Доклінічна фармакологічна оцінка лікарських засобів з натуральної сировини, призначенних для стимуляції неспецифічної резистентності та адаптаційних можливостей організму, має свої особливості. Це пов’язано, в першу чергу, з наявністю у препаратах названої групи складних комплексів біологічно активних сполук з широким спектром фармакологічної дії. Тому вивчення рівня їх біологічної активності проводять на спеціальних тестах.На дріжджовому тесті встановлено, що екстракт буркунуволодіє високою стимулюючою активністю. Три серії виявляють практично однаковий вірогідно виражений ефект (1050–1100 %). Необхідно відзначити, що рівень біологічної активності ФіБСу складає 110–120 %. Таким чином, у порівнянні з ним рівень біологічної активності екстракту буркунуу 9 разів вище.
На парабіотичному тесті перевірені три серії екстракту буркуну у наступних концентраціях: нативний препарат (per se), 0,1 і 0,01 % розчин. Найбільш високі результати були отримані при перевірці 0,1 % розчину: активність у даній концентрації перевищувала контрольні показники, у середньому, на 48,7 %.
На стрихніновому тесті встановлено, що попереднє введення екстракту буркуну у дозах 0,2; 0,3 і 0,5 мл викликає достовірне збільшення тривалості життя мишей на 86,9; 27,3 і 36,3 %, відповідно. Крім того, на фоні 100 % загибелі контрольних тварин при введенні стрихніну вижило 11; 11 і 22 % тварин, відповідно(р<0,05).
На фоні розвитку гострої гістотоксичної гіпоксії встановлено, що попереднє однократне введення екстракту буркуну у дозі 0,5 мл вірогідно подовжує тривалість життя мишей на 36 % у порівнянні з контролем.
Екстракт буркуну зменшує тривалість гексеналового сну на 20 % у порівнянні з контролем, що свідчить про посилення детоксикуючої функції печінки за рахунок активації мікросомальних ферментів гепатоцитів, метаболізуючих гексенал.
Вивчення гепатозахисних властивостей екстракту буркуну та ФіБСу проводили на моделі токсичного ураження печінки тетрахлорметаном (CCl4 ), генез якого пов’язаний з індукцією вільнорадикального окислення ліпідів.
Гостре отруєння ССl4 характеризувалося значними змінами усіх досліджуваних показників. В групі контрольної патології спостерігалося збільшення масового коефіцієнту печінки, зменшення загального білка, зростання активності трансаміназ у групі контрольної патології АлАТ– на 112,8 % і АсАТ– на 131,9 %, підвищення в сироватці крові проміжних (ДК) і кінцевих (МДА) продуктів окислення ліпідів у 4,3 і 6,7 рази.
Профілактично-лікувальне введення екстракту буркуну сприяло зменшенню коефіцієнта маси печінки та нормалізації загального білка практично до показників інтактних тварин. В групі, яка отримувала ФіБС, коефіцієнт маси печінки був на 25 % вищим (р<0,05).
На фоні попереднього введення екстракту буркуну і ФіБСу активність АлАТ збільшується лише на 62 %, а АсАТ на 74 і 86 %, відповідно (при контрольній патології АлАТ на 112,8 %, АсАТ на 131,9 %) . Профілактично-лікувальне введення вірогідно знижувало цитоліз гепатоцитів. При застосувані екстракту буркуну показники відновилися до рівня інтактних тварин. У групі, що отримувала ФіБС зберігалось достовірне підвищення активності ферментів цитолізу АлАТ і АсАТ на 30 % відповідно (рис. 1).
Рис. 1. Вплив профілактично-лікувального введення екстракту буркуну і ФіБСу на активність АлАТ і АсАТ сироватці крові щурів при гострій інтоксикації CCl4 , n=10
* - вірогідно відносно інтактного контролю (р<0,05);
** - вірогідно відносно групи контрольної патології (р<0,05).
Профілактичне введення досліджуваних препаратів сприяло менш виразному запальному процесу: стосовно контрольної патології екстракт буркуну знижав рівень ДК – у 1,8 (р<0,001) та МДА у 1,5 рази (р<0,01), ФіБС у 1,6 (р<0,001) та 1,3 рази (р>0,1) відповідно.
