Для очистки всю порцию госсипола растворяют в 25 мл эфира и добавляют петролейный эфир до помутнения раствора. Раствор оставляют на кристаллизацию. Кристаллический госсипол - канареечно-желтый порошок, хранят в пробирке из темного стекла. Получают чистого госсипола 1-1.2 г, имеющего т. пл. 180-181°C.
5. 4. ПОЛУЧЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО АЛЬФА-ИНТЕРФЕРОНА
Способность лейкоцитов человека продуцировать интерферон была показана вскоре после открытия системы интерферона Айзексом /Франция/.
Методика заключается в следующем.
Из периферической крови доноров выделяют лейкоцитарную массу и подвергают культивированию в суспензии. Используют среду №1, в которую добавляют 0,0015 ед/мл инсулина и 100-200 ед/мл нативного интерферона. К лейкоцитам в концентрации (5-10)*106 клеток/мл в качестве индуктора добавляют вирус болезни Ньюкасла с инфекционным титром не ниже 108 /мл ТЦД50 в культуре куриных фиброластов. Продуцированный интерферон отделяют от культуральной среды путем центрифугирования.
ПОЛУЧЕНИЕ БЕТА -ИНТЕРФЕРОНА
Еще в 60-е годы было показано, что интерферон, провоцируемый клетками амниона человека, а также кожно-мышечными фибробластами, по своим свойствам отличается от лекоцитарного интерферона. В настоящее время для получения бета-интерферона используют диплоидные клетки человека. Супериндукцию осуществляют различными воздействиями - дихлоро-1-бета-D-рибафуранозилбенэимидазолом, хлороквином, нейтральным красным, УФ~радиацией и др.
ПОЛУЧЕНИЕ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА
Гамма-интерферон является продуктом Т-лимфоцитов человека. За последнее десятилетие благодаря усиленному изучению иммунного ответа и свойств иммуннокомпетентных клеток значительно расширились представления о функциях Т-лифоцитов, а также о продуктах, выделяемых Т-лимфоцитами - лимфокинах, обладающих свойствами биорегуляторов.
Гамма-интерферон, или иммунный интерферон, также является одним из активных регуляторов иммунного ответа, так как обладает супрессорной активностью в отношении продукции антител, вызывает активацию естественных киллеров.
Гамма -интерферон продуцируют активированные Т-лимфоциты.
Для получения больших количеств гамма-интерферона из периферической крови выделяют Т-лимфоциты и обрабатывают митогеном или антилимфоцитарной сывороткой. Например, к культуре с концентрацией лимфоцитов (I-2)*105 в 1 мл прибавляют стафилококковый энтеротоксин в концентрации 0,02 мкг/мл.
Культуры инкубируют в среде с человеческим альбумином. Интерферон выделяют из культуральной среды. Возможно повторное стимулирование культуры и повторное продуцирование интерферона.
ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ЛЕЙКОЦИТАРНЫЙ ИНТЕРФЕРОН
Характеристика готового продукта,
Человеческий лейкоцитарный интерферон является видоспецифическим гликопротеидом, синтезируемым донорскими лейкоцитами в ответ на воздействие интерфероногена.
Специфичность препарата определяется следующими признаками:
А) противовирусной активностью . В разведении, соответствующем титру активности, препарат должен защищать культуру человеческих клеток от цитопатического действия индикаторного вируса, взятого в дозе 100 ТЦД50
Б) устойчивостью активности к действию нуклеаз-РНК-азы и ДНК-азы;
В) чувствительностью активности к действию трипсина - при концентрации фермента 300 мкг/мл в течение Iчаса при 37°С препарат полностью инактивируется;
Г) чувствительностью активности к действию специфической антисыворотки - антиинтерфероновая сыворотка в разведении, соответствующем титру должна снижать защитное действие интерферона, взятого я количестве 10 ед, в реакции нейтрализации.
Основные требования к препарату.
Препарат должен быть вирусологически стерильным, нетоксичным и безвредным.
В разведении, соответствующем титру активности, препарат должен защищать культуру человеческих клеток от цитопатического действия индикаторного вируса.
Сухой препарат - пористый порошок серовато-коричневого цвета, легко растворимый в 2 мл дистиллированной воды. Остаточная влажность не должна превышать 2%,
Раствор препарата должен иметь различные оттенки красного цвета и желтоватый оттенок.
ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА
Кровь заготавливают на станциях переливания крови в соответствии с действующими инструкциями, в стерильные многокамерные мешки или флаконы, заполненные консервирующим раствором.
