Сибирская язва 5

5.2.1. Мик­роскопические ис­сле­до­ва­ния. Из дос­тав­лен­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла де­ла­ют маз­ки, фик­си­ру­ют эти­ло­вым спир­том с до­бав­ле­ни­ем 3% пе­ре­ки­си во­до­ро­да, ок­ра­ши­ва­ют по Гра­му и на кап­су­лу - по Ми­хи­ну, Ре­би­ге­ру, Оль­ту или Ро­ма­нов­ско­му-Гим­за; при на­ли­чии лю­ми­нес­цент­ных сы­во­ро­ток ис­поль­зу­ют ме­тод флюо­рес­ци­рую­щих ан­ти­тел.

В мас­ках, ок­ра­шен­ных по Грам­у, Bac. anthracis - грам­по­ло­жи­тель­ная па­лоч­ка (пря­мая). Па­лоч­ки рас­по­ла­га­ют­ся ко­рот­ки­ми це­поч­ка­ми или по­пар­но, кон­цы их, об­ра­щен­ные друг к дру­гу, рез­ко об­руб­ле­ны, сво­бод­ные кон­цы обыч­но за­круг­ле­ны. В от­дель­ных слу­ча­ях (ча­ще в маз­ках от сви­ней) фор­ма мик­ро­бов си­бир­ской яз­вы мо­жет быть не­ха­рак­тер­ной (ко­рот­кие тол­стые или изо­гну­тые, ино­гда зер­ни­стые па­лоч­ки со взду­ти­ем по­се­ре­ди­не или на кон­це, воз­мож­но на­ли­чие "те­ней" мик­ро­бов).

В ок­ра­ше­нных спе­ци­аль­ны­ми ме­то­да­ми маз­ках из па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла и сре­ды ГКИ си­би­ре­яз­вен­ные па­лоч­ки ок­ру­же­ны кап­су­лой.

В фик­си­ро­ван­ных пре­па­ра­тах кап­су­лы ба­цилл хо­ро­шо ок­ра­ши­ва­ют­ся все­ми спо­со­ба­ми: Ми­хи­на, Ре­би­ге­ра, Оль­та, Ро­ма­нов­ско­го-Гим­зы, Бур­це­ва, Ио­не, Ка­уф­ма­на.

Окраска по Михину. Мазок окрашивают леффлеровской метиленовой синью в течение 2-3 минут, при этом его подогревают до появления паров. Краску быстро смывают водой, а мазок высушивают фильтровальной бумагой. Бациллы - тёмно-синие, капсулы- светло-розовые.

Окраска по Ребигеру. 15-20 г генцианвиолета растворяют в 100-150 мл 40% формалина, тщательно и многократно взбалтывают и дают отстоятся несколько часов, затем фильтруют. Полученным раствором окрашивают нефиксированные мазки. Бациллы -тёмно-фиолетовые, капсулы фиолетово-розового цвета.

Окраска по Ольту. В 100 мл кипящей дистиллированной воды растворяют 3 г сафранина, после охлаждения фильтруют. Красят 1-2 мин. Бациллы - красные, капсулы - жёлтые.

Окраска по Романовскому-Гимзе. На фиксированный мазок наносят краску, выдерживают в течение 15-20 минут и быстро смывают. Бациллы тёмно-синие, капсула розовая или бледно-розовая.

По ре­зуль­та­там мик­ро­ско­пи­че­ско­го ис­сле­до­ва­ния не­мед­лен­но да­ют пред­ва­ри­тель­ный от­вет. В слу­чае об­на­ру­же­ния кап­суль­ных форм ба­цилл ди­аг­ноз на си­бир­скую яз­ву счи­та­ют ус­та­нов­ле­нным и даль­ней­шие ис­сле­до­ва­ния про­дол­жа­ют в со­от­вет­ст­вии с ин­ст­рук­ци­ей.

