Приведенные литературные данные дают основание сделать вывод о тесной взаимосвязи процессов метаболизма, трансмембранного транспорта, изменений формы и механических свойств эритроцита, что, по-видимому, позволяет организму осуществлять координированную регуляцию функционирования клетки через соответствующие рецепторные структуры, имеющиеся на наружной поверхности мембраны. [9]
Таким образом, в поддержании структурной целостности эритроцитов важное значение имеют внутренние примембранные белковые слои, структура и взаимодействие которых с эритроцитарными мембранами взаимно обусловлены и в целом представляют собой единую структурную организацию. Поэтому всякая модификация как самой мембраны, так и содержащегося в них гемоглобина в конечном счете сопровождается и модификацией этой особой организации, частным примером проявления которой может быть изменение ее механических свойств. [13] Приведенные данные побудили нас провести исследование с целью оценки количественного содержания мембрансвязанного гемоглобина эритроцитов человека и его связи со структурными белками.
материал и методы исследования
Материал исследования
Материалом настоящего исследования послужили эритроциты 124 практически здоровых лиц, проживающих в городе Курске, в возрасте от 18 до 47 лет. Набор добровольцев проводился при исключении любой соматопатологии.
У обследуемых проводился забор крови из локтевой вены в сухую стерильную посуду в количестве 5-7 мл с целью получения образов эритроцитарных мембран.
Методы исследования
Для достижения поставленной цели и решения задач настоящей работы использовался комплекс методов.
Биохимические методы.
Реактивы и биоматериалы . В работе использовались: декстран Т-500 фирмы "SIGMA" (США), HBS – целлюлоза фирмы "SIGMA" (США), гидрофосфат натрия, хлористый натрий, мочевина фирмы "Bio-Rad" (США), трис, 2 – меркаптоэтанол, персульфат аммония "Reanal" (Венгрия), додецилсульфат натрия (ДДС) фирмы "Диа-Фарм" (Россия), акриламид "SIGMA" (США), N,N¢ - метилен бисакриламид "FLUKA" (Швейцария), кумасси G – 250 фирмы "Serva" (ФРГ), бромфеноловый синий, ТЕМЕД, глицин, набор белков для определения молекулярного веса MS-2 (Россия).
Реактивы отечественного производства были марки "ХЧ" и "ОСЧ".
Получение эритроцитов . Эритроциты получали из 5 мл гепаринизированной крови по методу Бейтлера с незначительной модификацией. [14] Сначала гепаринизированную кровь отстаивали дважды в растворе PBS, содержащем 3% декстран Т –500, в течение 30 минут. Затем эритроцитарную массу подвергали дополнительной очистке, пропуская ее через колонку с HBS-целлюлозой, после чего эритроциты ценрифугировали при 3000 оборотах в минуту. Далее из полученной очищенной массы эритроцитов проводили выделение мембран.
Выделение мембран . Для получения препаратов мембран эритроциты разрушали осмотическим шоком по методу Dodge с небольшой модификацией, заключавшейся в том, что гемолиз эритроцитов и отмывку "теней" проводили двукратно в 10 мМ Na – фосфатном буфере с добавлением ингибитора протеназ PMSF. После этого мембраны эритроцитов лиофилизировали и хранили при -20°С.
Одномерный электрофорез по Лэммли . Электрофорез в присутствии ДДС проводили модифицированным методом методом Лэммли. [14] Для этой цели использовали следующие растворы:
1. 60% акриламид –0,8% метилен бисакриламид.
2. Буфер для разделяющего геля: 1 М трис – HCI (pH 8,8).
3. Буфер для концентрирующего геля: 0,5 М трис – HCI (pH 6,8).
4. 10% додецилсульфат натрия.
5. 10% персульфат аммония.
6. ТЕМЕД.
7. Электродный буфер для ЭФ: 0,025М трис, 0,193М глицин, 0,1% додецилсульфат натрия.
Растворы хранились при +4°С две-три недели. Раствор 5 готовился перед использованием.
Электрофорез проводили в пластинах ПААГ размером 180х180х1мм, приготовленных с линейным градиентом концентрации акриламида 5 - 25%.
Для приготовления одной пластины ПААГ брали: 0,85 мл раствора 1, 5,5 мл дистиллированной воды, 3,6 мл раствора 2, 101 мкл раствора 4, 5 мкл раствора 6 и 20 мкл раствора 5 (легкий раствор, 5%). В тяжелом (25%) растворе в отличие от легкого бралось 4,2 мл раствора 1 и 2,6 мл дистиллированной воды. Через смеситель эти растворы подавались перистальтическим насосом в формирователь пластины, в течение 10 минут заполняя пластину на 4 см ниже верхнего края. Сверху на полимеризующуюся смесь наслаивалось 0,5 мл дистиллированной воды. Так формировался разделяющий гель. Полимеризация продолжалась в течение 30-40 минут. После полимеризации воду удаляли и заливали раствор, формирующий концентрирующий гель. Для приготовления такого раствора брали 660 мкл раствора 1, 100 мкл раствора 4, 2,5 мл раствора 3, 4 мкл раствора 6, 70 мкл раствора 5 и 6 мл дистиллированной воды. Вставляли формирователь лунок и наслаивали 0,3 мл дистиллированной воды. Полимеризация продолжалась в течение 20 минут, после чего пластины ПААГ могли храниться при =4°С в течение двух суток.
