Фармакогностическое изучение рода хвощ

4.4 Перколяторы лабораторные.

5. Качественный анализ содержания различных групп природных соединений.

5.1 Обнаружение алкалоидов.

Для обнаружения алкалоидов в исследуемом растительном сырье, готовили кислое извлечение: 5,0 г сырья заливали 50мл 1% раствором хлорноводородной кислоты и оставляли на ночь. Извлечение фильтровали и определяли в нем алкалоиды с помощью общеосадительных реактивов:

1.) реактив Драгендорфа;

2.) реактив Фреде;

3.) реактив Вагнера;

4.) 1% раствор пикриновой кислоты;

5.) 1% раствор кремниево-вольфрамовая кислота;

6.) 1% раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты;

7.) 1% раствор фосфорно-молибденовой кислоты.

5.2 Обнаружение флавоноидов.

Для качественного обнаружения флавоноидов проводили цианидиновую пробу (проба Синода).

1,0 г сырья заливались 10 мл 96% этанола и нагревались на водяной бане до кипения. Колба встряхивалась несколько раз, закрывалась пробкой и оставлялась на 3-4 часа. Спиртовое извлечение сливали и концентрировали до 2-х мл, к нему добавляли 5-7 капель концентрированной хлорноводородной кислоты и 10 мг металлического цинка.

5.3 Обнаружение дубильных веществ

Приготовление извлечения : 1 г измельченного растительного сырья заливали 100 мл воды. Нагревали на водяной бане 20-30 мин, процеживали через вату и полученное извлечение использовали для проведения качественных реакций.

5.3.1 К 2-3 мл извлечения прибавляли несколько капель раствора железоаммониевых квасцов в случае гидролизуемых дубильных веществ появляется черно-синее окрашивание или осадок, а конденсированных- черно-зеленое окрашивание или осадок.

5.3.2 К 1 мл извлечения добавляли 2 мл раствора 10% уксусной кислоты и 1 мл раствора 10% средней соли ацетата свинца. При наличии конденсированных дубильных веществ фильтрат окрасится в черно-зеленый цвет от прибавления 5 капель 1%-ных железоаммониевых квасцов и 0,1 г ацетата свинца.

5.4 Обнаружение сапонинов.

Приготовление извлечения . Готовили водный настой 1:10, нагревая измельченное сырье на водяной бане в течение 10 мин. Настой после охлаждения фильтруют и проводят с ним реакции.

Реакция пенообразования. Берут две пробирки, в одну приливают 5 мл 0,1 моль/л хлорноводородной кислоты, а в другую- 5мл 0,1моль/л гидроксида натрия. Затем в обе пробирки добавляют по 2-3 капли извлечения или растворов сапонинов и сильно встряхивали. При наличии в сырье тритерпеновых сапонинов в обеих пробирках образуется устойчивая пена.

5.5 Обнаружение алифатических кислот.

5.5.1 Щавелевая кислота.

К 2 мл водного извлечения добавили 4 капли раствора кальция сульфата насыщенного, в результате должен образоваться осадок растворимый в соляной кислоте и не растворимый в уксусной кислоте.

5.5.2 Янтарная кислота.

К 1 мл извлечения добавить несколько кристалликов резорцина, затем по стенке пробирки добавить 0,5 мл концентрированной серной кислоты, охладить и добавить 0,5 мл 10% раствора гидроксида аммония, должна появиться зеленая флуоресценция.

5.5.3 Лимонная кислота.

1 мл извлечения поместить в выпарительную чашку, добавить несколько кристалликов ванилина и выпарить досуха. К остатку добавить 2-3 капли конц. серной кислоты, нагреть на водяной бане до появления фиолетового окрашивания.

5.5.4 Яблочная кислота.

К 2 мл экстракта добавить 0,1 b-нафтола и 1каплю конц. серной кислоты. Опустить пробирку на 1/2 мин в кипящую водяную баню должна появиться ярко-желтая с зеленым флуоресценция.

5.5.5 Винная кислота.

4 капли водного экстракта выпарить досуха в фарфоровой чашке, добавить 1 мл конц. серной кислоты и несколькими кристалликами резорцина, нагреть на водяной бане до появления вишнево-красного окрашивания.

5.6 Обнаружение полисахаридов .

