В зв’язку з цим, досліджували вплив екстракту “Локорин” на кожну стадію запалення: альтерацію, ексудацію та проліферацію.
Поглиблене вивчення антиексудативної активності проводили на моделях запалення задньої кінцівки у щурів з використанням різних флогогенів (зимозановий і гістаміновий набряки).
Аналіз результатів дослідження на моделі зимозанового набряку показав, що екстракт “Локорин” проявляв виражену антиексудативну активність, про що свідчило достовірне зменшення об’єму лапи щурів протягом всього експерименту (середня активність 38,6%). Оскільки екстракт виявляв високу антиексудативну активність (59,9 %) через 0,5 години (пік запалення) після введення тваринам зимозану, то можна припустити, що він має антиліпооксигеназну активність, яка перевершує активність диклофенаку натрію (29,8%), для якого характерна висока антициклооксигеназна дія (рис.4). Це підтверджується даними літератури, що лікарські препарати, які мають у своєму складі фенольні сполуки, інгібують ліпооксигеназу (DehmlowC. etal., 1996). В той же час на 3-й годині експерименту антиексудативна активність екстракту “Локорин” становила 38,8%. Останнє дозволяє припустити, що на ранніх етапах розвитку запального процесу він активно пригнічує утворення лейкотриєнів, а через 3 години помірно гальмує синтез ПГ.
Рис.4. Антиексудативна активність екстракту “Локорин” на моделі зимозанового та гістамінового набряків задньої кінцівки у щурів.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до диклофенаку натрію (р£ 0,05).
На моделі гістамінового набряку екстракт “Локорин” активно пригнічував розвиток набряку протягом 2-х годин (середня активність 43,4%). Антиексудативна активність препаратів порівняння диклофенаку натрію становила 40,8%, а кверцетину 35,9%. На рисунку 4 показано, що через 0,5 години (пік запалення) досліджуваний екстракт виразно зменшував ступінь набряку на 51,3% і не поступався ефекту референс-препаратів. Отримані дані пояснюються потужною судинозміцнювальною дією флавоноїдів (Чекман І.С., 2000), які входять до складу екстракту “Локорин”. Внаслідок цього зменшується проникливість кровоносних судин, що призводить до інволюції набряку.
В умовах гострого перитоніту у щурів, де в якості флогогену використовували розчин Люголя, після лікування екстрактом “Локорин” спостерігалось зниження приросту окружності черева у тварин в 2,1 рази в порівнянні з контрольною патологією. Антиексудативна активність екстракту становила 57,5% (рис. 5) і супроводжувалась більш низьким рівнем у сироватці крові тварин ГП, сіалових кислот, вміста середніх молекул (у 1,3; 1,8 та 1,9 рази, відповідно), ніж у щурів контрольної групи. Отримані результати свідчать про спроможність екстракту “Локорин” перешкоджати деструкції клітинних мембран і вираженій інтоксикації організму за рахунок обмеження ексудативних процесів.
Антиексудативна активність його співставлювана з аналогічним ефектом диклофенаку натрію (55,5%) і перевищувала ефект кверцетину (37,9%). Вірогідні переваги досліджуємого екстракту щодо гальмування впливу на вивільнення маркерів інтоксикації – середніх молекул і сіалових кислот, пов’язані, ймовірно, з дещо відмінним від кверцетину механізмом антиексудативної дії, а саме домінуючим впливом на ліпооксигеназний і вираженим на циклооксигеназний шляхи метаболізму арахідонової кислоти.
Таким чином, результати дослідів з вивчення протизапальної дії екстракту “Локорин” на всіх експериментальних моделях гострого запалення свідчать про високу антиексудативну активність.
Рис.5. Антиексудативна активність екстракту “Локорин” на моделі гострого асептичного перитоніту у щурів.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до диклофенаку натрію(р£ 0,05);
3. *** - відмінність достовірна по відношенню до кверцетину (р£ 0,05).
Вивчення антипроліферативної активності екстракту “Локорин” показало, що вона була незначною і складала (29,1 %). Це співпадає з даними літератури, які підтверджують, що поліфенольні сполуки не спроможні активно подавляти фазу проліферації запалення (Чернов Ю.Н. и соавт., 1990).
В якості експериментальних моделей для дослідження антиальтеративної дії використовували моделі “трафаретної рани” та виразок шлунка (спиртово-преднізолонової та індометацинової).
