Рис 13. Влияние b-эндорфина 10-7 М на продукцию IL-4 фракцией мононуклеаров, CD4+ -лимфоцитами и CD4+ -лимфоцитами в присутствии моноцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.
Рис 14. Влияние DADLE 10-7 М на продукцию IL-4 фракцией мононуклеаров, CD4+ -лимфоцитами и CD4+ -лимфоцитами в присутствии моноцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.
налоксона, зарегистрированного в культурах без добавления митогена. Корреляционный анализ выявил отрицательную зависимость (r=-0,68; р<0,05) между интенсивностью пролиферации и уровнем IL-4 в культурах с совместным внесением b-эндорфина и налоксона в присутствии ФГА. Таким образом, b-эндорфин, налоксон и селективный агонист δ-рецепторов DADLE, усиливая пролиферацию, способствуют изменению соотношения Т-хелперов в сторону Th2-клеток.
Учитывая, что во фракции лимфоцитов находятся Т-, В-лимфоциты, NК-клетки, присутствие которых может оказывать влияние на конечный результат, дальнейшие эксперименты проводились с использованием CD4+ -клеток, основных продуцентов IL-4. Как видно из рис. 13, b-эндорфин усиливает продукцию IL-4 во фракции мононуклеаров и не влиет на уровень IL-4в культуре CD4+ -клеток. Добавление к CD4+ -лимфоцитам моноцитов приводит к восстановлению уровня продукции IL-4 под воздействием b-эндорфина. Аналогичный по силе и направленности эффект на продукцию IL-4 CD4+ -лимфоцитами оказывает селективный d-агонист DADLE(рис. 14). Анализ влияния m-агониста DAGOвыявил тенденцию
Рис 15. Влияние DAGO 10-8 М на продукцию IL-4 фракцией мононуклеаров, CD4+ -лимфоцитами и CD4+ -лимфоцитами в присутствии моноцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.
к усилению продукции IL-4 фракцией мононуклеаров (рис. 15), однако статистически достоверного эффекта достичь не удалось. Как видно из рис. 16, внесение b-эндорфина на ФГА-индуцированную продукцию IL-2 мононуклеарами, CD4+ -лимфоцитами и комбинацией CD4+ -лимфоциты+моноциты влияния не оказывает. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что от присутствия моноцитов зависит направленность влияния b-эндорфина и d-агониста DADLE на Th1/Th2-поляризацию лимфоцитов. Учитывая важное участие d-рецепторов в регуляции синтеза IL-4 была проанализирована их роль в эффекте b-эндорфина на продукцию данного цитокина. В условиях блокады d-рецепторов нивелируется усиливающее действие пептида на уровень IL-4 в нефракционированных клеточных культурах. Во фракции лимфоцитов b-эндорфин и налтриндол на продукцию IL-4 не влияют (рис. 17).
Таким образом, результаты проведённых исследований свидетельствуют о важной роли моноцитов в регуляции секреторной активности клеток адаптивного иммунитета, при этом как агонисты, так и антагонисты опиатных рецепторов оказывают самостоятельные эффекты на активность клеточных популяций.
Рис 16. Влияние b-эндорфина 10-7 М на продукцию IL-2 фракцией мононуклеаров, CD4+ -лимфоцитами и CD4+ -лимфоцитами в присутствии моноцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.
А Б
Рис. 17. Эффекты b-эндорфина на фоне блокады d-опиатных рецепторов на продукцию IL-4 в нефракционированной клеточной взвеси (А) и фракции лимфоцитов (Б) в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.