К 8,0 сырья добавили 260 мл воды, затем взбалтывать в течении 1 часа, оставили на одни сутки на холоду, слили с сырья извлечение и профильтровали его. В фильтрате осаждали водорастворимые полисахариды ( предварительно упарив фильтрат до1/3) 2-х кратным объемом 96% этанола (фр.А).

Оставшееся сырье обработали 100 мл кипящей водой очищенной с 0,4 мл конц. хлорноводородной кислотой и 30 мин выдержали на кипящей водяной бане. Затем в фильтрате осаждали пектиновые вещества 2-х кратным объемом 96% этанола (фр. Б).

Сырье обрабатывали 10% раствором гидроксида натрия, оставляли на сутки, затем фильтровали и в фильтрате осаждали полисахариды 50% уксусной кислотой (фр. В).

Каждую фракцию в отдельности отфильтровывали на воронке Бюхнера. Осадки сушили при температуре +90 °С до постоянной массы.

Далее проводили кислотный гидролиз. Точную навеску (0,1) каждой фракции помещали в ампулы, добавляли в каждую по 5 мл 10% раствора серной кислоты. Ампулы запаивали и нагревали при температуре +105°С в течении 3-х часов. Ампулы охлаждали и содержимое количественно переносили в мерную колбу на 25 мл, объем доводилим до метки водой (раствор А).

10 мл гидролизата (раствора А) разбавить 5 мл воды и нейтрализовали порошком карбоната бария по универсальной индикаторной бумаге. Раствор фильтровали через бумажный фильтр, промыв водой. Полученный фильтрат упаривали до объема 0,5 мл (раствор Б).

На хроматографическую бумагу Ленинградской фабрики марки «М» наносим 0,02мл упаренного фильтрата и стандартные образцы сахаров, хроматографировали восходящим методом в системе ацетон:бутанол:вода (7:2:1).

Высушенную хроматограмму обрабатывали анилинфитолатом и сушили в сушильном шкафу при температуре +105°С до появления пятен.

Нейтральные сахара:

- глюкоза Rf-0.15;

- галактоза Rf-0.12;

- арабиноза Rf-0.24;

- ксилоза Rf-0.27;

- рамноза Rf-0.4.

Приготовление анилинфитолата :

0,93 сернокислого анилина

1,66 фталевой кислоты

100 мл водонасыщенного бутанола.

5.7 Обнаружение кремния

Для идентификации соединений кремния проводили качественую реакцию образования желтого и синего кремнемолибденового комплекса с молибдатом аммония в кислой среде. В качестве восстановителя использовали аскорбиновую кислоту.

Для этого 1,0 г измельченного сырья сжигали в фарфоровом тигле на электрической плитке и прокаливали в муфельной печи. Затем золу обрабатывали 1% раствором хлороводородной кислоты, фильтровали, осадок на фильтре промывали 1% раствором хлороводородной кислоты и растворяли в 5% растворе гидроксида калия. С раствором силиката калия проводили реакцию с 10% подкисленным раствором молибдата аммония, приготовленного следующим образом: к 90 мл 11% раствора молибдата аммония прибавляли 10 мл 50 % раствора серной кислоты.

К 1 мл полученного раствора силиката калия прибавляли 2 мл 10% подкисленного раствора молибдата аммония, должно образоваться желтое окрашивание, при добавлении нескольких кристалликов аскорбиновой кислоты желтая окраска должна переходить в интенсивно синий цвет.

5.8 Обнаружение эфирных масел.

Использовался метод перегонки водяным паром. Навеску измельченного сырья помещают в широкогорлую круглодонную колбу вместимостью 700-800 мл, приливают 300 мл воды и закрывают резиновой пробкой с обратным холодильником. В пробке снизу укрепляются металлические крючки, на которые при помощи тонкой проволоки подвешивают градуированный приемник так , чтобы конец холодильника находился точно над воронкообразным расширением приемника, не касаясь его. Колбу с содержимым нагревают до кипения и слабо кипятят.

Пары воды и эфирного масла конденсируются в холодильнике и жидкость стекает в приемник. Масло отстаивают в градуированном колене приемника, а вода через меньшее колено приемника вытекает обратно в колбу.

5.9 Обнаружение сесквитерпеновых лактонов.

50 мл водного извлечения (1:10) помещали в делительную воронку, добавляли 10 мл хлороформа и осторожно взбалтывали, затем хлороформное извлечение сливали в колбу. К этому же водному извлечению добавляли свежую порцию хлороформа, второе извлечение объединяли с первым. Затем хлороформ отгоняли под тягой до получения «смолки».

