Освобождение гемокоагулирующих и фибринолитических веществ из легких позволяет считать их одним из органов – эффекторов (наряду с сосудами, почками, желудочно-кишечных трактов), регулирующих свертывание крови и ее фибринолитическую активность. В стрессовых ситуациях и операциях на легких эти соединения выделяются в кровоток в более значительном количестве, нежели в норме, приводя к нарушениям гемокоагуляции. Гиперкоагулемия и внутрисосудистое свертывание крови при операциях на легких связаны с их тромбопластической активностью [44].
Гемокоагулирующие свойства предстательной железы, почек и мочевыводящих путей
Тромбогеморрагические осложнения при урологических операциях возникают возникают особенно часто. Причину этих осложнений связывают с поступлением в кровоток из оперируемого органа гемокоагулирующих и фибринолитических агентов [44].
Предстательная железа и ее аденома содержит активные тромбопластин, естественные антикоагулянты, антигепариновый фактор, фибриназу, ферменты, подобные плазменным факторам V и VII, активаторы и ингибиторы фибринолиза, вещества активно участвующие в сосудисто-тромбоцитарном гемостазе. При попадании в кровоток тканевой жидкости предстательной железы или ее аденомы доминирует действие тромбопластических и антифибринолитических соединений, а это способно привести к интравазальной гемокоагуляции и торможению фибринолиза.
При урологических операциях на свертывание крови могут влиять и гемокоагулирующие вещества мочевыводящих путей, которые травмируются при операционном вмешательстве. Экстракты мочевыводящих путей содержат антикоагулянты, тканевую фибриназу, усиливающую стабилизацию фибрина. Таким образом, мочевыводящие пути содержат весьма активный тромбопластин, фибриназу, естественные антикоагулянты, активаторы и ингибиторы фибринолиза.
Почки относятся к органам с высокой тромбопластической и фибринолитической активностью. В почках синтезируются и освобождаются в кровь и мочу тромбопластин, антигепариновые субстанции, антикоагулянты, вещества подобные плазменным факторам V и ХIII. При попадании мочи на раневую поверхность при аденомэктомии или при операциях на мочевом пузыре она будет стимулировать локальное свертывание и тормозить локальный фибринолиз, создавая надежный гемостаз в операционном поле [44].
Гемокоагулирующие свойства желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы
Местные и генерализованные тромбогеморрагические нарушения при заболеваниях пищеварительной системы встречаются весьма часто [44].
При онкологических заболеваниях гемокоагулирующие свойства стенок ЖКТ меняются. Опухоли обладают большей тромбопластической и антигепариновой активностью, чем не пораженные стенки. Экстракты опухоли желудка укорачивают тромбиновое время плазмы. Вытяжки же здорового желудка обладают высокой антикоагулянтной активностью. Опухоли желудка содержат меньше фибриназы, чем интактные участки. Фибринолитическая активность опухоли снижена вследствие увеличения в них ингибиторов фибринолиза. Фибринолитические компоненты опухолей содержат проактиватор и активатор плазминогена, плазминоген, большое количество ингибиторов. Обнаружено уменьшение содержания антигепариновых и фибрин-стабилизирующих соединений, почти полное отсутствие гепарина, комплексные соединения гепарина (с фибриногеном, адреналином, плазмином, серотонином). Усиление антигепариновой активности в опухоли ведет к связыванию гепарина, что благоприятствует действию активного тромбопластина опухолевой ткани и приводит к образованию в ней фибрина, защищающего клетки опухоли от канцеролитических агентов крови. В крови, оттекающей от пораженного раком желудка, усилена тромбопластическая и угнетена фибринолитическая активность, что объясняется выделением из опухоли ингибиторов фибринолиза и угнетением активаторов плазминогена [44].
Ткани поджелудочной железы обладают тромбопластической активностью, проявляют антифибринолитическое действие. При операциях на поджелудочной железе трипсин и гемокоагулирующие субстанции проникают в кровоток. Трипсин обладает многосторонним действием на свертывание крови: он усиливает агрегацию тромбоцитов, активирует плазменные факторы ХII, ХI, Х, VII, II, ХIII, запуская свертывание крови как по внешнему, так и по внутреннему пути. Он лизирует фибриноген и фибрин с образованием продуктов их деградации. Таким образом, трипсин усиливает течение тромбогеморрагического синдрома[44].