5.2.2. По­сев на пи­та­тель­ные сре­ды. По­се­вы из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла де­ла­ют в МПБ и на МПА или в буль­он и на агар Хот­тин­ге­ра (рН 7,4). Од­но­вре­мен­но мож­но де­лать по­се­вы на диф­фе­рен­ци­аль­но-ди­аг­но­сти­че­скую сре­ду с 0,01 % фе­нол­фта­ле­ин­фос­фа­та на­трия, а так­же на же­ла­тин, кро­вя­ной буль­он и агар, сре­ду ГКИ (60 % сте­риль­но­го рас­тво­ра Хен­кса без ан­ти­био­ти­ков и 40 % сте­риль­ной не­кон­сер­ви­ро­ван­ной сы­во­рот­ки круп­но­го ро­га­то­го ско­та, инак­ти­ви­ро­ван­ной при 56-58⁰ С в те­че­нии 30 мин, рН 7,2-7,4).

По­се­вы ин­ку­би­ру­ют 18-24 ч при тем­пе­ра­ту­ре 37-38 (С и при от­сут­ст­вии рос­та вы­дер­жи­ва­ют при той же тем­пе­ра­ту­ре еще 48 часов.

После суточного роста сибиреязвенных бацилл МПБ остается прозрачным, а на дне образуется рыхлый, в виде комка ваты осадок, разбивающийся при встряхивании. Из бульонной культуры делают мазки, окашивают по Граму и микроскопируют. В мазках обнаруживают цепочки, состоящие из сибиреязвенных палочек или парно расположенные палочки. На плотных питательных средах бациллы сибирской язвы образуют плоские матово-шероховатые колонии. Под малым увеличением микроскопа колонии имеют вид сплетённых нитей («голова медузы»). При посеве уколом в столбик 10-12% желатины бациллы на 2-5 сутки образуют желтовато-белый стержень.

5.2.3.Био­ло­ги­че­ская проба. Ис­сле­дуе­мый па­то­ло­ги­че­ский ма­те­ри­ал (в день по­сту­п­ле­ния) сус­пен­ди­ру­ют в не­боль­шом объ­е­ме 0,9%-но­го рас­тво­ра на­трия хло­ри­да, вво­дят двум бе­лым мы­шам в до­зе 0,2-0,5 мл под ко­жу спи­ны бли­же к кор­ню хво­ста или 0,5-1 мл двум мор­ским свин­кам под­кож­но в об­лас­ти жи­во­та. Ги­бель жи­вот­ных на­сту­па­ет че­рез 1-3 сут, ино­гда поз­же.

5.2.4. Ок­ра­ска си­би­ре­яз­вен­ных спор. Для этой це­ли ис­поль­зу­ют ме­то­ды: Ау­е­ски, Зла­то­го­ро­ва, Дор­не­ра, Пеш­ко­ва, Мюл­ле­ра, Тру­хи­льо, Клей­на, Шеф­фе­ра, Фул­то­на и др. Луч­ше ок­ра­ши­ва­ют­ся спо­ры ме­то­дом Ау­е­ски и осо­бен­но Тру­хи­льо.

5.2.5. Реакция преципитации по Асколи.

Реакцию ставят в уленгутовской пробирке. Для этого в уленгутовскую пробирку вносят 0,2-0,3 мл прозрачной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и затем осторожно наносят равное количество экстракта проб специально подготовленного (горячий или холодный способ) патологического материала. При положительной реакции через 10-12 минут на границе соединения компонентов обнаруживают характерный серовато-белый диск (преципитирующее кольцо).

5.2.6. Иден­ти­фи­ка­ция воз­бу­ди­те­ля си­бир­ской яз­вы.

Применительно к возбудителю сибирской язвы имеется большая группа микробов-сапрофитов, близкородственных Bac.anthracis по основным культурально-морфологическим и биохимическим свойствам (Bac. anthracoides, Bac.pseudoanthracis, Bac. cereus, Bac. mesentericus, Bac.megaterium, Bac. subtilis, Bac. mycoides).