Пластикатные мешки центрифугируют 4 мин при 4°С и из них выжимают последовательно - плазму, а затем 40 мл верхнего слоя с поверхности клеточной фракции (эритромасса) или 40 мл верхнего слоя клеточной фракции (лейкомасса), которые используют в дальнейшем в качестве источника лейкоцитов для биосинтеза препарата.
Образец крови, плазмы, эритромассы или лейкомассы от каждого донора, должен контролироваться на отсутствие инфицирования сифилисом, гепатитом, СПИДом в соответствии с действующими инструкциями. При отрицательных результатах контроля эритромасса и лейкомасса могут использоваться для производства интерферона не позднее, чем спустя сутки после забора кровиот донора. Хранение их допускается при температуре не выше 4°С.
Плазма или сыворотка донорской крови входят в состав культуральной смеси на всех стациях биосинтеза интерферона.
Культивирование и контроль проиизводственных штаммов вирусов, получение культур куриных и человеческих фибробластов.
В производстве интерферона в качестве интерфероногена используется вакцинный штамм "Н" вируса болезни Ньюкасла. Это представитель группы парамиксовирусов, для которых характерна сферическая форма вирусов, и спиральная структура нуклеокапсида. Вирус легко репродуцируется в куриных эмбрионах и культуре куриных фибробластов, оказывая цитоплазтическое действие. Вирус неопасен для человека, однако может вызвать воспалительные явления при случайном попадании массивной дозы в глаз.
Индикаторным вирусом служит штамм "Индиана" вируса везикулярного стоматита.
Это представитель группы рабдовирусов, также имеющих спиральную структуру нуклеокапсул, но инфекционный вирион по форме напоминает пулю. Вирус хорошо репродуцируется в куриных эмбрионах, а также в культурах куриных и человеческих фибробластов, оказывая цитопатическое действие.
Необходимо соблюдать осторожность при работе с этим вирусом.
Методы культивирования вирусов
Вирус болезни Ньюкасла культивируют в 9-10-дневных куриных эмбрионах. Эмбрионы просматривают через овоскоп, павшие отбраковываются, а у жизнеспособных карандашом обводятся границы воздушной полости.
При исходном титре вируса 108 -109 ТЦД50 /мл заражающая доза составляет 0,2 мл разведения 10-4 . Эта доза вводится в эмбрион шприцем через воздушную полость с соблюдением условий стерильности. Место прокола в скорлупе заливается парафином и эмбрионы инкубируются 2-е суток при 37°С.
После инкубации эмбрионы охлаждают при 4°С в течение 3-4 часов, затем в строго стерильных условиях вскрывают со стороны воздушной полости и визуально оценивают их жизнеспособность. Павшие - отбраковывают, а из остальных пастеровской пипеткой (с помощью вакуума или груши) отсасывают алантоисную жидкость, которая и служит в дальнейшем источником вируса.
Вируссодержащую аллантоисную жидкость контролируют на бактериологическую стерильность. Определяют инфекционный титр в культуре куриных фибробластов и титр гемагглютининов.
Контроль на стерильность. осуществляют высевом I мл аллантоисной жидкости из каждого флакона на питательные cpeды - сахарный бульон и среду Сабуро. Посевы инкубируют в течение 7 суток, на сахарном бульоне при 37°С, а на среде Сабуро - при комнатной температуре.
Инфекционный титр определяют в культуре фибробластов. В 3-х суточную культуру со сформировавшимся монослоем клеток вводятся различные разведения (от 10-7 до 10-10 ) алантоисной жидкости. Культуры инкубируют 3-е суток при 37°С и затем просматривают под микроскопом.
Максимальные разведения, оказывающие в культуре цитопатическое действие, принимаются за ТЦД вируса (титр цитопатического действия).
_Титр гемагглютининов определяется стандартным методом постановки реакции гемагллютинации с использованием куриных эритроцитов (0,5%).
Титр гемагглютининов не является ведущей характеристикой вирусов и постановка реакции гемагглютинации не является обязательной для каждой партии вируса.
В производстве допускается использование только бактериологически стерильного вируса с инфекционным титром 10-8 -10-9 /1 мл ТЦЦ50 и титром гемагглютининов 250 - 1000.