Подготовка проб Для приготовления анализируемого образца для ЭФ брали 1 мг лиофилизированных мембран эритроцитов и растворяли в 40 мкл уравновешивающего буфера, в состав которого входили:
(на 10 мл уравновешивающего буфера)
1. 3 г мочевины;
2. 0,2 г ДДС;
3. 1,25 мл раствора 3;
4. 0,5 мл меркаптоэтанола;
5. 5 мкл красителя бромфенолового синего.
Уравновешивающий буфер хранили при температуре -20°С в течение месяца.
Подготовленные таким образом анализируемые образцы стояли в течение одного часа при комнатной температуре, после чего их вносили объемом 15 мкл в сформированные в концентрирующем геле лунки.
Электрофорез проводили при силе тока 35 мА, пока напряжение не возрастало до 300 В, затем стабилизировали источник питания по данному напряжению и проводили ЭФ этом режиме, пока лидирующий краситель не доходил 1 см до края пластины.
После ЭФ фореграммы окрашивали в течение одного часа красителем Кумасси G - 255 по модифицированной методике Fairbanks в растворе, содержащем 10% уксусной кислоты, 25% изопропанола, 0,05% кумасси голубого. После этого несвязавшуюся краску отмывали в течение 12 часов 10%-ной уксусной кислотой до полного исчезновения фонового окрашивания.
Отмытые фореграммы затем дегидратировали в течение 30 минут в растворе, содержащем 280 мл изопропанола, 25 мл глицерина и 195 мл дистиллированной воды. Далее пластины ПААГ плотно фиксировали между двумя слоями целлюлозной бумаги и в натянутом виде высушивали при комнатной температуре.
На электрофореграммах идентифицировали 17 белковых фракций.
Денситометрирование. Денситометрирование электрофореграмм проводили на лазерном денситометре «UltrascanXL». Молекулярную массу белков определяли с помощью маркерных белков с известной молекулярной массой: бычий сывороточный альбумин (Mr=68 kD), овальбумин (Mr=43 kD), химотрипсиноген (Мr=25 kD), миоглобин (Мr=17,5 kD) и цитохром (Мr=12,4 kD).
Определение концентрации белка. Содержание белковых фракций в исследуемом образце определяли по известной массе маркерного белка бычьего сывороточного альбумина, через полученные при деситометрировании площади альбумина и каждой белковой фракции в отдельности по формуле:
m(x)=S(x)´4.5/S(a),
где m(x) – масса белковой фракции,
S(x) – площадь этой фракции под пиком на денситограмме
4.5 – масса маркерного белка альбумина в мкг,
S(a) – площадь маркерного белка альбумина под пиком на денситограмме.
Дальнейший пересчет количественного содержания белковых фракций проводили на 1 миллиграмм общего белка.
Методы статистической обработки
Статистическая обработка материала проведена на ПВМ IBMPC/AT (486) с использованием программы "Gen 1", составленной д.б.н Трубниковым В.И. и пакета прикладных программ "STATGRAPHICSv3.0".
При описании количественных признаков использовались параметры нормального распределения: среднее значение, стандартная ошибка среднего значения, несмещенная дисперсия. Для проверки статистических гипотез использовались параметрические критерии Стьюдента и Фишера. Уровень значимости принимали равный 0,05.
Кластерный анализ . При проведении кластерного анализа в качестве объектов выступали индивиды и изучаемые признаки, а мерой сходства служили коэффициенты корреляции без учета знака. Результаты кластерного анализа позволили определить соответственно некоррелированные группы изучаемых параметров, детерминирующих фенотипическую изменчивость признаков. На каждом шаге кластеризации выбирался наибольший по значению элемент матрицы, стоящий на пересечении i-й строки и j-го столбца объединения i-го и j-го признаков в кластер, рассматриваемый как новый признак. Для выделения кластера пересчитывались значения коэффициентов корреляции в матрице с тем, чтобы на следующем шаге кластеризации поиск максимального коэффициента корреляции проводился с учетом предыдущих результатов. Приведенный алгоритм кластерного анализа служил лишь для подразделения корреляционной матрицы на отдельные подсистемы без проверки статистической значимости уровней объединения кластеров. Проверка гипотезы о некоррелированности выделенных подсистем осуществлялась с использованием специальных критериев.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Количественное содержание гемоглобина и основных белков мембран эритроцитов человека.
