Туберкулез вызывается микобактериями туберкулеза, медленно растущими кислотоустойчивыми бациллами. Воскоподобная клеточная стенка микобактерий, которая состоит из нескольких гликолипидов, таких как липоарбиноманнан и фосфоинозитолманнозид и длинной цепочки жирных кислот (50-80 атомов углерода) ответственны за медленный рост, кислотоустойчивость, устойчивость ко многим обычным антибиотикам и дезинфектантам. Отдельные вирулентные факторы не были описаны, но это может измениться, так как недавно был расшифрован геном микобактерий туберкулеза. Вдобавок, усилия должны быть направлены на определение функциональной нагрузки генома и белков Mycobacteriumtuberculosis. Это связано с тем, что срочно необходима вакцина лучшая, чем ВЦЖ с её низкой эффективностью. Данная вакцина должна достигнуть сильного цитотоксического и воспалительного Т-клеточного ответа для уничтожения туберкулезных бацилл.
Понимание важной роли генетических факторов в развитии туберкулеза пришло в первую очередь из эпидемиологических и близнецовых исследований. Так, в нескольких работах было показано, что степень устойчивости к M. tuberculosis у человека коррелируется с регионом его происхождения – предки более предрасположенных к заболеванию индивидов чаще всего происходил из областей, где туберкулез не распространен. Кроме того, частота клинического туберкулеза особенно высока во время эпидемий в популяциях, ранее не встречавшихся с данной инфекцией, в частности, у американских и канадских индейцев.
Опубликованы исследования генов, ответственных за предрасположенность к туберкулезу у человека. Так, у жителей Камбоджи была показана ассоциация аллеля HLA-DQB1*0503 II с заболеванием. Во многих популяциях предрасположенность к проказе ассоциирована с HLA-DQB2. С проказой ассоциирован также полиморфизм в области промотора гена TNFA.
Показано, что с туберкулезом связаны три точечные замены в гене белка, связывающего маннозу (MBL). Причем частота этих вариантов была достаточно высока как у европеоидов, так и у африканцев и австралийских аборигенов.
В последнее время получены доказательства связи туберкулеза с полиморфизмом гена рецептора к витамину D (VDR). Показаны ассоциации с туберкулезом полиморфизма генов, кодирующих интерлейкин-1β (ILIB) и его рецепторный антагонист (ILIRA). Ведутся исследования также и других генов, рассматриваемых как кандидаты на роль генов предрасположенности к туберкулезу, исходя из их функции (NOS2, TLR, NAT2, GST) [1].
Вместе с тем существуют четкие причинно-следственные отношения между редкими менделирующими иммунодефицитами по Т-клеткам или фагоцитам и тяжелыми формами туберкулеза. Пациенты с такими заболеваниями в значительной степени чувствительны к инфекции не только M. Tuberculosis, но и другими микроорганизмами.
На основании имеющихся на сегодняшний день данных сформулировано предрасположение о непрерывном спектре генетического контроля предрасположенности к туберкулезу у человека: моногенные формы – варианты с эффектом главного гена (олигогенные формы) – полигенная подверженность. Прогресс в молекулярно-генетических исследованиях предрасположенности к заболеванию будет, вероятно, возможен только при комплексном анализе. Возможно, на всех уровнях генетического контроля участвует один ген, имеющий редкие мутации, ответственные за менделирующие тяжелые фенотипы, относительно редкие варианты, обусловливающие основной эффект, и распространенные в популяциях полиморфизмы, в умеренной степени определяющие риск развития заболевания [8].
Поиск такого гена (генов) – на сегодняшний день актуальная задача. Кроме того, важным представляется изучение функционального полиморфизма известных генов-кандидатов туберкулеза в популяциях различного этнического состава с разной частотой заболевания.
Глава 3. Персистентные бактериальные инфекции: интерфейс патогена и иммунная система хозяина
Персистентные бактериальные инфекции включают в себя M. tuberculosis, Salmonellaenterica и др., которые являются значительной проблемой для здоровья населения. Увеличивается количество лекарственно-устойчивых штаммов M. tuberculosis и S. typhi. M. tuberculosis и S. typhi вызывают заболевания, часто ассоциированные с HIV инфекцией.