Роль b-эндорфина в регуляции фагоцитарной активности клеток естественного звена иммунитета. По нашим данным, β-эндорфин в концентрациях 10-7 и 10-8 М (46,25 ±1,57 в контроле – 51,3±1,66 - β-эндорфин 10-7 М; P<0,001 к контролю) увеличивает процент фагоцитоза и фагоцитарное число нейтрофилов (0,61±0,02 в контроле - 0,68±0,03 β-эндорфин 10-7 М; P<0,001 к контролю). Помимо нейтрофилов пептид усиливает фагоцитарную активность моноцитов в концентрациях 10-7 – 10-8 М, увеличивая процент фагоцитоза (36,9 ±2,75 в контроле – 47,7±4,8 - β-эндорфин 10-7 М; P<0,05 к контролю) и фагоцитарное число (0,44±0,03 в контроле - 0,67±0,08 β-эндорфин 10-7 М; P<0,05 к контролю). Так же b-эндорфин стимулирует общий (суммарный) фагоцитоз. На фагоцитарную активность эозинофилов β-эндорфин не влияет.
Роль b-эндорфина в регуляции цитокинпродуцирующей функции моноцитов и нейтрофилов. Как видно из табл. 5, 6, ЛПС усиливает продукцию IL-1b, TNF-a, IL-6 только в культурах с фракцией моноцитов, в то время как в культуре лейкоцитов эффект ЛПС на синтез IL-1b, TNF-a, IL-6 отсутствует. В тоже время уровень IL-8 в ответ на ЛПС усиливается в нефракционированной клеточной фракции и не изменяется в очищенной моноцитарной фракции. В нефракционированной клеточной культуре b-эндорфин (10-7 -10-11 М) активирует LPS-индуцированную продукцию IL-1b, не влияя на синтез IL-6, TNF-a и угнетая продукцию IL-8 в концентрациях 10-7 и 10-11 М. b-эндорфин в концентрациях 10-7 - 10-11 М усиливает продукцию IL-1ra, рецепторного антагониста IL-1b. Значительно менее выраженный стимулирующий эффект пептид оказывает на спонтанную продукцию IL-1b в концентрациях 10-7 и 10-9 М. На индуцированную субоптимальной дозой ФГА продукцию исследуемых цитокинов, а так же на их спонтанный и ЛПС-индуцированный синтез в очищенной фракции моноцитов b-эндорфин не влияет.
Данные, представленные на рис. 18 указывают на отсутствие отмены стимулирующего эффекта b-эндорфина на уровень IL-1b в условиях блокады опиатных рецепторов неселективным антагонистом налоксоном (d, m) и селективным d-антагонистом налтриндолом в течение 24 ч культивирования. Также обнаруживается самостоятельный стимулирующий эффект налтриндола на продукцию IL-1b. Выявленная динамика сохраняется в течение 48 ч культивирования. Действие b-эндорфина на продукцию антагониста IL-1bIL-1ra (рис. 19) имело картину, схожую с полученной нами при анализе продукции IL-1b. b-эндорфин и налтриндол
Таблица 5. Влияние b-эндорфина на продукцию IL-1b, TNF-a, IL-6 в нефракционированной лейкоцитарной суспензии
| Цитокин, | Экспериментальное | Концентрация b-эндорфина, M | |||
| пг/мл | воздействие | контроль | 10-7 | 10-9 | 10-11 |
| IL-1b, | Без индуктора | 193,01± | 271,66± | 266,57± | 238,22± |
| n=8 | 39,16 | 77,96* | 49,18* | 50,19 | |
| ЛПС 0,1 мкг/мл | 190,87± | 305,76± | 300,95± | 279,41± | |
| 54,43 | 49,50*** | 76,95** | 62,40* | ||
| TNF-a, | Без индуктора | 253,72± | 286,79± | 277,46± | 290,90± |
| n=8 | 52,60 | 61,43 | 67,08 | 62,32 | |
| ЛПС 0,1 мкг/мл | 269,59± | 297,93± | 295,42± | 295,49± | |
| 53,90 | 66,45 | 68,59 | 60,45 | ||
| IL-6, | Без индуктора | 1115,41± | 1084,09± | 1101,83± | 1109,70± |
| n=8 | 30,54 | 50,23 | 56,55 | 46,66 | |
| ЛПС 0,1 мкг/мл | 1094,73± | 1082,85± | 1051,07± | 1115,41± | |
| 36,40 | 28,72 | 36,16 | 33,88 | ||
| IL-8, | Без индуктора | 1353,68± | 1340,28± | 1664,63± | 1313,30± |
| n=4 | 114,42 | 104,42 | 44,10 | 156,25 | |
| ЛПС 0,1 мкг/мл | 1699,20± | 1278,40± | 1635,43± | 1364,28± | |
| 68,25а | 31,34*** | 68,31 | 59,85** | ||
| IL-1ra, | Без индуктора | 1811,38± | 1840± | 1817,25± | 1932,5± |
| n=4 | 272,30 | 275,54 | 431,75 | 297,55 | |
| ЛПС 0,1 мкг/мл | 1957,13± | 2346,5± | 2168,13± | 2175,13± | |
| 232,16 | 198,97*** | 261,74* | 198,06* | ||
Примечание. Здесь и в табл. 6: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Фишера наименьшей значимой разницы, a – р <0,05 – к спонтанной продукции.
