитків і має вагому соціально-економічну значущість (Возіанова Ж.І., 2001).
У зв’язку з тим, що HBV-інфекція має часто безсимптомний перебіг початкових стадій захворювання та безжовтяничні форми хвороби, що обумовлюють високий відсоток хронізації процесу, виникають певні складності клінічної діагностики, що вимагає прискореного розвитку нових та удосконалення вже існуючих лабораторних методів моніторингу вірусних гепатитів. Новітні генодіагностичні дослідження нуклеотидних послідовностей ДНК HBV із наступним визначенням генетичної варіабельності HBV значно розширили можливості встановлення мутантних форм вірусу та сучасної етіологічної розшифровки гепатиту, що дозволило оцінити істинну поширеність й актуальність ГВ. Крім того, на основі результатів сучасних діагностичних методів стає можливим встановлення особливостей клінічного перебігу та наслідків інфекції, що дозволяє покращити етіотропне лікування та створити ефективні засоби специфічної профілактики HBV-інфекції (Мукомолов С.Л., 2003; Герасун Б.А., 2004; Корчинський М.Ч., 2004; Сучков С.В., 2004).
Вірус гепатиту В вважається найбільш вивченим серед інших гепатотропних вірусів. Але в останні роки його генетична мінливість почала значно впливати на перебіг та наслідки хвороби. Така мінливість проявляється як у існуванні різних генотипів HВV, так і у виникненні вірусних мутацій. Згідно з зарубіжними науковими даними генетична структура вірусу суттєво впливає на клінічний перебіг інфекційного процесу, імунологічне реагування організму, ефективність противірусної терапії тощо (Carman W. etal., 2003; Hunt С.М., 2003; Kao J.H., 2004). Важливо зазначити, що вивчення генотипів НВV, що циркулюють на території України, та їх вплив на перебіг ГГВ дотепер проводилися лише у хворих Харківської області (Лядова Т.І., 2004). Але, незважаючи на суттєві успіхи в проведенні генотипування вірусу ГВ, дослідження генетичної гетерогенності НВV не проводилися у хворих на тяжкі форми ГГВ та хронічні форми хвороби з різним ступенем активності. Недостатньо вивченими залишаються фактори, які диригують імунологічною відповіддю макроорганізму і можуть призводити до елімінації гепатотропних вірусів або до їх тривалої персистенції, не встановлено їх зв’язок з генетичною структурою вірусу.
Сьогодні більшість дослідників вважають, що одним із факторів, що визначають подальший перебіг HВV-інфекції, є взаємодія вірусу з імунною системою людини. Крім того, елімінація вірусів із організму забезпечується адекватною імунною відповіддю, а недостатня інтенсивність імунного запалення сприяє персистенції вірусної інфекції (Гейвандова Н.І. та співавт., 2000). В останні роки доведено, що ініціаторами імунної відповіді організму є цитокіни, які не тільки беруть участь у формуванні регуляторних захисних реакцій, але і забезпечують гомеостаз організму в цілому. Дисбаланс у системі цитокінового регуляторного ланцюга – ключова ланка імунних порушень при НВV-інфекції. Порушення балансу між цитокінами відіграє значну роль у тривалій персистенції НВV, прогресуванні захворювання з подальшою хронізацією процесу, розвитком імунодефіцитного стану, тому перебіг і наслідки хвороби значною мірою залежать від збалансованості основних регуляторних цитокінів. З цих позицій, НВV-інфекцію можна розглядати як „незбалансовану цитокінемію” (Логинов A.C., 2001; Кетлінський С.А., 2002). Встановлено, що типи імунологічного реагування пов’язані з одним із варіантів активації лімфоцитів з переважанням клонів Т-хелперів 1-го або 2-го типів, які різняться продукованими цитокінами і стимулюючою роллю в розвитку імунної відповіді по клітинному або гуморальному типах. Типи імунологічного реагування при гострому ГВ в Україні тільки почали вивчатися (Лядова Т.І., 2004), а дослідження генотипів НВV та типів імунологічного реагування при тяжкому перебігу ГГВ та ХГВ в Україні не проводилися.
Тому, враховуючи вищевказане, проведення комплексного генодіагностичного та імунологічного обстеження хворих на НВV-інфекцію з вивченням генетичної гетерогенності НВV, встановленням типів імунологічного реагування організму, дослідженням їх зв’язку з клінічним перебігом захворювання з метою прогнозування можливих наслідків хвороби є не тільки актуальним, а і перспективним.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота є фрагментом науково-дослідної роботи Харківської медичної академії післядипломної освіти "Роль цитокінової регуляторної мережі у хворих на гострий вірусний гепатит В" номер державної реєстрації 0103 U 004141.
