Наступним етапом роботи було порівняльне дослідження ефективності кріоконсервування КТ, виділених з донорської крові двома різними методами. Виявилося, що кріоконсервування КТ з ДМСО за програмою №1 призводить до значного порушення або втрати здатності тромбоцитів до накопичення АО. Про це свідчить збільшення у КТ після відігрівання вмісту активованих форм тромбоцитів та наявність формених елементів, що не включають флуорохром –акридин-негативних (рис. 1).
Для кращої репрезентації здатності популяції в цілому до накопичення АО ми ввели інтегральний показник – індекс акумуляції флуорохрому (ІАФ), для обчислення якого застосували формулу Астальді і Верга [Меньшиков В.В., 1982]. Розрахований для зразків ЗТП ІАФ (2,84 ± 0,057) виявився достовірно вищим порівняно з ІАФ, розрахованими для КТ із ЗТП (1,57 ± 0,039) та КТ з ЛТШ (1,75 ± 0,058). ІАФ тромбоцитів КТ із ЗТП виявився достовірно нижчим, ніж ІАФ КТ з ЛТШ не тільки до, а й після кріоконсервування (відповідно 0,79 ± 0,025 та 0,98 ± 0,023).
У результаті кріоконсервування значно порушувалася також агрегаційна здатність тромбоцитів та РГШ (рис. 2). Встановлено, що збереженість цих морфофункціональних властивостей тромбоцитів після відігрівання значною мірою залежить від ступеня активації/травматизації останніх перед заморожуванням. Саме тому вибір способу одержання тромбоцитів для подальшого їх кріоконсервування є надзвичайно важливим. Метод виділення КТ з ЛТШ забезпечує менший ступінь активації кров’яних пластинок, нижчий вміст тромбоцитарних агрегатів та залишкових клітин і, як результат, – вищий рівень збереженості морфофункціональних властивостей клітин після кріоконсервування. У подальших експериментах з кріоконсервування ми використовували КТ, виділені з ЛТШ.
Активація вільнорадикальних процесів із залученням мембранних ліпідів при заморожуванні-відігріванні сприяє поглибленню структурної дезорганізації мембран та розвитку їх деструкції [RichterE. etal., 1985; Белоус А.М., 1997]. Порівняльне дослідження антирадикальних властивостей органічних сполук різних хімічних класів, що найчастіше застосовуються при низькотемпературному консервуванні тромбоцитів, показало: всі кріопротектори з ряду досліджених мають здатність перехоплювати гідроксильні радикали в модельній системі їх генерації і за даною властивістю розташувалися у порядку зростання: ГЛ < ДМАЦ < ОЕГn=5 ≈ 1,2-ПД < ДМСО. Метою наступного етапу нашої роботи було дослідити, яким чином впливає введення кріопротекторів у концентраціях, що використовуються при кріоконсервуванні тромбоцитів крові людини, на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”. Вміст ГПЛ у системі “тромбоцити-плазма” достовірно не підвищувався після введення у неї ДМАЦ і 1,2-ПД у кінцевій концентрації 0,5 та 0,7 М (рис. 3). Введення у систему “тромбоцити-плазма” ДМСО, гліцерину, ОЕГn=5 у будь-якій концентрації та 1,2-ПД і ДМАЦ у кінцевій концентрації 1 М супроводжувалося достовірним підвищенням вмісту ГПЛ порівняно з контролем. Протягом наступних 30 хвилин не відбувалося достовірних змін вмісту ГПЛ в окремо взятих системах “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” незалежно від концентрації останнього.
Присутність у системі “тромбоцити-плазма” таких кріопротекторів, як ГЛ та ОЕГn=5 у досліджуваних концентраціях призводила до достовірного підвищення інтенсивності індукованого іонами заліза ПОЛ порівняно з контролем (рис. 4). Інтенсивність індукованого ПОЛ у системі за присутності ДМАЦ, 1,2-ПД та ДМСО у концентрації 0,7 М залишалася на рівні контролю.