Вирус болезни Ньюкасла представляет большую ценность для производства, поэтому должны быть приняты меры к тому, чтобы сохранить его чистоту и интерфероногенные свойства. Категорически запрещается непрерывное использование пассирование вируса: в качестве исходного материала при заражении используют лучшую партию вируса, которую после контроля разливают по I мл в ампулы и лиофилизируют.
После лиофилизации эта партия в дальнейшем считается рабочим стандартом вируса.
Рабочий стандарт вируса контролируют описанными методами на бактериологическую стерильность, инфекционный титр и титр гемагглютининов. Затем в обязательном порядке вирус идентифицируют.
Идентификацию вируса болезни Ньюкасла проводят постановкой стандартной реакции торможения гемагглютинации с антисывороткой. Антисыворотка в разведении, соответствующем титру, но не ниже, чем 1:1000, должна полностью подавлять агглютинацию куриных эритроцитов /0,5%/ при дозе вируса, равной 4АЕ.
Получение первично-трипсинизированных, культур кожно-мншечной ткани куриных и человеческих эмбрионов.
Культуры кожно-мьшечной ткани куриных и человеческих эмбрионовшироко используют в производстве интерферона для контроля вирусов, а также для определения отсутствия токсичности и противовирусной активности препарата. Успешная работа производства в значительной степени зависит от уровня ведения культур клеток.
Для получения культур клеток применяют стандартные методы, основанные на дезинтеграции ткани эмбриона трипсином. При выращивании культур следует обратить самое серьезное внимание на качество сред, сыворотки, вспомогательных растворов и чистоту посуды.
Получение культуры куриных фибробластов
Источником ткани являются 9-10-дневные куриные эмбрионы с соблюдением условий строгой стерильности эмбрион извлекают из скорлупы на стерильную чашку Петри. Отбирается кожно-мышечная ткань, переносится в колбу Эрленмейера и промывается раствором Хенкса с антибиотиками (50 ед/мл пенициллина + 100 ед/мл стрептомицина или 20 ед/мл мономицииа). Промывные воды сливают и ткань измельчают, размеры кусочков 1-5 мм. Затем ткань заливают подогретым до 37°С раствором трипсина (0,2%), разведенным раствором Хенкса (1:1). Колбу с тканью помещают на магнитную мешалку, включают вращение. Через 5 мин. вращение прекращают и после оседания кусочков ткани надосадочную жидкость сливают с соблюдением условий строгой стерильности. В колбу вновь заливают подогретую до 37°С смесь растворов трипсина и Хенкса. Суспензию перемешивают 5-7 мин. Затем вращение останавливают и после оседания крупных кусочков ткани надосадочную жидкость переливают в стерильные центрифужные стаканы с пробкой. Суспензий центрифугируют при 1250 об/мин, в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок клеток суспендируют в культуральной жидкости следующего состава: среда №199 - 30%, гидролизат лактальбумина - 50%, нормальная бычья сыворотка - 20% и антибиотики.
Такую операцию трипсинизации повторяют 4-6 раз, но клетки собирают в один флакон с культуральной жидкостью.
После окончания сбора суспензию тщательно перемешивают и клетки подсчитывают в счетной камере Горяева. Суспензию разводят культуральной жидкостью до такой степени, чтобы в I мл содержалось 650 000 –750 000 клеток. Затем суспензию разливают в стерильные пробирки по I мл и инкубируют при 37°С в течение 2-3 суток, до образования монослоя клеток.
Технологический процесс изготовления лейкоцитарного интерферона подразделяют на 7 стадий и 12 операций,
Стадия 1- Выделение лейкоцитов.
Биосинтез интерферона проводят с использованием лейкоцитов, освобожденных от примеси эритроцитов. В тех случаях, когда примесь эритроцитов превышает 100 клеток на I лейкоцит, например, в эритромассе для их отделения необходимо применить фракционирование с последующим гемолизом лейкоцитсодержащей фракций. Если содержание эритроцитов меньше 100 клеток на I лейкоцит, ограничиваются только гемолизом.
Операция.1. Фракционирование.
В стерильные стеклянные колбы - отстойники грушевидной формы с герметично закрывающимися верхним и нижним отводами, емкостью не ниже 5 л заливают 2 л стабилизирующего раствора следующего состава: апирогенная дистиллированная вода - I л, глюкоза фармацевтическая - 20 г, аскорбиновая кислота - 0,25 г, хлористый кальций - 5 г, цитрат натрия трехзамещенный - 15 г. Стабилизирующий раствор при 20°С должен иметь плотность 1,05 г/мл. Раствор стерилизуется автоклавированием или фильтрацией и может храниться продолжительное время при температуре 4°С. Однако, концентрированный раствор цитрата натрия целесообразно автоклавировать отдельно и вводить непосредственно в отстойник.