Профілактично-лікувальне введення екстракту буркуну виявило його виражену антиоксидантну активність, на що вказує достовірне зниження ДК і МДА практично до рівня інтактних тварин, у той час, як при застосуванні ФіБСу вони залишались достовірно підвищеними у 2,3 та 3,3 рази відповідно. Аналіз отриманих результатів показав, що обидва засобу володіють гепатопротекторними властивостями, однак екстракт буркуну виявляє більш виражений гепатозахисний ефект. Стабілізація порушень в гепатоцитах здійснюється завдяки корекції переокиснювання ліпідів.
Антитоксичні та мембраностабілізуючі властивості вивчали у кролів різного віку при 30-денному курсовому введенні екстракту буркуну. Через 30 днів від початку введення у піддослідній групі старих кролів (7 років), відзначено зниження відсотка затримки бромсульфалеїну з 35,8 до 22,3 (р<0,02): виведення фарби відбувалося в 1,6 рази швидше щодо вихідного рівня. У групі молодих кролів (1 рік) відсоток затримки бромсульфалеїну після курсового введення екстракту буркуну склав 11,7 % при 15,3 % вихідного рівня (р<0,02), у 1,3 рази прискорювалося виведення фарби в порівнянні з вихідними даними. Різниця у швидкості виведення фарби у молодих і старих кролів до початку досліду складала 2,3 рази, а після закінчення експерименту скоротилася до 1,9 рази.
Виявлено, що курсове введення екстракту буркуну сприяє підвищенню осмотичної резистентності еритроцитів (ОРЕ). У групі молодих кролів діапазон ОРЕ збільшився: max границя – з 0,29 % до 0,24 %; min границя – з 0,54 % до 0,53 % NaCl. У групі старих тварин, початок гемолізу був зареєстрований при 0,55 % концентрації NaCl, що супроводжувалося руйнуванням 20 % еритроцитарного пула. Повний гемоліз наставав при 0,3 % концентрації NaCl. Підвищення ОРЕ характеризувалося меншою кількістю одночасно зруйнованих клітин (10 %) у момент початку гемолізу при 0,53 % концентрації NaCl, при цьому повний гемоліз відбувався при більш низькій концентрації NaCl (0,24 %). При вивченні перекисної резистентності еритроцитів (ПРЕ) результати дослідження показали, що вихідний рівень перекисного гемолізу еритроцитів у старих кролів на 82 % вище, ніж у молодих. Стійкість еритроцитів до перекисів після закінчення експерименту зросла в групі старих кролів у 2 рази, в групі молодих кролів у 1,4 рази щодо вихідного рівня, тобто різниця між ними скоротилася і склала 21 % (рис. 2).
Рис. 2. Вплив курсового введення екстракту буркуну на ПРЕ у кролів різного віку, контроль (n=5), дослід (n=10)
*- вірогідно в порівнянні з вихідним рівнем (р<0,05);
** - вірогідно в порівнянні вікових груп (р<0,05).
Отримані результати свідчать, що у тварин з віком спостерігається виснаження антиоксидантної системи та зростає потреба у забезпеченні організму додатковою кількістю антиоксидантів. Крім того, дефіцит ендогенних антиоксидантів може бути також пов’язаний із зниженням засвоєння вітамінів та інших фізіологічно-активних речовин у шлунково-кишковому тракті старих тварин.