Очевидно, характер впливу кріопротектора на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”, перш за все, визначається його хімічною природою та концентрацією. Можливо, структурні зміни мембрани, пов’язані з відносно швидким додаванням повільно проникаючого через мембрану тромбоцитів ГЛ та непроникаючого ОЕГn=5, роблять її більш чутливою до окислювальних впливів. Нам не вдалося виявити залежності між здатністю кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі та характером їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”.
Важливою умовою адекватної оцінки морфофункціонального стану тромбоцитів на етапах кріоконсервування є максимальне видалення кріопротектора із суспензії кров’яних пластинок. Процедура видалення кріопротекторів, яку зазвичай здійснюють центрифугуванням з наступним ресуспендуванням осаджених клітин у плазмі, призводить до додаткового суттєвого пошкодження кров’яних пластинок [ZilberM. etal., 2003; SchoenfeldH. etal., 2005]. Нами був розроблений і апробований спосіб максимального видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів за умов мінімального механічного та осмотичного навантаження на кров’яні пластинки [Пат. №15014 Україна, 2006]. Застосування розробленого способу в наших дослідженнях дозволило отримати більш достовірну інформацію щодо впливу кріопротекторів та інших факторів кріоконсервування на морфофункціональний стан тромбоцитів.
Дослідженнями встановлено, що експозиція КТ з ДМСО, ДМАЦ та 1,2-ПД у кінцевій концентрації 0,7 М не супроводжується помітними змінами морфофункціональних властивостей тромбоцитів: здатності до акумуляції АО, індукованої АДФ та колагеном агрегації, РГШ. Достовірні зміни морфофункціональних властивостей тромбоцитів спостерігалися при підвищенні концентрації кріопротекторів у суспензії клітин до 1,4 М: у КТ збільшувався вміст активованих форм та агрегатів, зменшувався показник гранулярності, змінювалися показники агрегаційної здатності та РГШ. Так як обрані кріопротектори у кінцевій концентрації 0,7 М не викликали значних змін морфофункціонального стану тромбоцитів, у подальших експериментах з кріоконсервування вони застосовувалися у даній концентрації.
Відомо, що одним із відповідальних етапів при низькотемпературному консервуванні є охолодження біологічного об’єкта в температурному інтервалі кристалізації кріобіологічної системи. Значний вплив на характер кристалізаційних процесів мають швидкість охолодження та ступінь переохолодження [Белоус А.М. и др., 1987]. На першому етапі було досліджено вплив процедури заморожування КТ з 0,7 М ДМСО та без кріопротектора в температурному інтервалі від 0/-1,5 до -35…-40 єC на ступінь пошкодження тромбоцитів, визначений за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі, та на показники їх морфофункціональної збереженості. Отримані результати свідчать, що заморожування за програмою №2, яка передбачає застосування процедури температурної ініціації кристалізації, має результатом значно менший ступінь пошкодження тромбоцитів, ніж заморожування за лінійною програмою №1 (рис. 5). Причому, в присутності кріопротектора значення процедури ініціації кристалізації було помітно меншим, ніж за його відсутності. Не виявлено достовірних відмінностей між показниками пошкодження тромбоцитів після заморожування КТ без кріопротектора за програмою №2 з ініціацією кристалізації та після кріоконсервування КТ з 0,7 М ДМСО за лінійною програмою №1. Так як програма №2 передбачає застосування не тільки процедури ініціації кристалізації, а й наступної контрольованої (6 – 7 °C/хв) швидкості охолодження, ми вирішили дослідити значення швидкості охолодження кріобіологічної системи після ініціації кристалізації. Для цього додатково застосували програму №3, що забезпечувала швидкість охолодження в зазначеному температурному інтервалі 0,2 – 0,3 °C/хв. Ступінь пошкодження тромбоцитів, заморожених з 0,7 М ДМСО та без кріопротектора за програмою №3, виявився достовірно вищим, а рівень збереженості функціональних властивостей – нижчим, ніж заморожених за програмою №2. Зменшення швидкості охолодження призвело до збільшення часу знаходження клітин у системі, що кристалізується. Очевидно, основним механізмом пошкодження клітин за цих умов став так званий “ефект розчину”, значення якого в присутності кріопротектора було помітно меншим. Отже, лише поєднання процедури зняття переохолодження з наступною певною контрольованою швидкістю охолодження в температурному інтервалі кристалізації може забезпечити істотне зниження ступеня пошкодження кров’яних пластинок.