стимулируют продукцию IL-1ra по сравнению с контролем как на 1-е, так и на 2-е сутки культивирования. Отмены стимулирующего влияния пептида на фоне блокады опиатных рецепторов не наблюдается. Анализ влияния пептида на продукцию IL-8 показал статистически достоверный угнетающий эффект как на 24, так и на 48 ч культивирования. В условиях блокады опиатных рецепторов налоксоном и налтриндолом угнетающее влияние b-эндорфина нивелируется. Внесение налоксона и налтриндола на продукцию IL-8 не влияет.
Таблица 6. Влияние b-эндорфина на продукцию IL-1b, TNF-a, IL-6 в очищенной фракции моноцитов
| Цитокин, | Экспериментальное | Концентрация b-эндорфина, M | |||
| пг/мл | воздействие | контроль | 10-7 | 10-9 | 10-11 |
| Без индуктора | 153,22± | 121,65± | 249,92± | 118,71± | |
| IL-1b, | 33,48 | 19,83 | 84,88 | 28,97 | |
| n=8 | ЛПС 0,1 мкг/мл | 230,26± | 202,84± | 223,97± | 235,21± |
| 42,25а | 36,47 | 71,16 | 53,29 | ||
| Без индуктора | 137,52± | 153,81± | 148,31± | 133,20± | |
| TNF-a, | 51,33 | 58,24 | 57,56 | 55,31 | |
| n=8 | ЛПС 0,1 мкг/мл | 163,21± | 178,81± | 174,97± | 178,73± |
| 60,48а | 69,78 | 68,63 | 70,21 | ||
| Без индуктора | 1204,61± | 1174,58± | 1281,19± | 1243,46± | |
| IL-6, | 354,15 | 356,34 | 357,40 | 332,03 | |
| n=8 | ЛПС 0,1 мкг/мл | 1435,55± | 1442,89± | 1346,26± | 1414,19± |
| 379,02а | 340,04 | 342,73 | 367,26 | ||
| Без индуктора | 1198,38± | 1230,63± | 1294,63± | 1148,68± | |
| IL-8, | 153,25 | 85,79 | 219,75 | 200,81 | |
| n=4 | ЛПС 0,1 мкг/мл | 1307,22± | 1422,48± | 1159,64± | 1228,32± |
| 213,04 | 90,89 | 121,80 | 154,70 | ||
| Без индуктора | 280,38± | 364,25± | 352,83± | 359,05± | |
| IL-1ra, | 90,82 | 128,06 | 133,52 | 146,50 | |
| n=4 | ЛПС 0,1 мкг/мл | 302,13± | 343,40± | 377,35± | 348,80± |
| 88,60 | 115,95 | 148,54 | 141,58 | ||
При оценке влияния опиатов на уровень TNF-a выявлено угнетение продукции TNF-a по сравнению с контролем при совместном внесение в культуры b-эндорфина и антагонистов опиатных рецепторов на 24 и 48 ч культивирования (см. рис. 18). На продукцию IL-6 на 24 ч культивирования b-эндорфин не влияет. На 48 ч культивирования продукцию IL-6 стимулирует налтриндол как при изолированном внесении, так и в комбинации с b-эндорфином. Учитывая, что во фракции лейкоцитов помимо моноцитов, основных продуцентов провоспалительных цитокинов, присутствуют гранулоциты, преимущественно нейтрофилы (Abrahametal., 2003; Fujiharaaetal., 2003; Xing, Remick, 2004), так же способные продуцировать IL-1b и IL-8, мы
24 ч 48 ч
Рис. 18. Влияние b-эндорфина 10-7 М в условиях блокады опиатных рецепторов на продукцию IL-1b, TNF-a, IL-6 в нефракционированной клеточной суспензии в присутствии ЛПС.