ИК-спектр снимали на спектрофотометре «Specord UR» с призмами Li F и NaCl в таблетках KBr высотой 1 мм при соотношении веществ, наполнителя 1:400 и в пленке.

6. Количественное определение флавоноидов

Около 1,0 г сырья помещали в колбу с притертой пробкой на 50 мл, заливали 20 мл 90% этанола с содержанием 2%-тов концентрированной хлороводородной кислоты, экстрагировали с обратным холодильником на кипящей водяной бане и декантировали в мерную колбу на 50 мл. Извлечение повторяли еще дважды, заливая по 10 мл 90% подкисленного этанола. Объединенное извлечение доводят до метки 90% этанолом.

0,2 мл экстракта наносили на полоску хроматографической бумаги размером 45´15 см и хроматографировали в системе 0,1 М хлороводородной кислоты. Хроматограмму высушивали, в УФ-свете отмечали пятна флавоноидов, вырезали и элюировали 96% этанолом три раза по 10, 5 и 5 мл в колбе спритертой пробкой с обратным холодильником на водяной бане. Полученное извлечение флавоноидов сливали в мерную колбу на 25 мл, доводили до метки 96% этанолом и снимали оптическую плотность элюятов с помощью спектрофотометра с толщиной слоя 1 см при длине волны 353нм.

Сумму флавоноидов пересчитывали на кверцетин (Е =387,5) поформуле:

C= Д*У1*К*У2*100/(Е *I*М*(100-В)*У3,где

Д- оптическая плотность

У1- объем первого извлечения, мл (50 мл)

У2- объем второго извлечения, мл (25мл)

У3- объем, пошедший на хроматографирование, мл (0,2 мл)

Е -удельный показатель поглощения

М- масса навески, г

В- влажность сырья, %

I- толщина слоя, см

К-поправочный коэффициент на неполное элюирование с бумаги (1,15)

7. Количественное определение соединений кремния

В предварительно прокаленный фарфоровый тигльпомещали около 1,0 г сырья, сжигали и прокаливали в муфельной печи при температуре не выше 560-650 °С до постоянной массы (3-5 часов).

После охлаждения золу количественно переносили в стакан емкостью 150 мл, добавляли 50 мл 5% раствора хлороводородной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане в течение 20 мин. Полученный раствор отфильтровывали через рыхлый беззольный фильтр, осадок промывали 1% раствором хлороводородной кислоты.

Фильтр с осадком переносили в коническую колбу на 150 мл, добавляли 50 мл 5% раствора гидроксида калия, затем прикрыв часовым стеклом, нагревали до кипения и кмпятили в течение 20 мин (колбу перед нагреванием взвесили). После охлаждения содержимое колбы доводили до первоначальной массы 5% раствором гидроксида калия.

1 мл полученного фильтрата помещали в мерную колбу на 25 мл, прибавляли 2 мл 5% раствора серной кислоты, доводили водой до метки. Через 15 мин определяли оптическую плотность с помощью фотоэлектроколориметра в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 400 нм, используя в качестве раствора сравнеия фильтрат без добавления реактивов.

8. Методика определения экстрактивных веществ .

20 г сырья измельчали и просеивали сквозь сито с отверстиями диаметром 1мм, помещали в коническую колбу прилив растворителя до «зеркала». Колбу закрывали пробкой, взвешивали и оставляли на 16 часов. Затем содержимое тщательно взбалтывали и фильтровали через сухой фильтр в сухую колбу. Фильтрат переносили в фарфоровую чашку диаметром 7-9 см, предварительно высушенную при t° +100°C до постоянной массы и взвешенную на аналитических весах. Фильтрат выпаривают на водяной бане досуха, и сушат при t° 100-105°С в течении 3 часов, охлаждали в эксикаторе и взвешивали.

9. Определение микроэлементного состава.

Для определения минерального состава травы хвоща использовался рентгено-флуоресцентный метод.

В чашку (тигль) берут навеску измельченного продукта (пробы взвешивают с погрешностью не более + 0,01 г), помещают в сушильный шкаф и высушивают при температуре около +105°С.