Идентификацию про­во­дят по сле­дую­щим при­зна­кам: мор­фо­ло­гия мик­ро­ба, вклю­чая на­ли­чие кап­сул в маз­ках из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла или ор­га­нов пав­ших под­опыт­ных жи­вот­ных (сапрофиты капсул не имеют); куль­ту­раль­ные свой­ст­ва; па­то­ген­ность для ла­бо­ра­тор­ных жи­вот­ных (ги­бель хо­тя бы од­но­го из двух ла­бо­ра­тор­ных жи­вот­ных, за­ра­жен­ных сус­пен­зи­ей из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла или по­лу­чен­ной куль­ту­рой воз­бу­ди­те­ля, с по­сле­дую­щим вы­де­ле­ни­ем ее из ор­га­нов мы­ши или мор­ской свин­ки. Сапрофиты непатогенны для морских свинок и кроликов)

При на­ли­чии в маз­ках ха­рак­тер­ных мор­фо­ло­ги­че­ских и куль­ту­раль­ных свойств и кап­сул из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла даль­ней­шее изу­че­ние куль­ту­ры не про­во­дят. В слу­чае по­лу­че­ния не­чет­ких ре­зуль­та­тов по од­но­му из пер­вых двух свойств, не до­жи­да­ясь ре­зуль­та­тов био­про­бы, оп­ре­де­ля­ют чув­ст­ви­тель­ность куль­ту­ры к си­би­ре­яз­вен­ным бак­те­рио­фа­гам и пе­ни­цил­ли­ну.

Про­ба бак­те­рио­фа­гом ос­но­ва­на на использовании сибиреязвенных бактериофагов (вирусов сибиреязвенных бацилл), которые при взаи­мо­дей­ст­вии с си­би­ре­яз­ве­ной куль­ту­рой вызывают её разрушение (ли­зис). Сибиреязвенные бактериофаги не лизируют сапрофитные бациллы. Ре­ак­ция вы­со­ко­спе­ци­фич­на и при­ме­ня­ют её для иден­ти­фи­ка­ции воз­бу­ди­те­ля си­бир­ской яз­вы и диф­фе­рен­циа­ции его сапрофитных бацилл.

Тест "жем­чуж­но­го оже­ре­лья.

Сибиреязвенные бациллы при посева на мясо-пептонный агар с пенициллином имеют вид жемчужного ожерелья. Спорообразующие сапрофитные аэробные микробы в аналогичных условиях вырастают в виде обычных форм.

Вы­де­лен­ную куль­ту­ру от­но­сят к Bac. anthracis при на­ли­чии кап­сул в маз­ках из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла или ор­га­нов пав­ше­го за­ра­жен­но­го жи­вот­но­го и дру­гих ха­рак­тер­ных мор­фо­ло­ги­че­ских и куль­ту­раль­ных свойств воз­бу­ди­те­ля: при от­сут­ст­вии кап­сул, но на­ли­чии дру­гих харак­тер­ных мор­фоло­ги­че­ских и куль­ту­раль­ных свойств воз­бу­ди­те­ля, чув­ст­ви­тель­ность его к си­би­ре­яз­вен­но­му фа­гу и пе­ни­цил­ли­ну.

5.2.7. Постановка диагноза.

Ди­аг­ноз на си­бир­скую яз­ву у жи­вот­но­го счи­та­ют ус­та­нов­ленным в од­ном из сле­дую­щих слу­ча­ев:

- об­на­ру­же­ние кап­суль­ных форм Bac. anthracis в па­то­ло­ги­че­ском ма­те­риа­ле;

- ги­бель хо­тя бы од­но­го ла­бо­ра­тор­но­го жи­вот­но­го из двух, за­ра­жен­ных сус­пе­зи­ей из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла, с по­сле­дую­щим вы­де­ле­ни­ем из его ор­га­нов куль­ту­ры Bac. anthracis да­же при от­сут­ст­вии рос­та куль­ту­ры воз­бу­ди­те­ля из па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла;

- по­лу­че­ние по­ло­жи­тель­ной ре­ак­ции пре­ци­пи­та­ции при ис­сле­до­ва­нии за­гнив­ше­го ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла;

- по­лу­че­ние по­ло­жи­тель­ной ре­ак­ции пре­ци­пи­та­ции при на­ли­чии ха­рак­тер­ной кли­ни­че­ской кар­ти­ны и па­то­ло­ги­че­ских из­ме­не­ний у сви­ней да­же при от­сут­ст­вии куль­ту­ры воз­бу­ди­те­ля в вы­се­вах из ис­ход­но­го па­то­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла и от­ри­ца­тель­ном ре­зуль­та­те био­про­бы.