Виявлено, що вміст водорозчинних антиоксидантів в крові старих кролів до початку експерименту був в значній мірі знижений при порівнянні з молодими (12,4 ± 1,0 мекв/л крові проти 19,3 ± 1,0 мекв/л крові) і становив 64 %. Вміст жиророзчинних антиоксидантів в крові старих тварин відносно молодих склав79,2 % (8,0 ± 0,6 мкекв/л крові проти 10,1 ± 0,8 мкекв/л крові). Активність каталази в плазмі крові 7-річних кролів (315,2 ± 21,2 мккат/л) при порівнянні з 1- річними (502,4 ± 34,1 мккат/л) складала 62 % (р<0,05).
Застосування екстракту буркуну викликало у молодих кролів суттєве підвищення вмісту водо- і жиророзчинних антиоксидантів вже через 15 днів після введення до 118 і 109 %, через 30 днів до 132 і 116 % відповідно. Відзначалося також вірогідне зростання активності каталази на протязі експерименту, що складало через 15 і 30 днів 110 і 116 %.
У старих кролів на 15 день після введення екстракту буркуну, на відміну від молодих, не відзначалося вірогідних змін вмісту жиророзчинних антиоксидантів та активності каталази в крові, а спостерігалась лише тенденція до підвищення їх рівня. Вміст водорозчинних антиоксидантів на 15 день спостереження підвищився до 113,7 % щодо вихідного рівня (р<0,01). Через 30 днів рівень зазначених показників в крові становив, а саме: вміст водо- і жиророзчинних антиоксидантів 130,6 і 112,5 % відповідно (р<0,05). При дослідженні активності каталази в печінці молодих і старих кролів після курсового введення екстракту буркуну встановлено, що активність ферменту у старих тварин підвищувалась до 132,8 % (35,2 ± 2,2 мккат/г тканини) проти контролю (26,5 ± 2,3 мккат/г тканини), а у молодих – до 128,0 % (49,4 ± 3,2 мккат/г тканини) проти контролю (38,6 ± 2,8 мккат/г тканини).
Встановлена висока антиагрегаційна активність екстракту буркуну у дослідах in vitro (на 70–80 % інгібуючи агрегацію тромбоцитів крові у порівнянні з контролем), що практично в 3 рази перевищує показники ФіБСу.
Отримані результати показників гемостазу свідчать про те, що обидва препарати володіють гіпокоагулянтними властивостями,алеекстракт буркунувикликає більш виражений гіпокоагулянтний ефект. Так, через тиждень від початку введення (доза 0,3 мл/кг) відбувається достовірне подовження тромбінового часу (ТЧ) на 30 % (р<0,05), а через два і три тижні на 77 % (р<0,001; р<0,02), в той час, як ФіБС викликає подовження ТЧ на 55 і 60 %, відповідно.
При дослідженні протромбінового часу (ПЧ)відзначалось наступне: наприкінці першого тижня введення екстракту буркуну подовження ПЧ склало 37 % (р<0,02) і 13 % (р>0,05) при введенні ФіБСу. Через два тижні ПЧ збільшилося на 67 % (р<0,02) для екстракту і на 27 % (р<0,05) для ФіБСу. Через три тижні подовження цього показника для екстракту буркуну склало 74 % (р<0,02) і 35 % (р<0,02) – для ФіБСу.
По тесту активованого парціального тромбопластинового часу (АПТЧ) спостерігалося достовірне збільшення цього показника протягом курсового введення екстракту буркуну (на 33, 53, 68 %, відповідно). У ФіБСу ці зміни були недостовірними.Вміст фібриногену після двох тижнів введення екстракту буркуну знизився на 41 % (р<0,05) і зберігався на цьому рівні через три тижні. При тритижневому введенні ФіБСу цей показник практично не відрізнявся від вихідних даних.
У серії експерименту (доза 1,0 мл/кг) зміни досліджуваних показників крові носили характер аналогічний дозуванню 0,3 мл/кг. Однак через три тижні препарат ФіБС вже вірогідно викликає подовження ПЧ на 54 % при рівнобіжному зниженні вмісту фібриногену на 42 %. Екстракт буркуну викликав збільшення АПТЧ, ПЧ, що практично відповідало попереднім даним. ТЧ через три тижні подовжився на 68 % при зниженні вмісту фібриногену на 50 % (р<0,001).