В ходе данной работы нами было проведено изучение количественного содержания основных белков эритроцитарных мембран и мембрансвязанного гемоглобина. Полученные результаты представлены в таблице 1.
В зависимости от электрофоретической подвижности белки были разделены на 15 фракций, 16-ю составил гемоглобин. При электрофорезе белковые фракции расположились по мере уменьшения молекулярных масс белков. Из таблицы 1 видно, что наиболее представительными белками в мембранах эритроцитов человека являются анионтранспортный белок полосы 3, a- и b-спектрины и актин. Второе место по количественному содержанию заняли белки полосы 4.5 (транспортер глюкозы и нуклеозидов), белки полосы 7 (основным белком этой полосы является тропомиозин) и белок полосы 4.2 (паллидин).
Менее представительными оказались анкирины 2.1, 2.2, и 2.3, белок полосы 4.1, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и глутатион-S-трансфераза. Наименьшим содержанием отличался белок полосы 4.9 и мембрансвязанный гемоглобин. Количественное содержание гемоглобина составило 17,40±0,74 мкг на 1 мг общего белка мембран. Кроме того, гемоглобину соответствовало и наименьшее значение дисперсии (d2 = 66,91).
Проведенное исследование количественного содержания основных белков мембран эритроцитов позволило оценить их представительность. Полученные нами показатели согласуются с литературными данными. [4, 5]
Взаимное варьирование количественной представительности отдельных белков эритроцитов человека.
С целью установления особенностей взаимного варьирования содержания белковых фракций в анализируемых образцах нами был проведен многомерный количественного содержания белков эритроцитарных мембран человека. Была построена матрица фенотипических корреляций количественного содержания гемоглобина и основных белков мембран эритроцитов. Данная матрица представлена в таблице 2. Из нее видно, что полученные коэффициенты корреляции имели как положительную, так и отрицательную направленность.
Для установления приоритетности во взаимосвязях вариабельности количественного содержания гемоглобина и основных мембранных белков эритроцитов нами был проведен кластерный анализ. Полученные результаты представлены на рисунке 6.
Кластерный анализ корреляционной матрицы позволил выделить 4 группы взаимнокоррелирующих белков по их количественному содержанию. Первую группу составили a- и b-спектрины, белки полосы 4.1, 4.2 (r=0,255). В состав второй группы вошли анкирины 2.1, 2.2 и 2.3 (r=0,278). Третью группу образовали гемоглобин, тропомиозин, глютатион-S-трансфераза и белок полосы 4.5.1 (r=0,316). Четвертую группу составили актин, белки полосы 4.5, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и анионтранспортный белок полосы 3 (r=0,209). Исключение составила фракция 4.9, вариабельность количественного содержания которой носила независимый характер.
Низкий уровень объединения наблюдался между количественным содержанием анкирином 2.3 и анкирином 2.1 и 2.2 (r=0,278), актином и белком полосы 4.5 (r=0,327).
Рисунок 6
Дендрограмма фенотипических корреляций количественного содержания гемоглобина и основных белков мембран эритроцитов человека
N = 124 R (5%) = 0,176
Группу кластеров со средним уровнем объединения составили анкирины 2.1 и 2.2 (r=0,434), глутатион-S-трансфераза и белок полосы 4.5.1 (r=0,409), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и белок полосы 3 (r=0,370).
Высокий уровень объединения имел место между количественным содержанием a- и b-спектринов (r=0,506)
Самый высокий уровень объединения (r=0,595) соответствовал количественному содержанию гемоглобина и белков полосы 7, основным составляющим белком которой является тропомиозин.
Обсуждение
На основе полученных данных установлено, что наиболее представительными белками в мембранах эритроцитов человека являются анионтранспортный белок полосы 3, a- и b-спектрины, а также актин. Наименьшее количественное содержание соответствует мембрансвязанному гемоглобину. Несмотря на то, что он содержится в мембране эритроцитов человека в меньшем количестве, гемоглобин играет важную роль как в образовании и поддержании стабильности цитоскелета, так и в механизмах ферментативного катализа и внутриклеточной трансформации энергии.
Полученные данные позволили предположить, что в эритроцитарных мембранах рассматриваемые белки во взаимном варьировании их количественного содержания образуют 4 группы взаимнокоррелирующих систем. Причем каждая из этих групп по отношению к остальным характеризуется относительной независимостью.
Согласно результатам нашего исследования количественное содержание гемоглобина наиболее тесно связано с содержанием тропомиозина. О причинах этого пока судить трудно вследствие недостаточного количества данных, касающихся этого вопроса - в доступной нам литературе он не получил должного освещения. Но мы надеемся, что полученные данные послужат основой для дальнейшей детализации в изучении связи гемоглобина со структурными белками.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о сложной структурной и функциональной взаимосвязи белков в мембранах эритроцитов.