Мета дослідження: підвищити можливості прогнозування перебігу та можливих наслідків захворювання у хворих з НВV-інфекцією на основі встановлення типу імунологічного реагування організму та генетичної структури вірусу.
Основні задачі дослідження:
1. Вивчити генотипову та субтипову структуру НВV-інфекції у Закарпатському регіоні України.
2. Зіставити особливості клінічних проявів гострого та хронічного ГВ залежно від генотипу та геноваріанта НВV.
3. Дослідити синтез прозапальних та протизапальних цитокінів у хворих на ГГВ та ХГВ із різними генотипами НВV.
4. Виявити кореляційні зв’язки між активністю інфекційного процесу та показниками цитокінового профілю у хворих на ГГВ та ХГВ.
5. Розробити методику прогнозування перебігу та можливих наслідків НВV-інфекції з врахуванням типу імунологічного реагування організму та генотипу вірусу.
Об’єкт дослідження: хворі на гострий та хронічний гепатит В.
Предмет дослідження:у динаміці ГГВ та ХГВ досліджувалися клініко-біохімічні, серологічні, вірусологічні та імунологічні показники.
Методи дослідження: у роботі використані: загальноприйняте клініко-лабораторне обстеження хворих, серологічні, генодіагностичні, імунологічні та інструментальні методи дослідження.
Наукова новизна отриманих результатів.
Вперше вивчено розподіл генотипів HВV у Закарпатській області України і встановлена одночасна циркуляція генотипів D (геноваріанти I, II) та А вірусу. Встановлено, що у хворих на гострий гепатит переважає генотип D HВV (71,1%), натомість, у хворих на ХГВ генотипи А і D зустрічаються практично з однаковою частотою (41,8% та 39,2% відповідно).
У хворих з D генотипом HВV домінуючим є I геноваріант (88,9% при гострому гепатиті та 93,9% при хронічному).
Встановлено, що клінічні прояви НВV-інфекції значною мірою залежать від генетичної структури вірусу. Так, у хворих на ГГВ із D генотипом вірусу тяжкий перебіг хвороби виникає частіше, ніж при гепатиті, що викликаний генотипом А HBV (відповідно 18,5% та 6,7%, р<0,05). У хворих на ХГВ із D генотипом вірусу відмічено тенденцію до переважання мінімальної активності інфекційного процесу, порівняно з ХГВ із А генотипом НВV.
Показано, що генотип вірусу впливає на особливості імунопатогенезу хвороби. Це проявляється відмінностями у динаміці синтезу прозапальних (ІЛ-1β, ФНП-α, ІЛ-6, ІЛ-2) та протизапальних цитокінів (ІЛ-4, ІЛ-10). Так, у хворих на гострий гепатит, зумовлений D генотипом HBV, у розпалі хвороби показники синтезу прозапальних цитокінів (ІЛ-1β, ФНП-α, р<0,05), вірогідно нижчі, ніж у хворих на гепатит з А генотипом вірусу, однак рівень їх підвищеної активності значно триваліший і зберігається у періоді реконвалесценції. У хворих на гострий гепатит з А генотипом вірусу у стадії реконвалесценції на перший план виступає синтез протизапальних цитокінів (ІЛ-4, ІЛ-10, р<0,05).
У хворих на ХГВ із D генотипом HBV синтез прозапальних та протизапальних цитокінів виявився меншим, ніж при А генотипі вірусу.
Встановлено помірні кореляційні залежності між синтезом прозапальних та протизапальних цитокінів і клініко-патогенетичними синдромами хвороби, в залежності від генотипу HBV.
Вперше в Україні на підставі вивчення динаміки синтезу цитокінів у хворих із різними генотипами вірусу з врахуванням тяжкості та активності інфекційного процесу встановлені типи імунологічного реагування, що дозволяє прогнозувати клінічний перебіг і можливі наслідки хвороби.
Практичне значення одержаних результатів.
Доведена доцільність та необхідність визначення генетичної структури НВV та типу імунологічного реагування в комплексному обстеженні хворих з НВV-інфекцією, що зумовлено впливом генотипу вірусу на складні механізми імунопатогенезу хвороби.
Встановлення генотипу HBV та типу імунологічного реагування у хворих із різною тяжкістю ГГВ та активністю ХГВ дозволяє спрогнозувати клінічний перебіг хвороби, можливу хронізацію процесу, може визначити подальшу лікувальну тактику та диспансеризацію хворих. Про гладкий перебіг ГГВ з відсутністю затримки одужання та хронізації свідчать нормореактивний та гіперреактивний типи імунологічного реагування у хворих з генотипом D НВV, а гіпореактивний та дисоціативний типи імунної відповіді дають підстави передбачати затяжний перебіг та можливу хронізацію процесу, особливо у пацієнтів, які інфіковані генотипом А і тому при лікуванні цих хворих є доцільним призначення препаратів з імуномодулюючою дією.