Когда патогенный микроорганизм впервые инфицирует своего хозяина, обычно происходит драматическая активация врожденного и адаптивного иммунного ответов, что приводит к проявлению симптомов болезней. Адаптивная иммунная система хозяина обычно очищает организм от внедрившегося патогенна. Хотя некоторые патогенные бактерии способны поддерживать инфекционный процесс у млекопитающих даже при развитии воспаления, специфических антимикробных механизмов и сильного адаптивного иммунного ответа; в дальнейшем развивается персистентная инфекция. Микобактерии туберкулеза вызывают длительную инфекцию и могут служить причиной острых или хронических заболеваний; они также могут бессмысленно персистировать и реактивироваться в дальнейшем [3].
Персистентная колонизация бактериями происходит без видимых клинических проявлений. Хотя даже при отсутствии клинических симптомов инфекция несет некоторый риск для хозяина. Индивиды, зараженные микобактериями туберкулеза, рискуют при реактивации патогенна заразиться активной формой туберкулеза, которая опасна для жизни. Длительная персистенция бактерий в привилегированной нише хозяина – макрофагальной вакуоли – вызывает несколько фундаментальных биологических вопросов. Например, каков репликативный и метаболический статус бактерии во время бессимптомной персистенции, и как им так долго удается избежать действия иммунного ответа хозяина. Сейчас начинают понимать бактериальные и факторы хозяина, которые вовлечены во взаимодействие патоген-хозяин в течение персистирующей инфекции.
Возможность вызывать персистирующие инфекции – фундаментальный аспект взаимодействия между многими различными вирусными, бактериальными патогенами и их хозяином-млекопитающим.
3.1 Персистентные микобактериальные инфекции
Патогенные микобактерии вызывают некоторые длительные инфекционные заболевания у их хозяев. M. Tuberculosisвызывают туберкулез, одно из самых древних известных человеческих заболеваний, этими бактериями по различным оценкам инфицирована треть населения Земли. Первоначальное заражение микобактериями ведет к репликации инициального сайта инфекции в легких. Это сопровождается бацилемией, во время которой наибольшее число бактерий рассеиваются в нелегочных органах – региональных лимфатических узлах. Мигрируют M. Tuberculosis внутри ДК. Адаптивный иммунный ответ и ограничение бактериального роста происходит после их диссеминации, чему способствует доставка бактерий в лимфоидные органы. У многих инфекционный процесс заканчивается после инициации адаптивного иммунного ответа. Хотя у некоторых организм никогда полностью не очищается от патогена. При персистентном заражении люди могут стать носителями на многие годы и даже в течение всей жизни. Существует риск, что бессимптомная инфекция перейдет в высококонтагиозный, клинически активный и потенциально опасный для жизни болезненный статус, известный как реактивация туберкулеза. Риск перехода в клинически активную форму очень велик после инициации инфекции, часто это происходит у иммунологически компромиссных индивидов (новорожденных, людей старческого возраста и инфицированных ВИЧ).
3.2 Выживание микобактерий
Персистирующие микобактерии находятся в гранулемах. Хотя точная локализация живых патентных микобактерий во время персистирования остается спорной. Бактерии часто находят в макрофагах внутри гранулем, которые формируются в ответ на персистенцию внутриклеточных патогенов (рис. 2). Туберкулезные гранулемы человека и мышей состоят из организованной коллекции макрофагов, Т-лимфоцитов, некоторых В-лимфоцитов, дендритных клеток, фибробластов. Считается, что гранулемы начинаются с агрегацией мононуклеарных фагоцитов, которые окружают индивидуальные инфицированные макрофаги. Данные макрофаги становятся активированными и в некоторых случаях макрофаги сливаются в гигантские клетки, которые также формируются в ответ на другие персистирующие инфекции, в частности, вирусные. Т-лимфоциты и другие иммунные клетки также участвуют в процессе образования гранулемы. Развивающееся поражение закрывается окружающими эпителиальными тканями, которые имеют плотные интердигитированные клеточные мембраны, формирующие оболочку, похожую на молнию и соединяющую соседние клетки. В центре гранулемы обычно находится очаг казеозного некроза – участок клеточных осколков. Как микобактерии выживают внутри данного поражения в течение многих лет? Одна из гипотез гласит, что персистентные бактерии находятся в нерепликативной стадии или имеют низкий уровень репликации в центре казеозного очага. Доказательство того, что у человека персистентные бактерии в дремлющем состоянии, в результатах культурирования и окрашивания пораженных тканей пациентов, подвергшихся химиотерапии. Это, возможно, является ошибкой при культивировании. Альтернативная гипотеза того, как постоянный бактериальный груз поддерживается, состоит в том, что существует баланс между бактериальной репликацией и действием иммунной системы.
