Аминокислоты.
Введение
За последние годы потребность в значительных количествах аминокислот неуклонно возрастает в связи с широким использованием их в биохимии, питании, микробиологии и при исследовании растительных и животных тканей. Кроме того, аминокислоты нашли широкое применение в качестве добавок к природным и переработанным продуктам питания. В прошлом потребность в большинстве аминокислот могла быть удовлетворена путем их выделения из кислотных, щелочных и энзиматических гидролизатов белков или из других природных источников. Фактически эти методы и до настоящего времени применяют в промышленности при производстве аргинина, аспарагина, цистина, глутаминовой кислоты, гистидина, оксипролина, пролина и тирозина. Однако сейчас эти методы не представляют собой лучшего пути получения большинства аминокислот, входящих в состав белков. В настоящее время существует целый ряд удобных синтетических методов, позволяющих легко получить аланин, аспарагиновую кислоту, глицин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, серин, треонин, триптофан и валин, а также многие другие аминокислоты, причем как в лабораторном, так и в промышленном масштабах. Наиболее существенные из этих синтетических методов будут подробно рассмотрены в данной главе.
Живой организм характеризуется высшей степенью упорядоченности составляющих его ингредиентов и уникальной структурной организацией, обеспечивающей как его фенотипические признаки, так и многообразие биологических функций. В этом структурно-функциональном единстве организмов, составляющем сущность жизни, белки (белковые тела) играют важнейшую роль, не заменяемую другими органическими соединениями.
Белки — высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот. Название протеины (от греч. protos - первый, важнейший), по-видимому, более точно отражает первостепенное биологическое значение этого класса веществ. Принятые в отечественной литературе названия белки и белковые вещества связаны с обнаружением в тканях животных и растений веществ, имеющих сходство с белком куриного яйца.
В наше время, когда абсолютно достоверно установлено, что наследственная информация сосредоточена в молекуле ДНК клеток любых живых организмов, не вызывает сомнения, что только белки являются теми молекулярными инструментами, при помощи которых генетическая информация реализуется. Без белков, в частности ферментов, ДНК не может реплицироваться, не может воспроизводить себя, т. е. лишена способности передавать генетическую информацию.
Живая природа характеризуется рядом свойств, отличающих ее от неживой природы, и почти все эти свойства связаны с белками. Прежде всего для живых организмов характерны широкое разнообразие белковых структур и их высокая упорядоченность; последняя существует во времени и в пространстве. Удивительная способность живых организмов к воспроизведению себе подобных также связана с белками. Сократимость, движение - непременные атрибуты живых систем - имеют прямое отношение к белковым структурам мышечного аппарата. Наконец, жизнь немыслима без обмена веществ, постоянного обновления составных частей живого организма, т.е. без процессов анаболизма и катаболизма (этого удивительного единства противоположностей живого), в основе которых лежит деятельность каталитически активных белков - ферментов.
Таким образом, белки (белковые вещества) составляют основу и структуры и функции живых организмов. По образному выражению одного из основоположников молекулярной биологии Ф. Крика, белки важны прежде всего потому, что они могут выполнять самые разнообразные функции, причем с необыкновенной легкостью и изяществом. Подсчитано, что в природе встречается примерно 1010 - 1012 различных белков, обеспечивающих существование около 106 видов живых организмов различной сложности организации, начиная от вирусов и кончая человеком. Из этого огромного количества природных белков известны точное строение и структура ничтожно малой части - не более 2500. Каждый организм характеризуется уникальным набором белков. Фенотипические признаки и многообразие функций обусловлены специфичностью объединения этих белков, во многих случаях в виде надмолекулярных и мультимолекулярных структур, в свою очередь определяющих ультраструктуру клеток и их органелл.
В клетке Е. соli содержится около 3000 различных белков, а в организме человека насчитывается свыше 50000 разнообразных белков. Самое удивительное, что все природные белки состоят из большого числа сравнительно простых структурных блоков, представленных мономерными молекулами - аминокислотами, связанными друг с другом в полипептидные цепи. Природные белки построены из 20 различных аминокинокислот. Поскольку эти аминокислоты могут объединяться в самой разной последовательности, то они могут образовать громадное количество разнообразных белков. Число изомеров, которое можно получить при всевозможных перестановках указанного числа аминокислот в полипептиде исчисляется огромными величинами. Так, если из двух аминокислот возможно образование только двух изомеров, то уже из четырех аминокислот теоретически возможно образование 24 изомеров, а из 20 аминокислот - 2,4(1018 разнообразных белков.