У хворих на ХГВ дисоціативний та гіпореактивний типи імунологічного реагування вказують на хвилеподібний перебіг хвороби з частими періодами біохімічного загострення, які частіше спостерігаються у пацієнтів, з А генотипом HBV. Це необхідно враховувати при вирішенні питання про призначення імуномодулюючої та противірусної терапії.
Результати досліджень, що наведені в дисертації, впроваджені у педагогічний процес на кафедрі мікробіології, вірусології з курсом інфекційних хвороб медичного факультету Ужгородського національного університету, кафедрі інфекційних хвороб Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, кафедрі інфекційних хвороб Харківської медичної академії післядипломної освіти та використовуються в лікувальній практиці Ужгородської обласної інфекційної лікарні і Харківської обласної клінічної інфекційної лікарні.
Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведено патентно-інформаційний пошук та аналіз наукової літератури по темі дисертації, клінічне обстеження хворих з різною тяжкістю та активністю хвороби (155 хворих, з яких 76 – з ГГВ та 79 – з ХГВ). Організовано лабораторні та інструментальні дослідження. Комплексно проаналізовано та систематизовано отримані результати обстеження хворих, проведена їх статистична обробка. Автором написано всі розділи роботи, розроблено таблиці та рисунки, сформульовано висновки та практична значущість наукової роботи.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались і обговорювались на: науково-практичній конференції з міжнародною участю „Проблеми клініки, діагностики та терапії гепатитів” (31 березня – 1 квітня 2005 року, м.Харків); науково-практичній конференції з міжнародною участю „Інфекційні хвороби на межі тисячоліть” (21–23 вересня 2005 року, м.Чернівці); науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій 60-річчю УжНУ „Сучасні методи діагностики та лікування хронічних гепатитів, цирозів, гепатогенної виразки у клініці внутрішніх та хірургічних хвороб” (14–16 жовтня 2005 року, м.Ужгород); 60-й підсумковій науковій конференції професорсько-викладацького складу медичного факультету УжНУ (22 лютого 2006 року, м.Ужгород); VII з’їзді інфекціоністів України (26–29 вересня 2006 року, м.Миргород), VII з’їзді інфекціоністів Росії (25–27 жовтня 2006 року, м.Нижній Новгород, Росія), 61-й науковій конференції професорсько-викладацького складу медичного факультету УжНУ (22 лютого 2007 року, м.Ужгород); науково-практичній конференції з міжнародною участю „Хвороби печінки в практиці клініциста” (1–2 березня 2007 року, м.Харків); науково-практичній конференції і пленумі Асоціації інфекціоністів України „Хвороби печінки в практиці інфекціоніста” (26–27 квітня 2007 року, м.Донецьк).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових робіт, із яких: три статті в наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, та дев’ять тез виступів на конференціях.
Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду наукових джерел по темі дисертації, загальної характеристики хворих і методів дослідження, розділів власних досліджень з узагальненням результатів, висновків, практичної значущості та списку використаної літератури, який містить 229 джерел, з яких 127 – з кириличною графікою і 102 – з латинською графікою. Робота ілюстрована 37 таблицями та 20 рисунками. Повний обсяг дисертації становить 168 сторінок друкованого тексту.
Основний зміст роботи
Об’єкт і методи дослідження. Під нашим спостереженням у період з 2002 по 2006 роки перебувало 155 хворих з НВV-інфекцією, а саме: 76 пацієнтів на ГГВ та 79 – на ХГВ, які знаходилися на стаціонарному лікуванні в обласній інфекційній лікарні м.Ужгорода, гастроентерологічному відділенні Ужгородської центральної міської клінічної лікарні, гастроентерологічному відділенні обласної клінічної лікарні м.Ужгорода, або лікувалися амбулаторно в кабінеті інфекційних захворювань поліклініки №1 м.Ужгорода. Серед хворих було 83 (53,5%) жінок і 72 (46,5%) чоловіків. В основному переважали особи молодого та середнього віку – 117 (75,5%) і 38 осіб були старшого віку (24,5%). Відповідно до тяжкості перебігу ГГВ пацієнти були розподілені наступним чином: з середньотяжким перебігом – 65 осіб (85,5%), із тяжким – 11 (14,5%). Серед хворих на ХГВ мінімальна активність процесу спостерігалася у 67 хворих (84,8%), слабковиражена – у 12 (15,2%). На підставі детально зібраного анамнезу життя та хвороби, клінічних, лабораторних та інструментальних досліджень у обстежених хворих на ГГВ та ХГВ була виключена супутня патологія, яка б могла суттєво вплинути на результати досліджень. Контрольну групу становили 20 практично здорових осіб – донори крові, віком від 18 до 35 років, з них 14 чоловіків та 6 жінок.