Дослідженнями останніх років виявлено явище низькотемпературного евтектичного розшарування розчину ДМСО і показано, що даний фізичний чинник може викликати летальні пошкодження кріолабільних клітин [KyryliukG.L. etal., 2006]. Зменшити його вплив запропоновано шляхом проходження температурного інтервалу, в якому відбувається евтектичне розшарування розчину кріопротектора, з підібраною експериментально швидкістю охолодження. Тому важливим було дослідити вплив швидкості заморожування КТ з 0,7 М ДМСО в зоні евтектичних температур (від -35…-40 до -80 єC) на ступінь пошкодження кров’яних пластинок. З підвищенням швидкості проходження даного температурного інтервалу (від 0,5 – 1 до 25 – 30 єC/хв) спостерігалася тенденція до зменшення ступеня пошкодження кріоконсервованих тромбоцитів (рис. 6). Але швидкість, що реалізувалася при прямому зануренні зразка у рідкий азот (програма №1), була занадто великою, про що свідчить підвищення активності Г6ФДГ і ЛДГ у позаклітинному середовищі (р<0,05). Показники агрегації тромбоцитів, кріоконсервованих за програмами з різними швидкостями охолодження в зоні евтектичних температур, достовірно не відрізнялися між собою. Достовірні відмінності виявлені між показниками РГШ тромбоцитів, заморожених за програмами №1 та №7, 8.
Ступінь пошкодження тромбоцитів після кріоконсервування за програмою Balint B. (№8), яка передбачала проходження з різною контрольованою швидкістю інших температурних інтервалів, достовірно не відрізнявся від аналогічних показників після кріоконсервування за програмами №2,4,5,6,7. Ефективність даної програми заморожування виявилася достовірно вищою порівняно з програмами №1 та №3 (рис. 5; 6).
Таким чином, швидкість охолодження суспензії тромбоцитів у температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур є фактором, що має визначальний вплив на ефективність кріоконсервування КТ.
Дослідження впливу композиційного складу середовища кріоконсервування на морфофункціональні показники кріоконсервованих тромбоцитів показали, що найвищий рівень збереженості індукованої АДФ агрегації забезпечив ДМАЦ та його комбінації з 1,2-ПД (рис. 7А). За здатністю зберігати дану властивість тромбоцитів досліджені кріопротектори та їх комбінації розмістилися в порядку зростання: 0,7 М 1,2-ПД ≤ 0,7 М ДМСО < 0,7 М ДМАЦ ≈ 0,35 М ДМАЦ + 1,2-ПД ≤ 0,7 М ДМАЦ + 1,2-ПД. Найбільш високий рівень збереженості індукованої колагеном агрегації тромбоцитів забезпечив ДМСО при застосуванні програми заморожування №2 з ініціацією кристалізації (рис. 7Б). Не виявлено достовірних відмінностей між даною здатністю тромбоцитів, кріоконсервованих з ДМСО за програмою №1 без ініціації кристалізації, з ДМАЦ за обома програмами та комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД за програмою №2.
Найвищий ступінь збереженості РГШ спостерігався після кріоконсервування КТ з ДМСО за обома програмами та з 0,7 М комбінацією ДМАЦ + 1,2-ПД за програмою №2 з ініціацією кристалізації (рис. 7В). Причому, за даним тестом не виявлено достовірних відмінностей між результатами кріоконсервування КТ з ДМСО за лінійною програмою №1 та з 0,7 М комбінацією ДМАЦ з 1,2-ПД за програмою №2 з ініціацією кристалізації. Відмінностей між ступенем агрегації та РГШ тромбоцитів, заморожених за різними програмами в однакових за складом кріозахисних середовищах, також не виявлено (р>0,05). Достовірно вищі показники агрегації та РГШ тромбоцитів, заморожених з 0,35 М комбінацією ДМАЦ + 1,2-ПД за програмою №2, ніж за програмою №1, свідчать про те, що зі зменшенням вмісту кріопротектора у кріозахисному середовищі значення програми заморожування зростає.