заключение
Цитоплазматические мембраны эритоцитов человека играют ключевую роль в обеспечении и регуляции физиологической активности этих клеток. Специфические функции мембран обеспечивает сложная структурная организация, главным компонентом которой являются белки.
Современные биохимические и биофизические методы позволили выделить практически все основные мембранные белки эритроцитов, изучить их биохимическую структуру и основные аспекты функционирования. Вместе с тем в научной литературе не получил должного освещения вопрос о структуре мембрансвязанного гемоглобина, о его связи со структурными белками. Нами была проведена оценка количественного содержания гемоглобина и основных белков мембран эритроцитов человека, так как нормальное функционирование мембраны определяется не только присутствием белковых компонент, но и их количественным содержанием.
Кроме того был предпринят анализ взаимоварьирования количественного содержания гемоглобина и структурных белков. В ходе исследования нами был установлен факт взаимозависимости количественного содержания гемоглобина и тропомиозина. Результаты данного исследования могут служить основой для дальнейшей детализации в изучении связи гемоглобина со структурными белками. Нами планируется провести ряд исследований с целью изучения количественного содержания гемоглобина и его взаимосвязи со структурными белками мембран эритроцитов не только в норме, но и при различных патологических состояниях. С тем, чтобы прогнозировать наряду с уровнем данных нарушений их связь между собой и влияние на них изменений окружающей среды.
выводы
1. Количественное содержание гемоглобина в мембранах эритроцитов составляет 17,40±0,74 мкг на 1 мг общего белка мембран и является наименьшим, по сравнению с количественным содержанием остальных мембранных белков.
2. Вариабельность количественного содержания гемоглобина характеризуется достаточно высокой сопряженностью с количе37ственным содержанием белка полосы 7 – тропомиозина.
Литература
1. Балашов В.И., Резаев А.А., Ярыга В.В. Содержание гемоглобина и его дериватов в крови детей, проживающих в населенных пунктах санитарно-защитной зоны астраханского газового комплекса// Педиатрия. – 1995. - №2. – С.75-77.
2. Блюменфельд Л.А. Гемоглобин// Соросовский образовательный журнал. – 1998. - №4. – С.33-38.
3. Гааль Э., Медьеши Г., Верецки Л. Электрофорез в разделении биохимических макромолекул. – М. – 1982. – 446с.
4. Гончаренко М.С., Андрух Г.А., Рязанцев В.В. Белковый спектр эритроцитарных мембран в норме и при псориазе// Вестник дерматологии и венерологии. – 1989. - №3. – С.4-7.
5. Гончарова Е.И., Пинаев Г.П. Белки цитоскелета эритроцитов// Цитология. – 1988. – т.30, №1. – С.5-18.
6. Громов П.С., Захаров С.Ф., Шишин С.С., Ильинский Р.В. Двумерная карта мембранных белков эритроцитов человека// Биохимия. – 1988. – т.53, вып.8. – С.1316-1326.
7. Громов П.С., Шандала А.М., Ковалев Л.И., Шишкин С.С. Изучение белков мембран эритроцитов человека методом двумерного электрофореза// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1986. - №7. – С.28-30.
8. Казеннов А.М., Маслова М.Н. Влияние мембранного скелета безъядерных эритроцитов на свойства транспортных АТФаз// Цитология. – 1991. – т.33, №11. – С.32-41.
9. Казеннов А.М., Маслова М.Н. Структурно-биохимические свойства мембраны безъядерных эритроцитов// Физиологический журнал СССР им. И.М.Сеченова. – 1987. – т.73, №12. – С.1587-1594.
10. Казеннов А.М., Маслова М.Н., Шагабодов А.Д. Роль белков мембранного скелета безъядерных эритроцитов в функционировании мембранных ферментов// Докл. АН СССР – 1990. – т.312. - №1. – С.223-226.
11. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учебное пособие для биол. спец. Вузов – 4-е изд., перераб. и доп. – М.: Высш.шк., 1990. – 352с.
12. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. – М.: Наука, 1981. – 288с.
13. Петренко Ю.М., Владимиров Ю.А. Роль поверхностных зарядов в поддержании осмотической резистентности эритроцитов// Гематология и трансфузиология. – 1987. - №10. – С.15-18.
14. Солодилова М.А. Роль генетических и средовых факторов в детерминации количественного содержания основных белков мембран эритроцитов человека/ Дис. на соискание ученой степени к.б.н. – М., 1999. – 160с.
15. Шандала А.М., Захаров С.Ф., Громов П.С., Шишкин С.С. Белковый состав мембран эритроцитов человека, фракционных в ступенчатом градиенте декстрана// Гематология и трансфузиология. –
8-09-2015, 21:32