Дослідження антиальтеративної дії виявили здатність екстракту “Локорин” впливати на репаративні процеси в рані, про що свідчило достовірне зменшення площі рани в 1,6 рази на 5 добу та прискорення швидкості їх загоєння в 3,3 рази, а під дією диклофенаку натрію лише в 2,2 рази в порівнянні з контрольною патологією. Під впливом екстракту у щурів в динаміці (5-й, 9-й та 13-й дні) спостерігалось поступове зниження в сироватці крові ТБК-реактантів, вмісту ГП та цитолітичного ферменту АлАТ, що вказує на пригнічення процесів ПОЛ і наявність у нього мембранопротекторних властивостей. Характерні зміни відмічались з боку гематологічних показників: достовірне підвищення кількості еритроцитів та внаслідок цього – гемоглобіну. На 13-й день дані показники були на рівні інтактного контролю. В той же час препарат порівняння менш активно і лише на 9-й та 13-й день починав нормалізувати вивчаємі показники. Проведені дослідження показали, що екстракт “Локорин” проявив більш виражену протизапальну дію, ніж НПЗП, про що свідчила динаміка показників крові: достовірне зменшення лейкоцитів (13-й день), тенденція до зниження кількості паличкоядерних, сегментоядерних нейтрофілів, моноцитів, та збільшення лімфоцитів у порівнянні з контрольною патологією. Аналіз отриманих даних свідчить, що протизапальні властивості екстракту “Локорин” виявляються як на початку, так і на пізніх етапах запального процесу. За протизапальними властивостями він перевищує ефект референс-препарату, що пов’язано зі спроможністю поліфенолів інгібувати розвиток процесів вільнорадикального окиснення (ВРО) та стабілізувати клітинні мембрани.
На наступному етапі було проведено вивчення противиразкової дії екстракту “Локорин”. Введення двох агресивних факторів - етилового спирту та преднізолону, який пригнічує активність фосфоліпаз, призводило до утворення виразок в шлунку у щурів. Застосування екстракту “Локорин” позначилось зменшенням ступеня виразкового дефекту на 55,3%, а кверцетину ¾ на 51,7%. (рис. 6).
Рис.6. Вплив екстракту “Локорин” на перебіг спиртово-преднізолонової виразки шлунка у щурів.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до інтакту (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05).
Гальмування процесу ПОЛ відобразилось достовірним до значень контрольної патології зменшенням у сироватці крові вмісту ТБК-реактантів у 1,8 рази, ДК у 1,4 рази, а позитивний вплив на стан АОС характеризувався збільшенням GSH у 1,2 рази. В гомогенаті шлунка простежувалась така ж сама тенденція відносно цих показників.
Лікування екстрактом “Локорин” індометацинової виразки достовірно зменшувало виразкоутворення більш, ніж в 2 рази, набряк та гіперемія слизової оболонки майже не спостерігались. Противиразкова активність екстракту “Локорин” складала 50,8%, а кверцетину 42,6% (рис.7). Згідно з даними літератури, введення щурам індометацину у великих дозах викликає порушення функціонального стану печінки: інтенсифікацію ПОЛ мембран гепатоцитів, зменшення резерву GSH (Derelanko M. G., 1980). Наші дослідження підтвердили гепатотоксичність даного НПЗП (рис.7). В умовах даної патології зміни показників ПОЛ та АОС при застосуванні екстракту “Локорин” мали спрямованість до нормалізації. Вщухання процесів ПОЛ на рівні шлунка також супроводжувалось достовірним зменшенням вмісту ТБК-реактантів в 1,5 рази та підвищенням в 1,3 рази глутатіонового захисту в гомогенаті печінки в порівнянні з нелікованими тваринам. Таким чином, в умовах експериментальних виразок шлунка у білих щурів доведена наявність у екстракту “Локорин” противиразкової дії, яка однакова за виразністю з ефектом кверцетину.
Рис.7. Вплив екстракту “Локорин” на перебіг індометацинової виразки шлунка у щурів.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до інтакту (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05).