В отстойник со стабилизирующим раствором вводят равный (2л) объем клеточной фракции. Суспензию тщательно перемешивают и добавляют раствор осадителя эритроцитов в количестве 1/10 от суммарного объема суспензии (около 400 мл).
В качестве осадителей используют декстран фармацевтический с молекулярной массой не ниже 80 000 Дальтон (исходный раствор 100г/л), поливиниловый спирт фармацевтический (исходный раствор 50 г/л или смесь 1:1 по объему). Растворы осадителей стерилизуют автоклавированием или фильтрацией и могут храниться продолжительное время при температуре +4°С,
Под действие осадителей происходит агрегация эритроцитов, что ускоряет их выпадение из суспензии, В результате происходит расслоение суспензии на 2 фракции - темно-окрашенную нижнюю (фракция эритроцитов) и светлую верхнюю (фракция лейкоцитов). Через нижний отвод отстойника фракцию эритроцитов сливают. Затем сливают и фракцию лейкоцитов. Клетки отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок клеток ресуспедируют в питательной среде с конечной концентрацией 0,5% этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА).
Операция 2. Гемолиз остаточных эритроцитов.
Для гемолиза используют 0,83%-ный раствор хлористого аммония в апирогенной дистиллированной воде, охлажденной до 4°С. Раствор стерилизируют автоклавированием. Клеточную суспензию заливают не менее чем 10 объемами гемолитика, выдерживают в течение 10 мин при 4°С, в затем клетки отделяют центрифугированием (600*Д, 10 мин, 4°С).
Надосадочную жидкость сливают и не используют на последующих стадиях. Осадок клеток суспендируют в питательной среде 199 или минимальной "игла", содержащей 3 ед/мл гепарина, 5% донорской плазмы или сыворотки, 0,1 трилона Б и 5 ед/мл мономицина, среда № I.
Операция 3. Подсчет жизнеспособных лейкоцитов.
Для определения количества жизнеспособных клеток используют 1%-ный водный раствор эозината натрия. Эозинатом, окрашиваются в красный цвет только погибшие клетки.
Отбирают 0,5 мл тщательно перемененной суспензии и объединяют ее с 0,5 мл раствора эозината. Выдерживают смесь 30 сек при комнатной температуре и разводят физраствором в 100 раз. Разведение вводят в счетную камеру Горяева и считают количество окрашенных и неокрашенных клеток под микроскопом с увеличением 100 во всей камере, количество жизнеспособных клеток (X) определяют по формуле:
X = А х 200 х 1100, где
А - количество неокрашенных клеток в камере.
Количество нежизнеспособных (окрашенных клеток) не должно превышать 3% от общего числа клеток в суспензии.
Стадия 2. Стимуляция интерфероногенеза - прайминг.
На этой стадии преследуют 2 основных цели; активизировать метаболизм лейкоцита (для этого в культуральную среду вводят нативную плазму и инсулин) и стимулировать интерфероногенез действием интерферона. При правильной постановке прайминг обеспечивает повышение выхода активности не менее, чем в 4 раза.
Операция 4. Составление культуральной среды.
Лейкоциты, освобожденные от примеси эритроцитов, суспендируют из расчета 10-20 млн клеток в I мл среды №1, в которую добавлены 0,0015 ед/мл инсулина и 100-200 ед/мл нативного интерферона. Суспензию переливают в плоскодонные колбы емкостью 5 л, заполняя только половину объема. В колбу помещают стержень из мягкого железа с некоррозирующим покрытием, который предварительно стерилизуют автоклавированием или прожиганием в пламени горелки.
Операция 5. Суспензионное культивирование.
Колбы с клеточной взвесью перекрывают стерильной алюминиевой фольгой и помещают в водяную баню из магнитно-проводящего материала (пластика любого типа или оргстекла), подключенную к ультратермостату. Ультратермостат должен обеспечивать устойчивое поддержания температуры в клеточной взвеси в пределах 37,5°С. Под баней помешают магнитные мешалки, вращение которых передается стержню в культуральной колбе. При скорости вращения 100 об/мин лейкоциты не травмируются, но устойчиво поддерживаются в суспензии.