3.3 Выживание внутри макрофагов
Патогенные микробактерии инициируют длительную инфекцию, внедряясь в макрофаги и предотвращая нормальное созревание фагосом. Возможность микобактерий реплицироваться и/или выживать в макрофагах играет существенную роль в персистенции invivo. Это черта, с помощью которой различают патогенные и непатогенные штаммы.
Инфицированные макрофаги становятся главными резервуарами микобактерий. Были описаны случаи распространения патогенна внутри макрофагов. Микобактерии вмешиваются в созревание фагосом, блокируя слияние образовавшихся фагосом с эндосомами и лизосомами и изменяя мембранные протеины, которые в норме способствуют образованию фаголизосом. Также у патогенных микобактерий выработался механизм, который позволяет им персистировать в макрофагальных фаголизосомах. Исследования показали, что внутри гранулем лягушки ≈ 60 % интактных бактерий вида М.marinum, которые близки к M. tuberculosis. Уровень фаголизосомального слияния коррелирует с уровнем макрофагальной активации. Микобактерии имеют два механизма адаптации к интрамакрофагальному выживанию: ограничение фаголизосомального слияния или адаптация к фаголизосомальным условиям.
В последних публикациях сказано, что микобактерии имеют временные и иммунно-опосредованные различия в генной экспрессии в активированных invitro и в макрофагах, изолированных от инфицированных тканей. Последние исследования показали различные выживания микобактерий в типе 1 (ИЛ23-продуцирующие) и типе 2 (ИЛ10-продуцирующие) макрофагов. Иммунный статус макрофагов имеет важную роль в персистенции микобактерий. ИФНγ – критический компонент иммунитета при туберкулезе, он активирует инфицированные макрофаги, что приводит к ингибированию репликации микобактерий. Важность данной молекулы в контроле микобактериальных инфекций доказывается открытием ИФНγ-связанных генетических мутаций, при которых появляется предрасположенность к туберкулезу. ИФНγ индуцирует экспрессию NO-синтетазы 2 (NOS2) и недавно идентифицированного NOS2-независимого, 47 кДа гуанозин-3-фосфат протеина LRG-47; оба пути важны в контроле интрацеллюлярной репликации микобактерий. Хотя часть бактерий всё равно способна выживать в макрофагах, возможно, благодаря механизмам ингибирования STAT-1 опосредованного ИФНγ транскрипционного ответа и/или супрессии секреции ИЛ12 – провоспалительного цитокина, который способствует усилению продукции ИФНγ [5].
3.4 Иммунный ответ на персистирующие микобактерии
Пока мало известно об иммунных механизмах, которые вовлечены в ответ против персистирующих микобактерий. В последних работах с использованием методов молекулярных отпечатков было показано повторное заражение иммуннокомпетентных людей новыми штаммами M. Tuberculosis. Это доказывает, что иммунитет к туберкулезу может быть неполным и что повторное заражение играет немаловажную роль.
Роль адаптивного иммунного ответа при персистенции микобактерий очень важна. Есть некоторые свидетельства, что CD8+ Т-клетки секретируют большую часть ИФНγ. Во время острой фазы болезни большую часть ИФНγ продуцирует CD4+ Т-клетки, доказывая различную активацию Т-лимфоцитов в эти фазы инфекционного процесса. В дополнение к продукции ИФНγ активные CD8+ Т-клетки контролируют персистентные инфекции.
Продукция иммунносупрессорных цитокинов, таких ИЛ10 и ТФРβ, была описана у людей с активным туберкулезом и повышение продукции ИЛ10 в легких у мышей с хронической микобактериальной инфекцией. Это свидетельствует о том, что ИЛ10 может способствовать реактивации хронического туберкулеза.
Глава 4. CD-1 и CD-1-рестриктированные Т-клетки при инфекциях, вызванных внутриклеточными бактериями
Гликолипид-специфичные, CD-1a-, b-, c- зависимые цитотоксические Т-клетки вовлечены в ответ организма против туберкулеза (рис. 3). Молекулы CD-1 презентуют микобактериальные гликолипиды из различных внутриклеточных участков зараженной клетки. Во время микробной инфекции CD-1d-зависимые натуральные киллеры быстро продуцируют цитокины и выполняют регуляторную функцию [23].