Нетрудно предвидеть, что при увеличении числа повторяющихся аминокислотных остатков в белковой молекуле число возможных изомеров возрастает до астрономических величин. Ясно, что природа не может позволить случайных сочетаний аминокислотных последовательностей, и для каждого вида характерен свой специфический набор белков, определяемый, как теперь известно, наследственной информацией, закодированной в молекуле ДНК живых организмов. Именно информация, содержащаяся в линейной последовательности нуклеотидов ДНК, определяет линейную последовательность аминокислот в полипептидной цепи Образовавшаяся линейная полипептидная цепь сама теперь оказывается наделенной функциональной информацией, в соответствии с которй она самопроизвольно преобразуется в определенную стабильную трехмерную структуру. Таким образом, лабильная полипептидная цепь складывается, скручивается в пространственную структуру белковой молекулы, причем не хаотично, а в строгом соответствии с информацией, содержащейся в аминокислотной последовательности.
Учитывая важнейшую роль белков в живой природе, а также то, что белки составляют почти половину сухой массы живого организма и наделены рядом уникальных функций, а в познании структуры и функций белков лежит решение многих важных проблем биологии и медицины.
Функции белка
Белки выполняют множество самых разнообразных функций, характерных для живых организмов. Здесь же будут перечислены главные и в некотором смысле уникальные биологические функции белков, не свойственные или лишь частично присущие другим классам биополимеров.
Каталитическая функция. Все известные в настоящее время биологические катализаторы - ферменты - являются белками. К 1988 г. было идентифицировано более 2100 ферментов. Эта функция белков является уникальной, определяющей скорость химических реакций в биологических системах.
Питательная (резервная) функция. Эту функцию осуществляюттак называемые резервные белки, являющиеся источниками питания для развития плода, например белки яйца (овальбумины). Основной белок молока (казеин) также выполняет главным образом питательную функцию. Ряд других белков несомненно используется в организме в качестве источника аминокислот, которые в свою очередь являются предшественниками биологически активных веществ, регулирующих процессы обмена веществ.
Транспортная функция. Дыхательная функция крови, в частности перенос кислорода, осуществляется молекулами гемоглобина - белка эритроцитов. В транспорте липидов принимают участие альбумины сыворотки крови. Ряд других сывороточных белков образует комплексы с жирами, медью, железом, тироксином, витамином А и другими соединениями, обеспечивая их доставку в соответствующие органы-мишени.
Защитная функция. Основную функцию защиты в организме выполняет иммунная система, которая обеспечивает синтез специфических защитных белков-антител в ответ на поступление в организм бактерий, токсинов или вирусов. Высокая специфичность взаимодействия антител с антигенами (чужеродными веществами) по типу белок-белок способствует узнаванию и нейтрализации биологическог действия антигенов. Защитная функция белков проявляется и в способности ряда белков крови к свертыванию. Свертывание белка плазмы крови фибриногена приводит к образованию сгустка крови, что предохраняет от потери крови при ранениях.
Сократительная функция. В акте мышечного сокращения и расслабления участвует множество белковых веществ. Однако главную роль в этих жизненно важных процессах играют актин и миозин - специфические белки мышечной ткани. Сократительная функция присуща не только мышечным белкам, но и белкам цитоскелета, что обеспечивает тончайшие процессы жизнедеятельности клеток (расхождение хромосом в процессе митоза).
Структурная функция. Белки, выполняющие структурные функции, занимают по количеству первое место среди других белков тела человека. Среди них важнейшую роль играет коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже, эластин в сосудистой стенке и др. Большое значение имеют комплексы белков с углеводами в формировании ряда секретов - мукоидов, муцина и т. д. В комплексе с липидами (в частности, фосфолипидами) белки участвуют в образовании биомембран клеток.
Гормональная функция. Обмен веществ в организме регулируется разнообразными механизмами. В этой регуляции важное место занимают гормоны, вырабатываемые в железах внутренней секреции. Ряд гормонов представлен белками или полипептидами, например гормоны гипофиза, поджелудочной железы и др.
Можно назвать еще некоторые жизненно важные функции белков, в частности способность сохранять онкотическое давление в клетках и крови, буферные свойства, поддерживающие физиологическое значение рН внутренней среды, и др.
Таким образом, из этого далеко не полного перечня основных функций белков видно, что указанным биополимерам принадлежит исключительная и разносторонняя роль в живом организме. Если попытаться вычленить главное, решающее свойство, которе обеспечивает многогранность биологических функций белков, то следовало бы назвать способность белков строго избирательно, специфически соединяться с широким кругом разнообразных веществ. В частности, эта высокая специфичность белков обеспечивает взаимодействие ферментов с субстратами, антител с антигенами, транспортных белков крови с переносимыми молекулами других веществ и т. д. В случае ферментов это взаимодействие основано на принципе биоспецифического узнавания, завершающегося связыванием фермента с соответствующей молекулой, что содействует протеканию химической реакции. Высокой специфичностью действия наделены также белки, которые составляют молекулярную основу таких процессов, как дифференцировка и деление клеток, развитие живых организмов, обеспечивающее их биологическую индивидуальность.