Здатність ДМАЦ у досліджених концентраціях суттєво пригнічувати активність ЛДГ та Г6ФДГ, ускладнила аналіз даних, отриманих за даним тестом. Оцінка ступеня пошкодження тромбоцитів за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі виявилася прийнятною при порівнянні ефективності програм заморожування за умови використання одного кріопротектора, або кріопротекторів різних хімічних класів, які не впливають на активність зазначених ферментів. За даним тестом ефективність кріоконсервування за програмою з ініціацією кристалізації є вищою, ніж за програмою без ініціації кристалізації при застосуванні всіх досліджуваних кріопротекторів і їх комбінацій (рис. 8). Кріоконсервування з ДМСО має результатом менший ступінь пошкодження, ніж кріоконсервування з 1,2-ПД та 0,35 М комбінацією ДМАЦ з 1,2-ПД.
Вперше для оцінки кріоконсервованих тромбоцитів нами був застосований метод люмінесцентної мікроскопії з використанням АО. Найбільша кількість акридин-негативних форм спостерігалася після кріоконсервування з ДМАЦ та 1,2-ПД (відповідно 53 ± 6 % та 49 ± 8 %). Не виявлено достовірних відмінностей між вмістом акридин-позитивних і гранулярних тромбоцитів після кріоконсервування з ДМСО (відповідно 67 ± 8 % і 29 ± 4 %) та комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД (відповідно 0,7 М: 47 ± 4 % і 14 ± 5,6 %; 0,35 М: 57 ± 4 % і 25 ± 6,5 %). Слід зазначити, що КТ, заморожені без кріопротектора за програмою №2 з температурною ініціацією кристалізації за субпопуляційний складом займали проміжне положення між КТ, кріоконсервованими з ДМАЦ і 1,2-ПД з одного боку та КТ, кріоконсервованими з ДМСО і комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД з іншого: акридин-позитивних – 55 ± 5,6 %, гранулярних – 20 ± 5 %. Заморожування КТ без кріопротектора за програмою №2 з температурною ініціацією кристалізації мало результатом значно вищий вміст акридин-позитивних та нижчий – акридин-негативних тромбоцитів порівняно із заморожуванням за лінійною програмою №1.
Аналіз результатів дослідження кріопротекторної активності обраних органічних сполук показав, що за показниками структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів застосування комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД підвищує ефективність кріоконсервування тромбоцитів порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо. Отримані дані дозволяють рекомендувати дану комбінацію кріопротекторів у якості основи кріозахисного середовища при розробці технології низькотемпературного консервування тромбоцитів для клінічного застосування.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі проведено теоретичне узагальнення проблеми низькотемпературного консервування тромбоцитів крові людини і експериментально обґрунтований новий підхід до її вирішення. На основі дослідження впливу ряду факторів кріоконсервування на показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів визначені умови підвищення збереженості їх життєздатності та гемостатичного потенціалу на етапах низькотемпературного консервування.
1. Встановлено, що композиційний склад кріозахисного середовища і швидкість охолодження суспензії клітин в температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур мають визначальний вплив на параметри структурної цілісності та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів (агрегаційна здатність, реакція на гіпотонічний шок, здатність до накопичення флуорохрому, активність цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі). Вперше експериментально доведена доцільність використання комбінацій кріопротекторів у складі кріозахисного розчину при кріоконсервуванні тромбоцитів.