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Стъюдента..
исследовали влияние b-эндорфина на продукцию IL-1b и IL-8 во фракциях мононуклеаров и нейтрофилов.
Результаты исследований влияния b-эндорфина на продукцию IL-1 и IL-8 во фракциях мононуклеаров и нейтрофилов представлены на рис. 20. b-эндорфин 10-7 М стимулирует спонтанную и ЛПС-индуцированную продукцию IL-1b мононуклеарами. Аналогичная картина наблюдается во фракции нейтрофилов. На фоне LPS наблюдается статистически значимое усиление продукции IL-1b. b-эндорфин 10-7 М стимулирует как спонтанную, так и LPS-индуцированную продукцию IL-1b нейтрофилами. ЛПС-индуцированная продукция IL-8 мононуклеарами и нейтрофилами под воздействием b-эндорфина снижается. В культурах без ЛПС пептид уровень IL-8 не изменяет.
При анализе влияния b-эндорфина на продукцию исследуемых цитокинов мононуклеарами в присутствии ФГА были получены следующие результаты (рис. 21). Во фракции мононуклеаров ФГА, как и ЛПС, усиливает выработку IL-1b и не влияет на уровень IL-8. b-эндорфин стимулирует как спонтанную, так и ФГА-индуцированную продукцию IL-1b мононуклеарами. Уровень IL-8 под воздействием пептида в нестимулированных ФГА пробах не изменяется, а в стимулированных - снижается. Как следует из полученных данных, продукцию цитокинов семейства IL-1 нефракционированными лейкоцитами, нейтрофилами и мононуклеарами(но не очищенными моноцитами) b-эндорфин активирует, а продукцию IL-8 угнетает, таким образом, оказывая двоякое действие, с одной стороны, активируя процессы пролиферации и дифференцировки, а, с другой, угнетая хемотаксис. При этом в отличие от IL-1, депрессия IL-8
24 ч 48 ч
Рис. 19. Влияние b-эндорфина 10-7 М в условиях блокады опиатных рецепторов на продукцию IL-8 и IL-1ra в нефракционированной клеточной суспензии в присутствии ЛПС.
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию Стъюдента..
Рис. 20. Влияние b-эндорфина 10-7 М на продукцию IL-1b и IL-8 во фракциях мононуклеаров, нейтрофилов и моноцитов, стимулированных ЛПС.
К – контроль, 1 - b-эндорфин, 2 – ЛПС, 3 – ЛПС+b-эндорфин. * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю, а - р < 0,05 к ЛПС по парному t-критерию Стъюдента..
проявляется только в ЛПС и ФГА-индуцированных культурах и нивелируется опиатными антагонистами, что указывает на вовлечённость различных рецепторных механизмов в регуляцию синтеза IL-1b и IL-8 b-
Рис. 21. Влияние b-эндорфина 10-7 М на продукцию IL-1b и IL-8 мононуклеарами, стимулированными ФГА 2,5 мкг/мл в течении 24 ч культивирования.