Як відомо, протизапальна дія поліфенольних сполук частково пояснюється їх антиоксидантними, мембраностабілізувальними та капілярозміцнюючими властивостями (Чекман І.С., 2000). За даними Меньщикової Е.Б. та Зенкова Н.К., 1997, запальний процес є системною реакцією, що супроводжується інтенсифікацією процесів ВРО та накопиченням продуктів ПОЛ. Тому, на наступному етапі вивчали антиокиснювальні властивості екстракту “Локорин” in vitro та in vivo . Показано, що екстракт “Локорин” володіє вираженою антиокиснювальною активністю, яка в середньому вища за активність природного антиоксиданту−a-токоферола в 2,5 рази в умовах спонтанного ПОЛ і в 1,5 рази при індукції ПОЛ аскорбатом. При цьому спроможність екстракту блокувати процеси ліпопероксидації проявилась вже в перші хвилини після початку інкубації.
Отримані результати узгоджуються з даними Шкариної Е.І.з соавт., 1998 про те, що поліфенольні сполуки здатні зв’язувати активні метаболіти кисню, які є індукторами ПОЛ на ранніх етапах. Крім того, спроможність екстракту “Локорин” інгібувати аскорбатіндуковане ПОЛ, може бути також пов’язана зі здатністю флавоноїдів утворювати хелатні комплекси з металами, виключаючи їх каталітичну дію у процесах ПОЛ ( Казимирко В.К., 2004), і виступати екзогенними природними низькомолекулярними антиоксидантими.
У наступній серії дослідів вивчались антиоксидантні властивості екстракту “Локорин” in vivo на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту. При введенні його щурам в дозі 50 мг/кг вміст кінцевих продуктів ПОЛ ТБК-реактантів у гомогенаті печінки був суттєво нижчим у порівнянні з контролем, що свідчить про спроможність досліджуваного екстракту знижувати інтенсивність процесів ВРО. При цьому антиоксидантна активність екстракту “Локорин” і препарату порівняння a-токоферолу (ЕД50 , 50 мг/кг) були однакові (46,8% і 44,4%, відповідно). Таким чином, показано, що досліджуємий екстракт суттєво покращує антиоксидантно-прооксидантний статус печінки за рахунок як пригнічення інтенсивності процесів ПОЛ та стабілізації клітинних мембран, так і зміцнення антиоксидантної системи захисту.
Антиоксидантні властивості є одним із компонентів мембраностабілізувальної дії екстракту, яка відіграє важливу роль в реалізації протизапального ефекту. Тому нами вивчалась мембранопротекторна активність екстракту „Локорин” на моделі спонтанного гемолізу еритроцитів. Отримані результати свідчать про високу мембранопротекторну дію досліджуваного екстракту (49,9%), яка достовірно не відрізнялась від такої у a-токоферолу (31%), але в 2,3 рази перевищувала активність кверцетину в дозі 5 мг/кг (21,6%). Це можна пояснити тим, що поліфенольні сполуки рослин здатні вбудовуватися в гідрофільну фазу мембран і виконувати функцію антиоксидантного резерву, що призводить до збалансованості компонентів ПОЛ−АОС і стабілізації фосфоліпідної матриці мембран. Дубільні речовини реагують з мембранними білками і утворюють з ними комплекси, що теж сприяє стабілізації клітинних мембран зі збереженням їх структури та функції (Барабой В.А., 1984; Чекман І.С., 2000)
Оскільки важливими фармакологічними властивостями рослинних поліфенолів є здатність ущільнювати клітинні мембрани та підсилювати резистентність стінок судин, було доцільним вивчити вплив екстракту “Локорин” на судинну проникність. Результати експериментів показали наявність у нього судиностабілізувального ефекту, який був найбільш вираженим на моделі уповільнення забарвлення зимозанової папули. Екстракт достовірно в 2 рази затримував вихід барвника з кровоносного русла відносно контрольної патології. На моделі гістамінової папули досліджуваний показник підвищувався в 1,4 рази, а при введенні щурам білку лише в 1,2 рази. Аналогічний судиностабілізувальний ефект показував і кверцетин ув дозі 50 мг/кг.