Участие главного комплекса гистосовместимости (МНС) в Т-клеточном ответе было показано на вирусных системах, но его важность в бактериальных инфекциях и в ответе против простейших бесспорно. МНС-II-рестрикрированные CD8+ Т-клетки играют важную роль в защите организма против бактерий и простейших, тогда как МНС-I-рестриктированные CD8+ Т-клетки важны в случаях вирусных инфекций. Первые Т-клеточные популяции выполняют хэлперную функцию, выделяются цитокины для активации макрофагов и/или В-клеток, тогда как последующие, главным образом, действуют, убивая зараженные клетки хозяина. Во время некоторых бактериальных инфекций вместе с обычными CD4+ и CD8+ Т-клетками также есть необычные Т-клетки для содействия в достижении устойчивости: это Тγδ-лимфоциты, которые распознают фосфолипиды и Тαβ-лимфоциты, которые контролируются неклассическими МНС и МНС-похожими молекулами. Т-клетки, контролируемые CD-1 молекулами и противодействующие бактериальным гликолипидам, также являются необычными Т-клетками.
4.1 Атигенпрезентующие молекулы
В цитоплазме белки разрушаются протеазами. Образовавшиеся пептиды затем трансформируются в эндоплазматическом ретикулуме специальными транспортными молекулами так называемыми транспортерами переработанного антигена (ТАР). В эндоплазматическом ретикулуме эти пептиды затем обрезаются для упаковки в щель, сформированную первым и вторым доменом тяжелой цепи МНС-I. После ассоциации с β2 микроглобулином (β2 m), комплекс МНС-I- β2 m транспортируется на клеточную поверхность, где презентует пептиды для CD8+ Т-клеток. Молекула МНС-IIсостоит из двух тяжелых цепей: α-цепь и β-цепь, первые домены обоих цепей образуют щель, в которую загружается пептид в поздних эндосомально-лизомальных отделах. Пептиды, которые презентуются молекулами МНС-II, образуются в эндосомально-лизомальной системе под действием протеаз (таких как аспарагинилпептидаза, катепсины). Благодаря большому полиморфизму молекул МНС, каждая обладает уникальным гаплотипом. Это гарантирует то, что огромное множество антигенных пептидов будет презентовано и исключает возможность, что какой-то патоген избежит распознавания Т-клетками. Различные антигенные пептиды выбираются разными видами МНС. В противоположность классическим молекулам МНС неклассические МНС-Ib и CD-1 не обладают полиморфизмом. Поэтому антигенные лиганды, презентуемые данными молекулами Т-клеткам, должны быть более устойчивыми [24].
До недавнего времени считалось, что Т-клетки оказывают влияние на пептидный антиген, тогда как В-клетки могут распознавать протеины сахара, гликолипиды, нуклеиновые кислоты и другие виды антигенов. Эта теория была подвергнута сомнению, когда обнаружили, что CD-1 молекулы презентуют гликолипидные антигены Т-клеткам (рис. 4). Есть два вида молекул CD-1 CD-1a, CD-1bCD-1c из первой группы, CD-1d из второй группы. Обе группы презентуют антиген в человеческом организме и в организме некоторых млекопитающих, таких как кролик. У мыши антиген презентуют только молекулы СD-1 из второй группы. CD-1 молекулы похожи на молекулы МНС-I тем, что они состоят из α-цепочки, включающей три домена, которые нековалентно связаны с β2 m. Анализ кристаллической структуры CD-1d показал, что α-цепочка формирует щель между первым и вторым доменами, которая уже и глубже, чем у молекул МНС 1-го класса. CD-1 антиген-связывающая щель не способна формировать водородные связи с пептидным антигеном как это делает молекула МНС 1-го класса, но хорошо подходит для гидрофобного взаимодействия. В добавок к кортикальным тимоцитам, группа I СD-1 молекул первая экспрессируется в дендритных клетках (ДК), которые являются важнейшими антигенпрезентующими (АПК) для Т-клеток. Группа IICD1 молекул наоборот, в основном находится на эпителиальных клетках, кортикальных тимоцитах и гепатоцитах, но они тоже могут быть экспрессированы на АПК таких, как ДК, макрофагах и β-клетках. При микобактериальной инфекции invitro возрастает экспрессия CD1d молекул на поверхности мышиных ДК и макрофагов [23].