Содержимое чаши смачивают 2-3 мл 32% раствором азотной кислоты и нагревают на водяной бане до прекращения выделения паров. Обработку азотной кислотой повторяют еще дважды. Затем чашу помещают на электроплитку и проводят обугливание до прекращения выделения дыма, потом чашу переносят в электропечь при температуре около +250°С. Минерализацию проводят, постепенно повышая температуру электропечи на +50°С через каждые 30 мин и, доведя ее до температуры +450°С, продолжают минерализацию при этих условиях до получения золы. Чашу с золой извлекают из электропечи, охлаждают до комнатной температуры и смачивают золу 0,5-1,0 мл 32% раствором азотной кислоты. Затем кислоту досуха выпаривают на электроплитке со слабым нагревом и снова помещают чашу с пробой в электропечь при температуре, постепенно доводя температуру до 450°С и выдерживают 1 час. Минерализацию считают законченной, когда зола станет белого или слегка окрашенного цвета, без обугленных частиц. При наличии обугленных частиц повторяют обработку золы раствором азотной кислоты или водой.

В чашу с золой добавляют 10 мл 32% раствора азотной кислоты, нагревают на электроплитке со слабым нагревом до появления запахов азота. Содержимое чаши фильтруют в стакан через фильтр «белая лента». Тщательно ополаскивают чашу водой очищенной, фильтруя смыв чаши в тот же стакан. В фильтрат, содержащий тяжелые металлы добавляют азотнокислый цирконил, нагревают, фильтруют. Полученный осадок анализируют на приборе спектрометре «Спектроскан».

10. Исследование антигрибковой активности

С целью изучения антигрибковых свойств БАВ хвоща полевого воздушно-сухое сырье измельчали до размера частиц 2-5 мм, заливали до «зеркала» экстрагентом (вода очищенная, этиловый спирт 70%, бутанол, хлороформ, эфир) настаивали в течении 16 часов, фильтровали и полученные экстракты высушивали в струе воздуха, нагретого до +30°С.

Антигрибковые свойства полученных экстрактов исследовали методом двукратных серийных разведений в жидкой среде Сабуро по методике Вичкановой С.А.. Состав среды Сабуро:

- 10,0 пептона,

- 40,0 мальтозы,

- воды очищенной до 1 л.

В качестве тест-культуры использовали штаммы Aspergillus niger 163/3685, Candida albicans 4337, Trichophiton rubrum ВКПГ248/700, T. Mentagrophytes var. Interdigitale ВКПГ 268, Microsporum canis ВКПГ 326/316, которые были получены в отделе микологии центрального кожно-венерологического института Министерства здравоохранения России г. Москва.

Подготовка грибов-дерматофитов к опыту, посев и их учет проводили по методу Г.Н. Першина. Для посева использовали суспензии как правило, суточной агаровой культуры дрожжей, культуры плесневого гриба 4-5 суточные, остальных дерматофитов 7-10 суточные. Взвеси грибов готовили в физиологическом растворе по оптическому стандарту мутности.

После дополнительных разведений стандартного раствора микробная нагрузка патогенных грибов составляла 1000 грибковых тел в 1 мл среды. Посевы инкубировали в термостате, дрожжи при 37°С, остальные при 33°С.

Учет культуры дрожжей проводили через 24 часа, другие культуры на 7-10 сутки. Предельная доза препарата испытанная нами, соответствовала 1000 мкг/мл. Повторность каждого опыта 4-6 кратная. Контролем служили пробирки с питательной средой, засеянные аналогичным количество тест-культуры, а также пробирки со средой и препараты без культуры (для проверки мутности и осаждения препарата).

За критерий антигрибковой активности препарата принимали фунгистатический титр, который оценивали в микрограммах на 1 мл (мкг/мл) питательной среды. За фунгистатический титр принимали предельную концентрацию препарата в среде, при которой отсутствовал видимый рост культуры в условиях оптимальной темпиратуры и заданной микробной нагрузки.

Глава III Перспективность использования рода хвоща для получения лекарственных препаратов

3.1 Перспективность использования рода хвоща для получения лекарственных препаратов.

Как в нашей стране так и за рубежом известно мочегонное действие хвоща полевого. Нами было проведено изучение различных литературных данных и в некоторых из них встречается информация о возможности использования хвоща полевого в косметологии и дерматологии. В таблице 1 представлены результаты исследования, в которой в сравнении с хвощем полевым приведены еще 43 вида лекарственных растений произрастающих на территории Сибири и использующихся в косметологии и дерматологии.

Tаблица 1