При введенні 3,0 мл/кг отримані дані зберігали тенденцію, аналогічну змінам показників попередніх серій експерименту. При цьому обидва засоба виявили статистично значиму гіпокоагулянтну дію. Встановлено, що екстракт буркуну володіє більш виразним гіпокоагулянтним ефектом у порівнянні з ФіБСом: через три тижні ТЧ подовжилося на 85 %, а при введенні ФіБСу – на 73 %. Відзначено подовження ПЧ на 87 % (екстракт буркуну) і на 61 % (ФіБС); Показник АПТЧ під впливом екстракту збільшився на 88 % проти 63 % – у ФіБСу. Вміст фібриногену зменшився на 68 і 64 %, відповідно. Через тиждень післядії у ФіБСу показники гемостазу практично відповідали вихідному рівню. Для екстракту буркуну зберігалося подовження ТЧ на 32 % (р<0,01); ТЧ і АПТЧ на 13 % і зменшення вмісту фібриногену на 61%. Через два тижні післядії ТЧ практично відповідав вихідному рівню. Подовження ПЧ і АПТЧ склало 18 і 12 % (р<0,05), відповідно, а вміст фібриногену був нижче вихідного рівня на 18 % (р>0,05). Таким чином, екстракт буркуну і ФіБС при курсовому тритижневому введенні виявляють односпрямовану гіпокоагулянтну дію. Однак, екстракт буркуну за всіма показниками виявив більш виражені гіпокоагулянтні властивості, у 1,3–1,5 рази перевищуючи показники ПЧ і АПТЧ ФіБСу (у трьох дозуваннях). 10 – кратне збільшення дози екстракту буркуну не викликало значимих зрушень досліджуваних показників, що може бути пов'язане з позитивним фармакологічним впливом на поліпшення кровообігу, активацію метаболізму, зменшення реабсорбції і гідрофільності в нірках. За даними Р.Б. Косуба (2003) відзначено стимулюючий вплив екстракту буркуну на калій- і натрій-уретичні показники. Враховуючи, що зміни зсідання можуть залежать і від стану фібринолітичної системи, досліджували показники фібринолізу. На відміну від ФіБСу екстракт буркуну при всіх дозах виявляє стимулюючу дію на фібринолітичну ланку гемостазу, що підтверджується певним скороченням часу еуглобулінового лізису (показник фібринолітичної активності збільшився практично в 1,3 рази) і зміцненням активності Хагеман-залежного фібринолізу – каолін-індукований лізис фібринових згустків скоротився на 21, 28, 29 % відповідно.
Враховуючи гіпокоагулянтні, фібринолітичні, антиагрегаційні властивості екстракту буркуну вважалось можливим використати його при лікуванні експериментальної гіфеми, припустивши, що він здатний підсилювати процес розсмоктування крові у передній камері ока. Критерієм оцінки фармакологічної активності екстракту буркуну було скорочення термінів розсмоктування гіфеми в порівнянні з контрольною патологією. В групі контрольної патології на всіх термінах розсмоктування гіфеми спостерігалося підвищення внутрішньоочного тиску (ВОТ): у 1 добу на 33 %, 5 добу – на 26 %, 9 добу – на 26 % щодо вихідного рівня. Скоріше усього це викликано заткненням дренажної системи ока клітинами крові, що захоплюються природним струмом водянистої вологи. У групах, що одержували екстракт буркуну підкон’юнктивально і підшкірно, достовірного підвищення ВОТ у першу добу не спостерігалося, на 5 добу було незначно знижено на 13,5 і на 12,0 %, на 9 добу на 14,8 і на 14,0 % відповідно. Через добу після розсмоктування кров'яного згустку ВОТ залишалося нижче вихідного рівня на 13,0 і на 12,5 % відповідно (рис. 3). Встановлено, що екстракт буркуну здатний нормалізувати мікроциркуляторні і метаболічні порушення при даній патології, внаслідок чого знижувався ВОТ.