Условия и этапы биосинтеза белка
Трансляция и общие требования к синтезу белка в бесклеточной системе
Прямое отношение к механизмам передачи наследственной информации имеет процесс трансляции, означающий перевод "четырехбуквенного языка нуклеиновых кислот на двадцатибуквеннуб речь белков". Другими словами, трансляция сводится к синтезу белка в рибосомах; в этом синтезе последовательность расположения нуклеотидов в мРНК определяет первичную структуру белка, т.е. строго упорядоченную последовательность расположения отдельных аминокислот в молекуле синтезируемого белка.
В классических исследованиях П.Замечника при использовании меченых аминокислот было впервые точно установлено, что местом синтеза белка являются рибосомы. При определении радиоактивности белков в различных субклеточных фракциях печени, полученных методом дифференциального центрифугирования через различные промежутки времени, было показано, что радиоактивная метка в первую очередь появляется во фракции микросом и лишь затем в других субклеточных образованиях. После установления места включения радиоактивной метки было выяснено участие других субклеточных фракций и низкомолекулярных клеточных компонентов в синтезе белка. При инкубации микросом печени крыс с 14С-лизином включение радиоактивной метки в белки рибосом наблюдалось при наличии в системе, помимо фракции микросом, еще некоторых растворимых компонентов цитоплазмы, источника энергии в форме АТФ или АТФ-генерирующей системы, а также ГТФ.
Дальнейшие исследования были направлены на поиск других компонентов белоксинтезирующей системы.
Белоксинтезирующая система включает: набор всех 20 аминокислот, входящих в состав белковых молекул; минимум 20 разных тРНК, обладающих специфичностью к определенному ферменту и аминокислоте; набор минимум 20 различных ферментов - аминоацил-тРНК-синтетаз, также обладающих двойной специфичностью к какой-либо определенной аминокислоте и одной тРНК; рибосомы (точнее полисомы: состоящие из 4-12 монорибосом с присоединенной к ним матричной мРНК); АТФ и АТФ-генерирующую систему ферментов; ГТФ, принимающая специфическое участие в инициации и элонгации синтеза белка в рибосомах; ионы Mg2+ в концентрации 0,005-0,008 М; мРНК в качестве главного компонента системы, несущей информацию о структуре белка, синтезирующегося в рибосоме; наконец, белковые факторы, участвующие в синтезе на разном уровне трансляции.
Рассмотрим более подробно структуру и функцию главных компонентов белоксинтезирующей системы.
Рибосомы
Живые организмы, как известно, в зависимости от структуры клеток делятся на две группы: прокариоты и эукариоты. Первые не содержат ограниченного мембраной ядра и митохондрий или хлоропластов; они представлены главным образом микроорганизмами. Клетки эукариот животных и растений, включая грибы, напротив, содержат ядра с мембранами, а также митохондрии (и в ряде случаев хлоропласты).
Оба типа клеток содержат рибосомы, причем рибосомы эукариот (клетки животных) примерно в два раза больше рибосом прокариот (бактерии). Обычно рибосомы характеризуют по скорости их седиментации в центрифужном поле, которая количественно выражается константой седиментации s, выражаемой в единицах Сведберга S.
Величина s зависит не только от размера частиц, но и от формы и плотности, так что она не пропорциональна размеру. Число рибосом в микробной клетке примерно равно 104, а эукариот — около 105.
Химически рибосомы представляют собой нуклеопротеины, состоящие только из РНК и белка, причем 80S рибосомы эукариот содержат примерно равное их количество, а у 70S рибосом прокариот соотношение РНК и белка составляет 2:1. РНК рибосом принято называть рибосомным и обозначать рРНК. Как 80S, так и 70S рибосомы состоят из двух субчастиц; это можно при помощи электронной микроскопии или путем обработки рибосом растворами, содержащими низкие концентрации ионов Mg2+. При этих условиях рибосомы диссоциируют на субчастицы; последние могут быть отделены друг от друга методом ультрацентрифугирования. Одна из субчастиц по размерам в 2 раза превышает размер второй; так, у 70S рибосом величины S для субчастиц равны 50S и 30S, у 80S рибосом, соответственно 60S и 40S. Субчастицы рибосом клеток эукариот устроены более сложно: более 70 разных белков в обеих субчастицах, при этом большая субчастица содержит 28S, 5,8S и 5S рРНК, а малая содержит 18S рРНК (К настоящему времени полностью расшифрована первичная структура всех рРНК в 70S и 80S рибосомах и аминокислотная последовательность всех 55 белков 70S рибосом и частично белков 80S рибосом.).