1.2 Пептидергическая система
1.2.1 Механизм образования активных форм пептидов
В регуляции гемостаза принимают участие пептиды. Это природные или синтетические соединения, молекулы которых построены из остатков аминокислот, соединенных между собой пептидными (амидными) связями C(O)–NH. Могут содержать в молекуле также неаминокислотную компоненту (напр., остаток углевода). Большинство биологически активных пептидов синтезируется в составе высокомолекулярных неактивных предшественников – препробелков, которые подвергаются посттрансляционной модификации различного типа [18]. Секретируемые белково-пептидные продукты синтезируются на мембраносвязанных рибосомах ЭПР. Благодаря наличию на N-конце препроформы нейропептида набора гидрофобных аминокислот, так называемой сигнальной последовательности, предшественник транслоцируется через мембрану ЭПР [1]. Внутри ЭПР сигнальная последовательность отщепляется от полипептидной цепи сигнальной пептидазой. Далее процессинг осуществляется в ходе передвижения молекул пропептидов по гранулярному ЭПР, комплексу Гольджи и в секреторных везикулах [38, 51, 62, 72].
Сначала под действием эндопептидаз, расщепляющих нейропептиды по синглетным и дуплетным остаткам основных аминокислот, образуются неактивные пептид, содержащие, как правило, “лишние” N- или, в основном, С-концевые остатки аминокислот. Удаление этих аминокислот в секреторных везикулах осуществляется соответственно аминопептидазо-В-подобным(и) и карбоксипептидазо-В-подобным(и) ферментами [14, 72].
Пептиды играют важную роль во многих процессах, происходящих в организме, например при свертывании крови и фибринолизе, оплодотворении, иммунном ответе (активации системы комплемента), гормональной регуляции. Уровень биологически активных пептидов в организме в значительной степени определяется активностью ферментов их обмена, к которым в частности принадлежат АПФ и КПN [21, 23, 30].
В связи с этим, большой интерес представляет изучение активности данных ферментов у онкологических больных в послеоперационном периоде, когда происходят существенные нарушения в системе гемостаза.
1.2.2 Вазоактивные пептиды и их роль в регуляции гемостаза
Наиболее важную роль в регуляции гемостаза играют вазоактивные пептиды ангиотензин и брадикинин [48].
Ангиотензины – пептиды, образующиеся в организме из ангиотензиногена, представляющего собой гликопротеид (альфа-2-глобулин) плазмы крови, синтезирующийся в печени. Под воздействием ренина (фермент, образующийся в юкстагломерулярном аппарате почек) полипептид ангиотензиноген, не обладающий прессорной активностью, гидролизуется, образуя ангиотензин I - биологически неактивный декапептид, легко подвергающийся дальнейшим преобразованиям. Под действием ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), образующегося в легких, ангиотензин I превращается в октапептид – ангиотензин II, являющийся высокоактивным эндогенным прессорным соединением. Ангиотензин II - основной эффекторный пептид ренин-ангиотензин-альдостероновой системы. Он оказывает сильное сосудосуживающее действие, вызывает быстрое повышение АД. Пептид является стимулятором образования свободных радикалов, в частности супероксидных анионов, которые инактивируют NO, промотируют синтез пироксинитрита и снижает эффективность NO – опосредуемой сосудистой дилатации. Кроме того, вызывает агрегацию тромбоцитов, активирует ингибитор активатора плазминогена, способствуя формированию эндотелиальной дисфункции. Ангиотензин II стимулирует секрецию альдостерона, а в больших концентрациях - увеличивает секрецию антидиуретического гормона (повышение реабсорбции натрия и воды, гиперволемия) и вызывает симпатическую активацию. Все эти эффекты способствуют развитию гипертензии. Ангиотензин II быстро метаболизируется (период полураспада - 12 мин) при участии аминопептидазы А с образованием ангиотензина III и далее под влиянием аминопептидазы N - ангиотензина IV, обладающих биологической активностью. Ангиотензин III стимулирует выработку альдостерона надпочечниками, обладает положительной инотропной активностью. Ангиотензин IV, предположительно, участвует в регуляции гемостаза. Многолетние исследования РААС не только выявили важное значение этой системы в регуляции гемостаза, в развитии сердечно-сосудистой патологии, влиянии на функции органов-мишеней, среди которых наиболее важными являются сердце, кровеносные сосуды, почки и мозг, но и привели к созданию лекарственных средств, целенаправленно действующих на отдельные звенья РААС. Кроме того, на фоне повышенного уровня ангиотензинов I и II происходит образование ангиотензина-(1-7). Ангиотензин-(1-7) образуется из ангиотензина I под действием нейтральной эндопептидазы и из ангиотензина II под действием пролиловой эндопептидазы и является еще одним эффекторным пептидом РААС, оказывающим вазодилатирующее и натрийуретическое действие. Эффекты ангиотензина-(1-7) опосредованы через так называемые, не идентифицированные пока, АТх -рецепторы. Недавние исследования дисфункции эндотелия при артериальной гипертензии позволяют предположить, что кардиоваскулярные эффекты блокаторов ангиотензиновых рецепторов могут быть также связаны с модуляцией эндотелия и влиянием на продукцию оксида азота (NO). Полученные экспериментальные данные и результаты отдельных клинических исследований достаточно противоречивы. Возможно, на фоне блокады АТx -рецепторов, увеличивается эндотелийзависимый синтез и высвобождение оксида азота, что способствует вазодилатации, уменьшению агрегации тромбоцитов и снижению пролиферации клеток.