К – контроль, 1 - b-эндорфин, 2 – ФГА, 3 – ФГА+b-эндорфин. * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю, а - р < 0,05 к ФГА по парному t-критерию Стъюдента.
эндорфином. Ранее (Nandhra, 2000) был зарегистрирован угнетающий блокируемый налоксоном, эффект b-эндорфина на продукцию IL-8 клетками хориодецидуальной оболочки. Н.Л. Елизарова с соавт. (2001) установили, что аминокислотная последовательность β-эндорфина в молекуле препарата тимуса – тактивина обусловливает активацию функциональной активности лимфоцитов, усиление фагоцитоза и снижение способности моноцитов к адгезии, последняя функция отменялась налоксоном, в то время как усиление фагоцитоза налоксоном не отменялось. По нашим данным, депрессия продукции IL-8 отменяется селективным d-антагонистом налтриндолом, что свидетельствует о возможности реализации эффектов b-эндорфина через d-рецептор. В то же время, как показано в работе B.M. Sharp (2006), в зависимости от экспериментальной модели и объекта исследования d-рецептор может опосредовать проведение как стимулирующих, так и угнетающих сигналов.
Рис. 22. Схема возможного механизма влияния b-эндорфина на процессы иммуногенеза.
Заключение
Результаты проведённых исследований представлены в виде схемы возможного механизма влияния b-эндорфина на процессы иммуногенеза (рис. 22). Установлено, что b-эндорфин является важным фактором в поддержании внутреннего гомеостаза. Приведённые в данные, свидетельствуют о том, что b-эндорфин поддерживает гомеостаз иммунной системы через балансирование Th1 и Th2 ответа, смещая поляризацию Т-хелперов в сторону Th2-клеток, параллельно усиливая естественную резистентность. Следовательно, b-эндорфин является кофактором, опосредующим переключение дифференцировки Т-хелперов с Th1 на Th2 тип и играющим решающую роль при целом ряде иммунопатологических состояний, а иммуномодулирующие функции опиоидных пептидов могут представлять значительный терапевтический интерес.
Оценивая роль эндогенных нейропептидов в стрессиндуцированных изменениях иммунной системы необходимо отметить, что полученные данные прямо указывают на непосредственное участие эндогенных опиатов в активации иммунной системы. Направленность ряда физиологических эффектов эндогенных опиоидных пептидов при стрессе противоположна эффектам глюкокортикоидов и катехоламинов. Ранее глюкокортикоиды и катехоламины рассматривались исключительно как стрессреализующие факторы, в то же время их основная биологическая роль может заключаться в ограничении опасной для организма стрессиндуцированной активации иммунных процессов.
ВЫВОДЫ
1. Подтверждена интегральная роль эндогенной опиоидной системы в нейроэндокринной регуляции иммуногенеза в норме, введении глюкокортикоидов и катехоламинов и в условиях стрессорного воздействия. Основные компоненты эндогенной опиоидной системы принимают непосредственное участие в активации иммунной системы при стрессе.
2. Установлено, что в условиях блокады m, d-опиатных рецепторов в период индукции иммунного ответа повышается степень выраженности иммуносупрессивного действия гормонов стресса (глюкокортикоидов и катехоламинов) на антителогенез и регистрируется снижение степени выраженности угнетающего действия глюкокортикоидов на количество ядросодержащих клеток в регионарном лимфатическом узле.
3. Впервые показано, что b-эндорфин в высоких (100 мкг/мл) дозах угнетает, в низких (0,0005 мкг/кг) дозах стимулирует гуморальное звено иммунитета и при этом не влияет на степень выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа. В клеточных культурах b-эндорфин стимулирует пролиферацию лимфоцитов и продукцию IL-4, не влияет на синтез IL-2, IFN-g и при этом усиливает степень поляризации Т-хелперов в направлении Th2-клеток. Доминирующая роль в реализации стимулирующих эффектов b-эндорфина на пролиферацию и продукцию IL-4 принадлежит d-рецепторам.