2. Показано важливе значення ступеня активації тромбоцитів на етапі виділення з донорської крові: концентрати тромбоцитів, отримані з лейко-тромбоцитарного шару, характеризувалися за всіма досліджуваними параметрами нижчим ступенем активації і виявили вищий рівень збереженості морфофункціональних властивостей до і після кріоконсервування порівняно з концентратами тромбоцитів, отриманими із збагаченої тромбоцитами плазми.
3. Встановлено, що всім дослідженим кріопротекторам притаманна антирадикальна активність. За здатністю перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі їх генерації кріопротектори розташувалися у порядку зростання: гліцерин < диметилацетамід < оксиетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 5 ≈ 1,2-пропандіол < диметилсульфоксид.
4. Характер впливу кріопротекторів на інтенсивність перекисного окислення ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” залежить від їх хімічної природи та концентрації. З ряду досліджених кріозахисних сполук 1,2-пропандіол та диметилацетамід у кінцевій концентрації 0,7 М суттєво не впливають на рівень пероксидації ліпідів, навіть за умови індукції іонами заліза. Не виявлено залежності між здатністю кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів в модельній системі та характером їх впливу на процеси перекисного окислення ліпідів в системі “тромбоцити-плазма”.
5. Експозиція тромбоцитів протягом 30 хвилин з диметилсульфоксидом, диметилацетамідом та 1,2-пропандіолом у кінцевій концентрації 0,7 М, за умов мінімізації осмотичного та механічного стресу при введенні та видаленні кріопротекторів розробленим способом [Пат. №15014 Україна, 2006], не викликає значних змін їх морфофункціонального стану. З підвищенням концентрації кріопротекторів до 1,4 М виявляються ознаки активації, порушення агрегаційних та осморегуляторних властивостей тромбоцитів.
6. Встановлена залежність збереженості структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів від швидкості охолодження у температурному інтервалі кристалізації (від 0/-1,5 до -35…-40 єC). Значення фактору швидкості охолодження в даному температурному інтервалі зростає зі зменшенням вмісту кріопротектора у складі кріозахисного середовища, а особливо – за його відсутності. Процедура температурної ініціації кристалізації сприяла підвищенню ефективності кріоконсервування концентратів тромбоцитів лише за умови наступного застосування певної контрольованої швидкості охолодження. Розроблена програма заморожування концентратів тромбоцитів, яка передбачає процедуру температурної ініціації кристалізації з подальшим охолодженням зі швидкістю 6 – 7 °С/хв в даному температурному інтервалі.
7. Експериментально доведена важливість застосування контрольованої швидкості охолодження в зоні евтектичних температур (від -35…-40 до -80 єC). Порівняльний аналіз результатів кріоконсервування концентратів тромбоцитів з диметилсульфоксидом виявив залежність ступеня пошкодження тромбоцитів від швидкості охолодження в даному температурному інтервалі: спостерігалася тенденція до підвищення збереженості тромбоцитів при охолодженні із швидкістю 25 – 30 єC/хв у порівнянні із швидкостями 0,5 – 1 °С/хв, 5 – 7 °С/хв, 10 – 15 °С/хв та достовірні відмінності у порівнянні зі швидкістю, що реалізується при прямому зануренні в рідкий азот.
8. Заморожування тромбоцитів за розробленою програмою у середовищі, що містить комбінацію диметилацетаміду з 1,2-пропандіолом у кінцевій концентрації 0,7 М, підвищує рівень збереженості структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів після кріоконсервування порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо.
9. Експериментально визначені умови підвищення ефективності кріоконсервування концентратів тромбоцитів людини є реальною основою подальшої розробки і впровадження в роботу низькотемпературних банків крові технології їх довгострокового низькотемпературного зберігання для використання у практичній медицині.
ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Компанієць А.М., Книш О.В., Гуріна Т.М., Богданчикова О.А., Овсянніков С.Є., Погребняк М.Л. Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування // Проблемы криобиологии. – 2006. – Т. 16, № 2. – С. 182 – 191.
2. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Нікітченко Ю.В., Компанієць А.М. Дослідження антирадикальних властивостей кріопротекторів та їх впливу на
8-09-2015, 21:55