Брадикинин – естественно образующийся полипептид, состоящий из 9 аминокислот. Брадикинин расширяет просвет периферических и коронарных сосудов, снижает артериальное давление, способствует синтезу NО в эндотелии и усилению антиагрегативной активности крови.
Пептид повышает проницаемость капилляров, сокращает гладкую мускулатуру бронхов и других органов, стимулирует диапедез лейкоцитов и вызывает болевой эффект. Брадикинин освобождает гистамин из тучных клеток, стимулирует синтез и освобождение простагландинов и фактора некроза опухолей в различных тканей, освобождение ряда интерлейкинов, способствует процессам репарации и обладает инсулиноподобным действием, стимулируя захват глюкозы периферическими тканями, модулирует передачу нервных импульсов в центральной и периферической нервной системе.
Брадикинин участвует в периферической регуляции кровяного давления и широком спектре физиологических и патофизиологических эффектов, и особенно в развитии воспаления. В нормальном состоянии брадикинин обычно не присутствует в крови, а образуется в ней лишь при определенных условиях: например, в случае повреждения ткани или изменения кислотности и температуры крови. Многообразное биологическое действие брадикинин осуществляет при взаимодействии с двумя рецепторами В1 и В2 .
Период полураспада брадикинина в большом круге кровообращения равен 17-24 сек., еще быстрее он разрушается в малом круге кровообращения. Это обусловлено наличием в крови и тканях высокоактивных ферментов – кининаз, осуществляющих физиологический контроль уровня кининов [67]. Наиболее важную роль в метаболизме брадикинина играют два фермента – кининаза I (Карбоксипептидаза N), локализованная в плазме крови, и кининаза II (ангиотензинпревращающий фермент) – мембранно-связанный фермент, локализованный в эндотелии сосудов, главным образом легких, а также в тканях почек и в меньшем количестве в тканях других органов.
Хорошо известно, что такие процессы, как гемостаз, водно-солевой обмен, многие функции желудочно-кишечного тракта и репродуцирующей системы могут повреждаться, являясь мишенями воспаления и боли, при этом центральным событием является активация калликреин-кининовая система и образование брадикинина [48].
1.2.3 Ферменты обмена вазоактивных пептидов
Ангиотензинпревращающий фермент
Ангиотензинпревращающий фермент (АПФ, дипептидилкарбоксипептидаза A, кининаза II, карбоксикатепсин, пептидилдипептидаза, КФ 3.4.15.1) – гликопротеин, состоящий из одной большой полипептидной цепи. Кроме того, являетсяZn2+ -содержащей дипептидилкарбоксипептидазой [14].Впервые был выделен Скеггом и соавт. из сыворотки крови лошади. Основная масса фермента находится в мембранно-связанном состоянии – он является интегральным белком плазматической мембраны. Почти вся молекула АПФ локализована вне клетки, гидрофобный трансмембранный участок находится на карбоксильном конце полипептидной цепи, а внутриклеточный гидрофильный участок насчитывает всего 30 остатков аминокислот [53].