Ме­то­ды ус­ко­рен­ной ди­аг­но­сти­ки. Кро­ме про­бы бак­те­рио­фа­гам, ре­ак­ции "жем­чуж­ное оже­ре­лье", в ла­бо­ра­тор­ной прак­ти­ке ис­поль­зу­ют и дру­гие ме­то­ды ус­ко­рен­ной ди­аг­но­сти­ки ан­трак­са: экс­трен­ная ди­аг­но­сти­ка ре­ак­ци­ей пас­сив­ной ге­магг­лю­ти­на­ции (РПГА), ме­тод бы­ст­ро­го вы­яв­ле­ния кап­су­лы на сре­де ГКИ (in vitro), ме­тод вы­яв­ле­ния кап­су­лы in vivo, ме­тод вы­яв­ле­ния кап­су­ло­об­ра­зо­ва­ния на се­лек­тив­ной сре­де, ме­тод ус­ко­рен­ной ди­аг­но­сти­ки на сы­во­ро­точ­ной пи­та­тель­ноцй сре­де в ат­мо­сфе­ре уг­ле­ки­сло­го га­за, лю­ми­нес­цент­но-се­ро­ло­ги­че­ский ме­тод, лю­ми­нес­цент­но-се­ро­ло­ги­че­ский ме­тод с ис­поль­зо­ва­ни­ем кап­суль­ных си­би­ре­яз­вен­ных сы­во­ро­ток, ме­тод ус­ко­рен­ной ди­аг­но­сти­ки с при­ме­не­ни­ем флюо­рис­ци­рую­щих ан­ти­тел.

В последние годы разработаны молекулярно-биологические методы обнаружения генома бациллы сибирской язвы (полимеразная цепная реакция).

Диф­фе­рен­ци­аль­ный ди­аг­ноз. Из-за мно­го­об­ра­зия форм про­яв­ле­ния у жи­вот­ных дан­ная бо­лезнь име­ет ряд сход­ных кли­ни­че­ских при­зна­ков со мно­го­ими бо­лез­ня­ми ин­фек­ци­он­ной и не­ин­фек­ци­он­ной этио­ло­гии. При по­ста­нов­ке ди­аг­но­за не­об­хо­ди­мо ис­клю­чить пас­те­рел­лез, зло­ка­че­ст­вен­ный отек, эм­фи­зе­ма­тоз­ный кар­бун­кул, брад­зот и эн­те­ро­ток­си­мию овец, чу­му сви­ней, аф­ри­кан­скую чу­му, ин­фек­цио­оную ане­мию и грипп ло­ша­дей, пи­ро­плаз­мо­зы, фа­рин­ги­ты не­за­раз­ной этио­ло­гии, до­лез­ни серд­ца и же­лу­доч­но-ки­шеч­но­го трак­та (ост­рая тим­па­ния руб­ца, ко­ли­ки у ло­ша­дей).

6. Исследование кожевенного и мехового сырья

Для обнаружения Bac. anthracis в кожевенном и меховом сырье применяют реакцию преципитации по Асколи и реакцию диффузионной преципитации (РДП). Эти реакции пригодны и для исследования загнившего патологического материала. Реакция Асколи - достоверный и широко применяемый в практике тест серологической диагностики. При исследовании патологического материала и кожевенно- мехового сырья достоверность реакции 100%. Время исследования подготовленных проб шкур от 10-12 минут до 0,5 часа, в зависимости от состояния кож.

7. Иммунитет.

При сибирской язве механизм и факторы иммунитета многообразны и их разделяют на неспецифические (защитные свойства кожи и слизистых оболочек, влияние ферментов пищеварительного сока, фагоцитоз, породная и возрастная чувствительность) и специфические (клеточный и гуморальный иммунитет).