Рис. 3. Вплив екстракту буркуну на динаміку ВОТ при експериментальної гіфеми (n=10)
*- вірогідність порівняно з вихідним рівнем (р<0,05).
В усіх групах у першу добу спостерігалося практично однакове підвищення коагуляційної активності слізної рідини (СР) на 44,9; 47; 46,8 % відповідно. У контрольній групі на 5 добу вона склала 143,9 %, на 9 добу 128,4 % і через добу після розсмоктування гіфеми –115,7 % відносно вихідного рівня. У групах, що одержували екстракт буркуну підкон’юнктивально і підшкірно, на 5 добу коагуляційна активність СР знижувалась на 23,8 і 15,7 %, на 9 добу на 17,5 і 16,5 % відповідно. Через добу після розсмоктування кров'яного згустку коагуляційна активність СР не відрізнялася від вихідного рівня. Зміни фібринолітичної активності СР у динаміці в цілому носили односпрямований характер. У групі контрольної патології відзначене підвищення фібринолітичної активності через добу – на 19,0 %, 5 доба – на 42,7; 9 доба – на 37,0 %.
При підкон’юнктивальному і підшкірному введенні відзначалося більш значне збільшення фібринолітичної активності через добу – на 28,7 і 27,6 %, 5 доба – на 73,2 і 64,2 %, 9 доба – на 93,8 і 82,4 % відповідно. Через добу після розсмоктування гіфеми ці показники перевищували вихідні дані на 11,0 % (р<0,05).
Таким чином, застосування екстракту буркуну при крововиливі в передню камеру ока значно збільшує фібринолітичний потенціал СР і нормалізує її коагуляційну активність, що дозволяє скоротити терміни розсмоктування крововиливу на 5–6 днів раніше у порівнянні з контролем. Екстракт буркуну оказує однаковий лікувальний ефект при даній патології незалежно від способу введення і сприяє швидкому розсмоктуванню кров’яного зсідка з мінімальним ризиком побічного впливу на ушкоджені структури ока кроля.
ВИСНОВКИ
У дисертації наведено нове рішення актуальної наукової проблеми, що виявляється в теоретичному та експериментальному обгрунтуванні ефективності застосування водного екстракту буркуну, як комплексного рослинного біорегулятора із специфічною фармакологічною дією на систему гемостазу.
1. На підставі розроблених методів хроматографічної ідентифікації кумарину і його похідних і спектрофотометричного визначення сукупності кумаринів визначено якісний і кількісний вміст суми кумаринів в екстракті буркуну, що складає не менше 0,09 %.
2. За даними вивчення гострої токсичності встановлено, що екстракт буркуну відноситься до малотоксичних речовин (IV клас токсичності). При вивчені субхронічної токсичності у печінкових клітинах встановлено накопичення кількості рибосом, полісом, мітохондрій, зернистої ендоплазматичної сітки, глікогену, що свідчить про його активуючу дію на білоксинтезуючу та енергоутворюючу функції гепатоцитів. На тестах для природних біологічно активних речовин (дріжджовий, парабіотичний, стрихніновий, гістотоксична гіпоксия) виявлено високий рівень біологічної активності екстракту буркуну з антитоксичною спрямованістю фармакологічної дії. В залежності від дози зростали тривалість життя і виживаність лабораторних тварин. Курсове введення екстракту буркуну підвищує детоксикаційну функцію печінки: відзначено достовірне зменшення тривалості гексеналового сну на 20 %.
3. Встановлено гепатозахисну дію екстракту буркуну при моделюванні токсичного ураження печінки CCl4
. Профілактичне введення екстракту буркуну виявило антицитолітичний ефект на що вказує зниження активності АлАТ і АсАТ у 1,3 рази і виражену антиоксидантну активність – зниження
8-09-2015, 20:02