Вивчення антиоксидантних властивостей проводили на моделі тетрахлорметанового гепатиту. Введення екстракту “Локорин” у лікувально-профілактичному режимі запобігає активації вільнорадикальних реакцій і розвитку синдрома цитолізу гепатоцитів, що підтверджується позитивними змінами біохімічних показників (рис. 8). Так, зменшувався вміст АГП, ТБК-реактантів і ДК в гомогенаті печінки в 1,7 рази, 1,9 рази та 1,6 рази, відповідно в порівнянні з контрольною патологією. У тварин поліпшились показники АОС, зокрема, до норми зріс рівень GSH, а вміст каталази - в 1,5 рази. Відновлення функціонування компонентів антиоксидантного захисту організму реалізується, напевно, через участь атому гідрогену поліфенолів екстракту в окиснювально-відновних реакціях. У сироватці крові спостерігали зниження активності маркерних ферментів цитолізу АлАТ в 1,5 рази, ферментів ЛФ та g-ГТП в 1,2 рази, ніж у щурів контрольної патології, що свідчить про регресію холестатичного та цитолітичного синдромів.
Рис.8. Вплив екстракту “Локорин” на перебіг тетрахлорметанового гепатиту щурів.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до інтакту (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05).
Гістологічні дослідження підтвердили гепатопротекторну дію екстракту “Локорин”, після введення якого значно поліпшився стан печінкової паренхіми. Він нормалізував структуру печінки на тлі активації клітинних і особливо внутрішньоклітинних регенеративних процесів.
При введенні тваринам референс-препарату силібору в дозі 25 мг/кг спостерігалися подібні зміни оксидативного балансу і позитивний його вплив на морфоструктуру печінки.Таким чином, в умовах гострого токсичного гепатиту екстракт “Локорин” чинив гепатозахисну дію, про що свідчать запобігання накопиченню продуктів пероксидації і розвитку синдрому цитолізу за рахунок як прямих, так і опосередкованих механізмів, а також мембраностабілізуючої дії.
Наступною моделлю, використаною для вивчення антиоксидантної дії екстракту “Локорин”, була модель ізадринового міокардиту. Міокардит характеризується розвитком ексудативних, проліферативних процесів та цитолізом кардіоміоцитів. У патогенезі цих змін відмічається активація процесів ПОЛ та виснаження АОС (Цубанова Н.А., 2004). Патологічні зміни в міокарді супроводжувались порушенням функцій серця, на що вказували показники ЕКГ: частота серцевих скорочень (ЧСС) носила характер тахі-брадиаритмії, мало місце пригнічення процесів збудження та провідності (збільшення тривалості шлуночкового комплексу Q-T), зростання амплітуд зубців Р і Т, спостерігали розвиток ішемії (відхилення ST від ізолінії).
Виживаність щурів в групі контрольної патології - 71%, коефіцієнт маси серця (КМС) зріс в 1,4 рази в порівняні з інтактними тваринами (рис. 9). В гомогенаті серця спостерігали підвищення вмісту ключових продуктів ліпопероксидації (ТБК-реактантів, ДК), в сироватці крові − гіперферментемію: АсАТ, КФК, ЛДГ, які є найбільш специфічними маркерами порушення окиснювального метаболізму у міокарді та розвитку дистрофічно-некротичних процесів (Резников К.М. и соавт., 1985). Одним з проявів кардіопротекторної дії екстракту „Локорин” в дозі 50 мг/кг був показник виживаності тварин, який зріс до 100%, а КМС зменшився в 1,3 рази. Мало місце достовірне зменшення концентрації продуктів ПОЛ, а також активності ЛДГ (в 1,5 рази), АсАТ (в 1,6 рази). Останнє може опосередковано свідчити про певні зміни в енергопостачанні міокарду. Позитивні зміни відмічались на ЕКГ та проявлялись зменшенням проявів ішемії.
Рис.9. Вплив екстракту “Локорин” на перебіг ізадринового міокардиту щурів.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до інтакту (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05);
3.*** - відмінність достовірна по відношенню до диклофенаку натрію (р£ 0,05).
Аналіз отриманих даних показав, що екстракт “Локорин” в цілому не поступається за кардіопротекторною дією диклофенаку натрію, а за деякими показниками (виживаність, зменшення вмісту ТБК-реактантів в 1,6 рази, ДК в 1,4 рази, активності АсАТ в 1,6рази, ЛДГ в 1,5 рази) навіть перевищує його. Виражена кардіопротекторна дія екстракту обумовлена наявністю у його складі флавоноїдів, оксикоричних кислот, кумаринів, дубільних речовин (Куцик Р.В., Зузук Б.М., 2002).