После выздоровления от сибирской язвы у животных формируется стойкий и длительный специфический иммунитет. В настоящее время установлено, что специфический иммунитет вырабатывается в ответ на воздействие токсина сибиреязвенной бациллы, в состав которого входит протективный, отёчный и летальный факторы. В результате в организме синтезируются защитные противосибиреязвенные антитела (иммуноглобулины), которые и обеспечивают устойчивость животных от заражения при попадании в организм возбудителя. Это так называемый активный иммунитет. Кроме переболевания, активный иммунитет формируется после введения вакцин. Пассивный иммунитет имеет место после введения животным противосибиреязвенной гипериммунной сыворотки.

Для создания активного иммунитета к возбудителю сибирской язвы используют вакцины. Основоположником разработки живой сибиреязвенной вакцины является великий французский учёный Л.Пастер, который в 1881 году впервые аттенуировал капсульный вирулентный штамм путём его выращивания при температуре 42,5-43⁰ С и получил авирулентный вакцинный штамм, который стал первой вакциной против сибирской язвы.

8. Современные вакцины.

Принцип изготовления живых сибиреязвенных вакцин заключается в наработке споровой бакмассы на твердых питательных средах.

В 1937 году Стерн получил бескапсульный иммуногенный вариант B.anthracic, который до настоящего времени используется во многих странах мира.

В России, в 1940 году Гинсбург Н.Н. также получил бескапсульный вариант и на его основе разработал вакцину СТИ-1, которая с 1942 г. по 1986 год применялась в нашей стране.

В 1983-1986 годах Бакуловым И.А. и соавторами во ВНИИВВиМ на основе бескапсульного штамма № 55 была создана новая живая вакцина против сибирской язвы, которая используется в нашей стране в настоящее время (ВНИИВВиМ-55). Срок иммунитета составляет 1-1,5 года.

Делались попытки получить сибиреязвенные вакцины их убитых бацилл, но они не вызывали в организме образования стойкого, длительного иммунитета.

При изготовлении вакцин против сибирской язвы обязательной операцией является проверка посевного материала, а также споровой бакмассы и готовой продукции на отсуствие контаминации бактериальной и грибной микрофлорой. Для этого все три вида биоматериала засевают на питательные среды: мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, мясо-пептонно-печёночный бульон под вазелиновым маслом, бульон и агар Сабуро и ведут за посевами в течение 10 суток.

9. Ле­че­ние. Со­вре­мен­ные сред­ст­ва при­ме­няе­мые для ле­че­ния жи­вот­ных, боль­ных си­бир­ской яз­вой, мож­но раз­де­лить на спе­ци­фи­че­ские и не­спе­ци­фи­че­ские. К пер­вым от­но­сит­ся се­ро­те­ра­пия. Еще в 1895 г. Sclavo в Ита­лии, Marchu во Фран­ции и в 1902 г. Юр­ге­лю­нас в Рос­сии соз­да­ли про­ти­во­си­би­ре­яз­вен­ную сы­во­рот­ку, ко­то­рая в даль­ней­шем ря­дом ав­то­ров бы­ла усо­вер­шен­ст­во­ва­на как по ка­че­ст­ву, так и по ме­то­дам из­го­тов­ле­ния. По дан­ным мно­гих ав­то­ров, мас­со­вое при­ме­не­ние си­би­ре­яз­вен­ной сы­во­рот­ки в прак­ти­че­ских ус­ло­вия под­твер­ди­ло­ее эф­фек­тив­ность. Ее ре­ко­мен­ду­ет­ся при­ме­нять с про­фи­лак­ти­че­ской и ле­чеб­ной це­ля­ми. В по­след­нем слу­чае сы­во­рот­ку ис­поль­зу­ют при всех фор­мах бо­лез­ни, при­чем чем рань­ше ее вво­дят, тем эф­фек­тив­ней ее дей­ст­вие.

В 1961 г. М.А.Ба­бич и В.А.Плот­ни­ко­ва раз­ра­бо­та­ли ме­тод по­лу­че­ния про­ти­во­си­би­ре­яз­ве­но­го гам­ма-гло­бу­ли­на. Его ши­ро­ко при­ме­ня­ют в ме­ди­цин­ской прак­ти­ке. Био­про­мыш­лен­ность вы­пус­ка­ет гам­ма-гло­бу­ли­ны и для ве­те­ри­нар­ных це­лей.