Діагноз ГГВ та ХГВ встановлювали з урахуванням комплексу клініко-епідеміологічних, лабораторно-інструментальних даних та підтверджували виявленням у сироватці специфічних серологічних маркерів ГВ (HBsAg, анти-HBcIgM, анти-HBcIgG, у більшості хворих визначали НВeAg, анти-НВе) методом імуноферментного аналізу (ІФА) (ELISA), використовуючи тест-системи НВО"Диагностические системы" (Росія). На підставі негативних результатів індикації серологічних маркерів гепатитів А, С, D (анти-НАVIgM, анти-НСVсум., анти-НDVIgM) здійснювалося виключення мікст-гепатитів.Оцінка ступеня тяжкості ГГВ здійснювалась на основі критеріїв, запропонованих Ж.І.Возіановою (2001).Діагноз ХГ ставили згідно з Міжнародною Класифікацією Хвороб 10 перегляду та класифікацією, прийнятою на Міжнародному конгресі гастроентерологів (WCOG, Лос-Анджелес, 1994). Частота виявлення HBeAg-позитивного гепатиту склала 48,1% (38 пацієнтів із 79 хворих на ХГВ): 29 хворих з мінімальною активністю (76,3%) та 9 – з слабковираженою (23,7%); анти-HВe – 27,8% (22 хворих); у 5 хворих (6,3%) не виявлено ні HBeAg, ні анти-HВe.
Генодіагностичні дослідження включали визначення реплікативної активності НВV на підставі якісного виявлення в сироватці крові ДНК НВV методом ПЛР із використанням тест-систем ЦНДІ епідеміології МОЗ РФ (набір реагентів “Полігеп В” фірми “Літех”, Москва, Росія). Усім хворим було проведено генотипування ДНК НBV з використанням рестрикційного аналізу за методом М.Мizokami із співавт. (1999) у модифікації ЦНДІЕ м.Москви.
Сироваткові концентрації досліджуваних цитокінів: IJI-lβ, ΦΗΠ-α, ІЛ-6, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-10 визначалися за допомогою тест-систем ТОВ "Протеиновый контур" (Санкт-Петербург, Росія), користуючись інструкцією виробника з використанням твердофазного імуноферментного методу. У результаті проведених імунологічних досліджень здорових осіб були встановлені показники, прийняті для контрольної групи : ІЛ-1β – 29,49±3,1 пкг/мл; ФНП-α – 28,83±2,7 пкг/мл; ІЛ-6 – 11,85±1,1 пкг/мл; ІЛ-2 – 25,26±1,3 пкг/мл; ІЛ-4 – 20,73±1,5 пкг/мл; ІЛ-10 – 18,36±1,2 пкг/мл. Матеріалом для наших досліджень була сироватка крові хворих, яка при ГГВ отримана в розпалі хвороби і початку реконвалесценції, при ХГВ – відповідно, при загостренні хвороби та клініко-лабораторній ремісії.
Інші лабораторні показники у динаміці ГГВ та ХГВ визначалися за загальноприйнятими методиками: вміст загального білірубіну та його фракцій – методoм L. Jendrassik, P. Grof (В.В. Меньшиков, 1987), активність аланінамінотрансферази (АлАТ) – уніфікованим методом S. Reitman, S. Frankel (1987), тимолову пробу – методом J. Huerga, H. Popper та сулемову пробу – методом F. Grinstedt (1987), рівень загального білка – мікробіуретовим методом G. Kingsley, білкові фракції – турбодиметричним методом H. Popper (В.В. Меньшиков, 1987). Як норму біохімічних показників використовували загальноприйняті значення.
Усім хворим у динаміці хвороби здійснювалось УЗД органів черевної порожнини за допомогою ультразвукового сканера UltimaPro-30 виробництва „Радмір” (Харків, Україна) з використанням датчиків частотою 3,5 – 6 МГц за стандартною методикою. При оцінці ультразвукової картини ГВ використовувались діагностичні критерії (Sanders, 1991), що включали: розміри печінки, однорідність структури, розміри портальної і селезінкової вен, стан
8-09-2015, 19:39