4.2 Презентация микобактериальных липидов группой ICD1 молекул
Исследования, проведенные Порцелли, Бреннер, Кроненберг и Модлин доказали, что CD1a, CD1b, CD1cмолекулы презентуют микобактериальные гликолипиды клеточной стенки. Микобактерии обладают клеточной стенкой, богатой гликолипидами, что очень важно для их устойчивости. Было доказано, что CD1 молекулы первой группы презентуют на Тαβ-клетках гликолипиды фосфоиннозитолманнозиды (PIM), липоарабиноманнан, (LAM) миколовые кислоты и гексозо-1-фосфоизопреноиды. Не было идентифицировано ни одного бактериального антигена, презентуемого CD1 молекулами второй группы.
CD1d-рестриктированные клетки имеют уникальный фенотип. Они экспрессируют на поверхности CD3 комплекс также хорошо, как и маркеры для NK, NK1-клеток. Более того, они экспрессируют высоко специфичный ТКР репертуар, включающий Vα14Jα281 комбинацию у мыши и гомологичную Vα24JαQ у человека. Поэтому считается, что NK Т-клетки похожи. Этот факт также подтверждается тем, что они реагируют с αGalCer.
4.3 Внутриклеточная локализация CD1 молекул
Фагоцитированный макрофагами бактериальный патоген попадает в фагосому, которая затем проходит через несколько стадий. Главные шаги, которые проходит фагосома:
1.Ранняя эндосомальная стадия, на которой фагосома сближается и трансферрином.
2.Поздняя эндосомальная стадия, на которой фагосома закисляется до оптимальной для лизосомальных ферментов pH.
3.Фагосома, в которой идет внутриклеточноке "пищеварение".
Микобактерии мешают созреванию фагосом, хотя механизм этого пока еще не известен. Микобактериальные фагосомы не до конца закислены, но бактерии получают доступ к трансферрину, который является главным депо железа не только для клеток хозяина, но и для микобактерий. Трансферрин и его рецептор двигаются вдоль ранней переработанной эндосомы, отдает готовое железо и затем возвращается на клеточную поверхность. Показано, что микобактериальные гликолипиды в самом деле нагружаются на CD1 молекулы в течении микобактериальной инфекции, эти молекулы могут быть найдены в компартментах. Внутриклеточная локализация CD1 молекул и микобактерий, покрывающих их была анализирована с помощью конфокусной сканирующей лазерной микроскопии дендритных клеток зараженного человека. При использовании различных внутриклеточных меркеров было найдено, что три CD1 молекулы первой группы локализованы в клетки по-разному. CD1а молекула по распределению похожа на МНС первого класса и точно также экспрессирована на клеточной поверхности. Кроме того, CD1а молекула была локализована на ранних рециклирующих эндосомах положительных для GT-PaseARF6 и для гранул Бирбека клеток Лангерганса. CD1b и CD1c молекулы были найдены в поздних эндосомально-лизосомальных везикулах. Данные компартменты также служат как "доки" для разгрузки пептидов в МНС молекулы второго класса. В противопоставление CD1b, CD1с молекула обильно презентуется на плазматической мембране и в Tf-лабильных ранних эндосомах. Кроме того, было найдено, что многочисленные гликолипиды, включая LAM и PIM, отщепляются от микобактерий внутри фагосом и транспортируются из фагосомы в поздние эндосомы и лизосомы. CD1b и CD1с молекулы были также обнаружены в этих компартментах. CD1с молекулы могут также взаимодействовать с микобактериальными гликолипидами, потому что в зараженных клетках они были обнаружены в микобактериальных фагосомах, задержанных на ранней стадии активации [24].
CD1b молекулы были первоначально найдены в зрелых фаголизосомах. Как ранее было показано, созревание фагосом сопровождается потерей жизнеспособности микобактериями, поэтому эти фаголизосомы скорее всего состоят из нежизнеспособных микобактерий. Дальнейшие эксперименты показали, что зараженные клетки хозяина отщепляют гликолипиды, которые могут быть поглощены дендритными клетками, лежащими в их окрестности. Данные открытия объясняют транспорт антигенных гликолипидов из макрофагов в ДК, или из главных хозяйских клеток к главным АПК, экспрессирующим CD1 молекулы, в эксперименте invitro. Предварительные данные свидетельствуют, что внутриклеточные везикулы различных размеров, такие как экзосомы и апоптические пузырьки, принимают участие в данном транспорте. Во время микобактериальной инфекции экспрессия на поверхности молекул МНС первого и второго класса
8-09-2015, 21:52