Фермент располагается на внешней поверхности плазматической мембраны разных клеток – эндотелиальных (артерии, вены, капилляры), специализированных эпителиальных, находящихся в местах интенсивного всасывания или выделения жидкости и солей (канальцы почек, слизистая оболочка кишечника, сосудистые сплетения мозга, цилиарное тело глаза, плацента), нейроэпителиальных (дендриты, аксоны, нервные окончания), на клетках мононуклеарного ряда (моноциты, макрофаги, фибробласты, лимфоциты), а также в репродуктивных органах. Растворимая форма фермента присутствует практически во всех биологических жидкостях: плазме, лимфе, слезной, спинномозговой, внутриглазной, амниотической жидкостях [22, 54]. До недавнего времени считалось, что растворимая форма освобождается из мембранно-связанной формы в результате отщепления С-концевого якорного фрагмента протеолитическим ферментом – секретазой, находящейся также на поверхности мембраны. Однако в 1998 г. было показано, что существует второй путь образования растворимой формы АПФ, что она может синтезироваться внутри клетки. В эндотелиальных клетках пупочной вены человека была обнаружена мРНК, кодирующая растворимую форму АПФ, не имеющую трансмембранного гидрофобного участка [67, 72].
РI фермента из различных органов и тканей колеблется в пределах от 4,6 до 5,1. Фермент имеет рН-оптимум 7,0-8,0; активируется ионами Cl
, NO
, SO
ингибируется соединениями, содержащими SH-группу, хелаторами (ЭДТА, о-фенантролин), брадикининпотенциирующим фактором (Ki
= 40 нм), ДТТ, 2-меркаптоэтанолом, додедилсульфатом натрия. Кроме того, существуют специфические ингибиторы АПФ – каптоприл (К
= 20 нм), лизиноприл (К= 3-10 нм), и эналаприл (К =25-35 нм).
Фермент катализирует превращение ангиотензина I в ангиотензин II (Km = 4-70 мкМ), последовательно отщепляет два дипептида с С-конца брадикинина (кининазная реакция с участием АПФ осуществляется преимущественно в плацентарном цитозоле), расщепляет неокиоторфин с образованием киоторфина, Met-энкефалин-Arg6-Phe7 с образованием Met–энкефалина, вещество Р и вещество К, холецистокинин и гастрин, энкефалин, нейротензин, нейрокинины А и В, рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона. АПФ осуществляет образование Met-энкефалин-Arg6 из Met-энкефалин-Arg6-Gly7-Leu8, отщепляет последовательно два дипептида с С-конца динорфина А 1-8, расщепляет натрийуретический фактор из мозга и предсердий, вазопрессин, окситоцин. Отщепление АПФ C-концевого Phe-Arg от атриопептина II превращает его в атриопептин I, что сопровождается потерей его свойства расслаблять гладкую мускулатуру сосудов при сохранении натрийуретического действия.
Активность АПФ ингибируется многими биологически активными пептидами и их предшественниками: неокиоторфином, Met-энкефалин-Arg6-Phe7, b-липотропином, веществом Р, брадикинином и лей-энкефалин-арг6 и некоторыми дипептидами.
Относительно недавно было обнаружено, что АПФ является также компонентом тканей, богатых фибриллярным коллагеном (матрикс сердечных клапанов, рубцы, образующиеся в результате инфаркта миокарда, и др.), и что его содержание повышается с усилением фиброза. Предполагается, что он может оказывать влияние на состав внеклеточного матрикса, в частности на синтез коллагена [22]. Кроме того, АПФ был обнаружен в атеросклеротических бляшках в стенках сосудов, что указывает на участие фермента в атеросклеротических процессах [67].
Фермент АПФ вовлекается в физиологический контроль за циркуляцией крови в послеоперационный период, регулируя калликреин-кининовую и ренин-ангиотензивую системы [48, 74]. В связи с этим представляет интерес изучения активности АПФ в сыворотке крови у онкологических больных в ранней послеоперационный период.
Карбоксипептидаза N
КПN (кининаза I, аргинин-карбоксипептидаза) впервые выделена и очищена Erdos и Sloane из плазмы крови человека. Фермент локализован в плазме крови, обнаружен в стенках кровеносных сосудов, слизистой оболочке носа, моче, имеется единичная работа по выделению фермента из микроворсинок плаценты человека.