Однією з найголовніших характеристик субстанцій, які пропонують як перспективні для створення лікарських препаратів, є, поряд з вираженою фармакологічною активністю, їх безпечність. Отримані результати вивчення гострої токсичності при внутрішньошлунковому введенні щурам і мишам дозволили віднести досліджувану субстанцію до класу відносно нешкідливих речовин (ЛД50 >15000 мг/кг) згідно з класифікацією токсичності речовин за Сидоровим К.К. (1973). При внутрішньоочеревинному введенні ЛД50 для мишей склала 4650 (3850-5460) мг/кг, для щурів − 4150 ( 3430-4880) мг/кг. Значення коефіцієнту видової чутливості, яке дорівнює 1,12, свідчить про її відсутність. Терапевтичний індекс екстракту “Локорин” складає більше 300, що характеризує значну широту терапевтичної дії і у 7 разів перевищує такий диклофенаку натрію. Екстракт “Локорин” не чинить ульцерогенної дії, не впливає на перистальтику кишечника та секреторну активність шлунка.
ВИСНОВКИ
1. У скринінгових дослідженнях показана висока протизапальна, анальгетична та жарознижувальна активність екстракту “Локорин”. ЕД50 за протизапальною активністю на моделі карагенінового набряку становила 50 мг/кг.
2. Установлені виражені протизапальні властивості екстракту “Локорин” на моделях гострого ексудативного запалення. Антиексудативна активність на моделі зимозанового набряку склала 59,9% і перевищувала таку на моделі гістамінового набряку. Екстракт “Локорин” виявляє антиліпооксигеназну активність, яка в 2 рази та 1,3 рази більша, ніж у диклофенаку натрію та кверцетину, відповідно. Протизапальний ефект обумовлений домінуючим впливом на пригнічення синтезу лейкотриєнів й помірним - на утворення ПГ. Висока антиексудативна активність екстракту (57,5%) у щурів з гострим перитонітом пов’язана з його можливістю перешкоджати деструкції клітинних мембран і гальмувати вивільнення маркерів інтоксикації.
3. Показано, що екстракт “Локорин” не впливає на проліферативну фазу запалення.
4. Доведена здатність екстракту “Локорин” на модельних патологіях “трафаретної рани”, спиртово-преднізолонової та індометацинової виразок шлунка виявляти потужну антиальтеративну дію (репаративну, противиразкову). При стандартному пошкодженні шкіри за планіметричними, біохімічними, а також гематологічними показниками він перевищує ефект диклофенаку натрію. За противиразковою дією екстракт “Локорин” (спиртово-преднізолонова виразка – 55,3%, індометацинова – 50,8%) знаходиться на рівні кверцетину.
5. Встановлено, що в системі in vitro екстракт “Локорин” виявляє виразну антиокиснювальну активність, яка вища за активність a-токоферолу в 2,5 рази в умовах спонтанного і в 1,5 рази - аскорбатіндукованого ПОЛ. В умовах in vivo на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту у щурів екстракт “Локорин” проявляє антиоксидантну дію на рівні a-токоферолу. Установлена антиоксидантна дія екстракту “Локорин” обумовлює його мембраностабілізувальну, капілярозміцнювальну, гепатопротекторну та кардіопротекторну активності.
6. Екстракт “Локорин” при внутрішньошлунковому введенні є відносно нешкідливою речовиною, не чинить місцевоподразнювальної дії, не впливає на функціональну активність ШКТ.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ:
1. Набока О.І., Вороніна Л.М., Тимошенко О.П., Галузінська Л.В., Король В.В. Вивчення противиразкової активності сумарного комплексу БАР Лядвенця рогатого та його впливу на деякі біохімічні показники сироватки крові в умовах цієї патології // Лекарства – человеку: Сборник научных статей, г.Харьков. – 2002. – Т.17, № 1. – С.226-228. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту, участь в аналізі отриманих даних, підготовка статті).
2. Воронина Л.Н., Набока О.И., Галузинская Л.В. Влияние суммарного полифенольного комплекса “Локорин” на некоторые биохимические показатели сыворотки крови в условиях острого поражения слизистой оболочки желудка // Лекарства – человеку: Сборник научных статей, г.Харьков. – 2002. – Т.17, № 1. – С.54-56.(Особистий внесок здобувача:
9-09-2015, 00:43