Для выяснения тонких молекулярных механизмов синтеза белка в рибосомах необходимы сведения о структуре и функциях рибосом. В последнее время получены данные, свидетельствующие о вероятной пространственной трехмерной структуре как целых рибосом, так и их субчастиц. В частности, выяснено, что форму и размеры 30S и 40S рибосом предопределяют не белковые молекулы этих частиц, а третичная структура входящих в их состав 16S и 18S рРНК. Более того, по данным акад. А.С. Спирина, для сохранения пространственной морфологической модели всей 30S субчастицы оказалось достаточным наличие только двух белков, содержащихся в определенных топографических участках молекулы 16S рРНК.
Относительно происхождения рибосом известно, что рРНК происходит из общего предшественника всех клеточных РНК, в свою очередь синтезирующегося на матрице ДНК в ядре; рибосомные белки имеют цитоплазматическое происхождение, затем они транспортируются в ядрышки, где и происходит спонтанное образование рибосомных субчастиц путем объединения белков с соответствующими рРНК. Объединенные субчастицы вместе или врозь транспортируются через поры ядерной мембраны обратно в цитоплазму, где ряд рибосом вместе с мРНК образуют полисомы или полирибосомы.
Аминоацил-тРНК-синтетазы.
Экспериментально доказано существование в любых клетках живого организма специфических ферментов, катализирующих активирование аминокислот и связывание последних с определенными тРНК. Все эти ферменты выделены в чистом виде из E. coli.
Молекулярная масса почти всех синтетаз равна 100 000 Да, за исключением фенилаланин-тРНК-синтетазы (180 000 Да). Все они оказались чувствительными к реагентам на SH-группы и требуют присутствия ионов Mg2+. Ферменты обладают абсолютной специфичностью действия, поскольку они узнают только одну какую-либо L-аминокислоту или одну тРНК; это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку в дальнейшем в белковом синтезе "узнавание" аминоацил-тРНК основано не на природе аминокислоты, а на химической природе антикодона тРНК. Считается, что в молекуле каждой аминоацил-тРНК-синтетазы имеются по крайней мере три центра связывания: для аминокислоты, тРНК и АТФ; ферменты весьма чувствительны также к аналогам аминокислот, которые ингибируют активирование соответствующих аминокислот. Некоторые ферменты состоят из одной полипептидной цепи, другие из двух или четырех гомологичных или гетерогенных субъединиц.
Аминоацил-тРНК-синтетазы в активном центре содержат гистидин, имидазольное кольцо которого участвует в связывании АТФ посредством ионов Mg2+. Наибольшим сродством эти ферменты, как было указано, обладают по отношению к молекулам специфических тРНК, хотя конкретный механизм, посредством которого ферменты узнают подходящую РНК, пока не ясен. В то же время эти ферменты отличаются низкой молярной активностью (число оборотов не превышает нескольких сот каталитических актов в минуту).
Транспортные РНК
В лаборатории М. Хогланда было выяснено, что при инкубации 14С-аминокислоты с растворимой с растворимой фракцией цитоплазмы в присутствии АТФ и последующим добавлением трихлоруксусной кислоты в образовавшемся белковом осадке метка не открывается. Было сделано заключение, что меченая аминокислота не включается в белковую молекулу. Метка оказалась связанной ковалентно с РНК, содержащейся в безбелковом фильтрате. Показано, что РНК, к которой присоединяется меченая аминокислота, имеет небольшую молекулярную массу и сосредоточена в растворимой фракции, поэтому ее сначала назвали растворимой, а потом адапторной или транспортной РНК (тРНК). На долю тРНК приходится примерно 10 — 15 % общего количества клеточной РНК. К настоящему времени открыто более 60 различных тРНК. Для каждой аминокислоты в клетке имеется по крайней мере одна специфическая РНК (для ряда аминокислот открыто более одной, в частности, для серина — 5 разных тРНК, для лизина и глицина — по 4 разных тРНК, хотя и в этом случае каждая тРНК связана со специфической аминоацил-тРНК-синтетазой). Молекулярная масса большинства тРНК колеблется от 24 000 до 29 000 Да. Они содержат от 75 до 85 нуклеотидов. Аминокислоты присоединяются к свободной 3'-OH-группе концевого мононуклеотида, представленного во всех тРНК АМФ, путем образования эфирной связи. Интересно, сто все тРНК обладают не только удивительно сходными функциями, но и очень похожей трехмерной структурой.
Установлена первичная структура почти всех 60 открытых тРНК; знание последовательности, а следовательно, состава тРНК дало в руки исследователей много ценных сведений о биологической роли отдельных компонентов тРНК. Общей для тРНК оказалась также нативная конформация, установленная методом рентгеноструктурного анализа и
8-09-2015, 21:37