Фермент имеет Mr 280 кДа и состоит из четырёх субъединиц трёх типов: двух с Mr 88 кДа и по одной с Mr 55 кДа и 48 кДа. Субъединицы с Mr 88 кДа гликозилированы (на долю углеводов приходится 29% массы), не обладают ферментативной активностью и, по-видимому, стабилизируют фермент в плазме крови [62]. Они содержат 12 богатых лейцином областей, участвующих в связывании с активными субъединицами [70]. Субъединицы с Mr 48 кДа и 55 кДа обладают ферментативной активностью и не содержат в своём составе углеводных остатков. Ограниченное протеолитическое расщепление субъединицы с Mr 55 кДа сериновыми протеиназами приводит к превращению её в субъединицу с Mr 48 кДа, более глубокое расщепление даёт два фрагмента с Mr 27 и 21 кДа. Образовавшиеся фрагменты в ассоциированном состоянии обладают большей активностью, чем нативные субъединицы, но стабильность фермента при этом снижается.
КПN содержит в активном центре ион Zn2+ , проявляет максимальную активность при pH 7,0-7,8, сохраняет около 50% от максимальной активности при pH 6,0 [55, 58]. Фермент ингибируется ЭДТА и о-фенантролином, МГТК (Ki = 0,5 мкМ), ГПЯК (Ki = 0,9 мкМ), ГЭМЯК (Ki =1,5 мкМ), АПМЯК (Ki = 52 мкМ), гистаргиноми протамином (Ki = 0,32 мкМ) [56, 66]. Несмотря на то, что дитиотреитол значительно активирует фермент, 2-меркаптоэтанол и реагенты на сульфгидрильные группы ПХМФС и ПХМБ не влияют на его активность. ФМСФ, ДФФ и апротинин также не влияют на активность фермента.
КПN отщепляет остатки аргинина и лизина с C-конца различных синтетических пептидов, при этом скорость расщепления субстратов, содержащих C-концевые остатки лизина в 5-6 раз выше, чем соответствующих пептидов с C-концевым аргинином [57]. КПN отщепляет C-концевые остатки аргинина и лизина от многих природных пептидов и белков: брадикинина (значение Km по данным разных авторов составляет от 0,4 до 19 мкМ), Met5 -энкефалин-Arg6 (Km = 49 мкМ) [69], Leu5 -энкефалин-Arg6 (Km = 57 мкМ), Met5 -энкефалина-Lys6 (Km = 216 мкМ), анафилотоксинов [49],креатинкиназы [75], a-енолазы [76], фибринопептидов .
Несмотря на многолетнюю историю изучения КПN, её биологическая роль во многом остаётся неясной. Фермент вначале был описан как карбоксипептидаза, инактивирующая брадикинин и, следовательно, способная вовлекаться в регуляцию артериального давления и тонуса кровеносных сосудов. Однако показано, что реальный вклад фермента в инактивацию брадикинина in vivo не превышает 10-12%. Вместе с тем, некоторые авторы предполагают, что КПN может играть роль модулятора действия брадикинина [55, 69].
Активность КПN изменяется при воспалении, при некоторых видах астмы, послеоперационных осложнениях. Поскольку фермент расщепляет пептиды, участвующие в развитии воспалительных реакций (брадикинин и анафилотоксины), и его активность в крови снижается при введении рекомбинантного интерлейкина-1b, вероятно, что КПN вовлекается в развитие воспалительных реакций [48].
Так как активность фермента повышается в моче больных с первичным альдостеронизмом, то, возможно, что активность КПN в почках может регулироваться альдостероном. Не исключено, что фермент может играть некоторую роль в регуляции водно-солевого обмена в почках.
Поскольку очищенная КПN способна уменьшать связывание плазминогена с клетками, хотя и не уменьшает скорости полного лизиса сгустка крови, можно предположить, что она вовлекается в процессы коагуляции крови. Однако, её реальный вклад в этот процесс in vivo пока не ясен.
Таким образом, несмотря на предположения, что КПN возможно вовлекается в регуляцию артериального давления, тонуса кровеносных сосудов, развитие воспалительных реакций, процессы свёртывания крови, её биологические функции не совсем ясны. Представляется возможным, что она вносит вклад в расщепление многих эндогенных субстратов и регуляцию многих физиологических процессов, однако в подавляющем большинстве случаев она не является единственным ферментом, участвующем в том или ином процессе. Вместе с тем, разнообразные функции вызывают интерес к изучению фермента при самых различных состояниях организма, в том числе связанных с нарушениями гемостаза [10].
В связи с этим представляет интерес изучения активности КПN в сыворотке крови онкологических больных в раннем послеоперационном периоде.
гемостаз онкологический больной карбоксипептидаза
1.2.4 Изменения в пептидергической системе онкологических больных
Интерес к изучению протеолитических ферментов при злокачественных новообразованиях обусловлен
8-09-2015, 23:30