На­ря­ду с эти­ми сред­ст­ва­ми уче­ные изи­ски­ва­ли и дру­гие ле­чеб­ные пре­па­ра­ты. В ча­ст­но­сти, бы­ли пред­ло­же­ны для ле­че­ния кре­о­лин, но­вар­се­нол, 1%-рас­твор йо­да, 2%-рас­твор йо­ди­сто­го ка­лия. При ме­ст­ной фор­ме си­бир­ской яз­вы (кар­бун­ку­лы, оте­ки в под­че­лю­ст­ной об­лас­ти ре­ко­мен­до­ва­но инъ­е­ци­ро­вать во­круг па­то­ло­ги­че­ско­го фо­ку­са 3-5%-ный рас­твор кри­стал­ли­че­ской кар­бо­ло­вой ки­сло­ты.

Наи­бо­лее ши­ро­ко при си­бир­ской яз­ве при­ме­ня­ют ан­ти­био­ти­ки. В ря­де ра­бот со­об­ща­ет­ся об эф­фек­тив­но­сти ле­че­ния пе­ни­цил­ли­ном. При этом от­ме­ча­ет­ся бы­строе ис­чез­но­ве­ние воз­бу­ди­те­ля из мест по­ра­же­ния.

Пе­ни­цил­лин наи­бо­лее ак­ти­вен, од­на­ко при его ис­поль­зо­ва­нии ино­гда на­блю­да­ют­ся ал­лер­ги­че­ские ре­ак­ции, и он не­эф­фек­ти­вен при ме­ст­ных по­ра­же­ни­ях. Пред­по­ла­га­ет­ся, что пе­ни­цил­лин не мо­жет ней­тра­ли­зо­вать тка­не­-пов­ре­ж­даю­щийц фак­тор, вы­де­ляе­мый ба­цил­ла­ми.

Ли­те­ра­тур­ные дан­ные сви­де­тель­ст­ву­ют о том, что при си­бир­ской яз­ве био­ми­цин, хло­рам­фе­ни­кол и тер­ра­ми­цин об­ла­да­ют при­мер­но оди­на­ко­вым ле­чеб­ным дей­ст­ви­ем.

Боль­шин­ст­во ис­сле­до­ва­те­лей объ­яс­ня­ют сущ­ность ле­чеб­но­го эф­фек­та ан­ти­био­ти­ков ре­зуль­та­том их пря­мо­го воз­дей­ст­вия на мик­роб­ную клет­ку. Ус­та­нов­ле­но, что ан­ти­био­ти­ки (стреп­то­ми­цин) про­ни­ка­ют в ри­бо­со­мы мик­ро­бов, где про­ис­хо­дит сбор­ка бел­ков из ами­но­кис­лот, и свя­зы­ва­ет­ся с ри­бо­со­маль­ным бел­ком, обес­пе­чи­ваю­щим эту сбор­ку, и тем са­мым тор­мо­зят дан­ный про­цесс.

Спе­ци­фи­че­ское ле­че­ние при си­бир­ской яз­ве це­ле­со­об­раз­но со­че­тать с при­ме­не­ни­ем сим­пто­ма­ти­че­ских средств, из ко­то­рых осо­бо­го вни­ма­ния за­слу­жи­ва­ют сер­деч­ные, а так­же глю­ко­за (внут­ри­вен­но).

При­ме­не­ние ан­ти­био­ти­ков в та­ких слу­ча­ях очень це­ле­со­об­раз­но, осо­бен­но с ши­ро­ким спек­тром их дей­ст­вия. Про­дол­жи­тель­ность и крат­но­сть п­ри­ме­не­ния ан­ти­био­ти­ков мо­гут быть ус­та­нов­ле­ны в ка­ж­дом слу­чае от­дель­но. Ле­чить боль­ных жи­вот­ных не­об­хо­ди­мо в пол­ной их изо­ля­ции, при хо­ро­шем корм­ле­нии. Ни в ко­ем слу­чае нель­зя вклю­чать в ра­ци­он кор­ма, спо­соб­ные трав­ми­ро­вать сли­зи­стые обо­лоч­ки ор­га­нов пи­ще­ва­ре­ния.