Клетки инкубируют неменее 2-х часов (биологическое время). Если возникает необходимость, продолжительность прайминга можноувеличить до 12- часов. Однако в этом случат в культуральную среду необходимодобавить 0,005 М сукцината натрия.
Стадия 3. Индукция интерферона.
Для индукции используют бактериологический стерильный вирус болезни Ньюкасла с инфекционным титром не ниже 108 /мл ТЦД50 в культуре куриных фибробластов. Вирус предварительно подогревают по 37,5°С.
Операция 6. Введение вируса-интерфероногена.
Культуральные колбы вскрывают под пламенем горелки и вирусосодержащую аллантоисную жидкость переливают в суспензию из расчета 10-100 ТЦД50 на I лейкоцит. Так, при содержании лейкоцитов 25 млрд. добавляют 250 млн вируса с интерфероногеным титром 109 ТЦД50 . Колбу перекрывают алюминиевой фольгой с соблюдением условий стерильности и инкубируют в течение I часа при 37,5°С.
Стадия 4. Отделение индуцированных лейкоцитов.
На стадии индукции завершают подготовительные этапы интерфероногенеза.
Для улучшения переносимости препарата, после индукции необходимо удаление культуральной жидкости неадсорбировавшихся частиц вируса-индуктора и антигенов куриной аллантоисной жидкости. Для этих целей оказалось целесообразным отделение индуцированных лейкоцитов и переведение их в среду нового состава.
Операция 7. Отделение индуцированных лейкоцитов.
Суспензию индуцированных лейкоцитов центрифугируют при 600хД 15 мин 4°С, или сепарируют в условиях стерильности. Надосадочную жидкость отбирают в отдельную емкость для обеззараживания, а осадок клеток суспендируют в питательной среде следующего состава: среда № 199 или минимальная "Игла", 3 ед/мг гепарина, 5% плазмы или сыворотки донорской крови, мономицин 50 ед/мл, рН 7,2-7,4 /среда №2/.
Стадия 5. Биосинтез
Биосинтез интерферона проводят в стационарной культуре лейкоцитов. При этом происходит весьма прочное прикрепление лейкоцитов к поверхности культурного сосуда. Оказалось, что важнейшим параметром, определявшим выход активности, при стационарном культивировании является плотность посадки, то есть количество клеток на единицу поверхности. Экспериментально установлено, что оптимальным для интерфероногенеза является плотность в 5-7 млн лейкоцитов на I см поверхности. Показательно, что при такой плотности посадки лейкоциты создают пласт толщиной в 3 клетки. Хорошему прикреплению клеток способствует нанесение на внутренние поверхности культурального сосуда гидрофобного покрытия - силикона любой марки.
Для обеспечения питательной потребности культуры совершенно достаточно 0,1 л среды №2 на I млн лейкоцитов. Основой энергетического обмена для лейкоцитов является анаэробный гликолиз. Из-за дефектности ферментных систем начальных стадий цикла Кребса, окисление глюкозы в этих клетках завершается на стадии лактата и лишь небольшое количество (в пределах 3%) подвергается дальнейшему расщеплению. Поэтому, объем воздушной фазы в культуральном сосуде мало влияет на выход активности. Однако, заполнение средой культурального сосуда, более чем на половину его объема не рекомендуется.
Указанные выше рекомендации следует использовать при составлении клеточной взвеси в конкретных условиях.
Для каждого типа культурального сосуда необходимо подобрать оптимальные соотношения количества клеток и среды №2 (сохранив и газовую фазу), учитывая выходы активности и экономичность процесса биосинтеза.
Операция 8. Стационарное культивирование индуцированных лейкоцитов.
В матрицы, со строгим соблюдением стерильности, заливают рассчитанное количество среды №2 и вводят необходимое количество лейкоцитов. Перекрывают матрицы стерильными пробками, суспензию клеток тщательно перемешивают и устанавливают матрицы в соответствующе положение (норма "ребро") на стеллажи термального помещения с температурой 37°С. Культивирование продолжают 18-20 часов. Допускается роллерное культивирование лейкоцитов на стации биосинтеза при соблюдении вышеуказанных принципов.
Операция 9. Отделение отработанных лейкоцитов.
После завершения синтеза интерферон-содержащую культуральную среду подвергают центрифугированию или сепарированию с соблюдением условий стерильности для отделения отработанных клеток.
Надосадочную жидкость собирают в стерильные бутыли емкостью –10 л. Затем, для инактивации вируса - интерфероногена в каждой бутыли доводят величину
8-09-2015, 22:54