4. Впервые обнаружена зависимость стимулирующего эффекта опиоидных пептидов на пролиферацию лимфоцитов и продукцию IL-4 от присутствия моноцитов в клеточной культуре.
5. Показано, что b-эндорфин стимулирует фагоцитарную активность клеток естественного иммунитета и оказывает модулирующее действие на цитокинпродуцирующую функцию моноцитов и нейтрофилов. В условиях блокады m, d-опиатных рецепторов отмены стимулирующего влияния b-эндорфина на продукцию IL-1b не наблюдается, при этом угнетение продукции IL-8 опиатными антагонистами отменяется.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Экспериментальные статьи
1. Шилов Ю.И., Гейн С.В. Адренергическая регуляция пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с Т-клеточными митогенами // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1999. - Т. 128, № 8. - С. 207-209.
2. Шилов Ю.И., Гейн С.В, Черешнев В.А. Влияние блокады b-адренергических рецепторов при стрессе на антителообразование, гиперчувствительность замедленного типа, функции фагоцитирующих клеток при локальной форме иммунного ответа // RussianJournalofImmunology. - 2001. - V. 6, № 3. - P. 301-308.
3. Гейн С.В., Симоненко Т.А., Черешнев В.А. Влияние b-эндорфина и селективного агониста m-опиатных рецепторов DAGO на пролиферативную активность лимфоцитов // Доклады академии наук. - 2003. - Т. 391, № 1. - С. - 127-129.
4. Гейн С.В., Симоненко Т.А., Тендрякова С.П. Влияние агонистов опиатных рецепторов на процесс антителообразования и гиперчувствительность замедленного типа при локальном иммунном ответе // Вестн. Пермск. университета. Серия Биолгия. - 2004. - Вып. 2. - С. 166-168.
5. Гейн С.В., Тендрякова Т.А. Иммуномодулирующие эффекты гидрокортизона и адреналина в условиях блокады опиатных рецепторов // Докл. Академиинаук. - 2004. - Т. 399, № 3. - С. 412-414.
6. Gein S.V., Simonenko T. A., Tendryakova S. P. The effects of rotation stress on measures of immunity. The role of opiate receptors // Neuroscience and Behavioral Physiology. - 2004. - V. 34, № 9. - P. 935-938.
7. Гейн С.В., Баева Т.А. Роль опиоидных пептидов в регуляции пролиферации лимфоцитов и изменении Тh1/Тh2 цитокинового профиля // Проблемы эндокринологии. - 2005. - № 5. - С. 49-51.
8. Гейн С.В., ШаравьёваИ.Л, Баева Т.А., Тендрякова Т.А. Роль блокады различных типов опиатных рецепторов в регуляции иммуномодулирующих эффектов ротационного стресса // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2005. - № 3. - С. 70-73.
9. Гейн С.В., Баева Т.А., Гейн О.Н., Черешнев В.А. Роль моноцитов в реализации эффектов b-эндорфина и селективных агонистов m- и d-опиатных рецепторов на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови // Физиология человека. - 2006. - Т. 32, № 3. – С. 111-116.
10. Гейн С.В., ШаравьёваИ.Л, Тендрякова Т.А. Роль d-опиатных рецепторов в регуляции гуморального и клеточноопосредованного иммунного ответа при ротационном стрессе // Доклады Академии наук. - 2006. - Т. 407, № 1. - С. 127-129.
11. Гейн С.В., Баева Т.А., Кичанова О.А. Влияние b-эндорфина на антителогенез и продукцию ИЛ-4 в условиях блокады опиатных рецепторов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 142, № 8. – С. 192-195.
12.С.В. Гейн, Е.Г. Чижова, С.П. Тендрякова Влияние гидрокортизона и адреналина в условиях блокады m- и d-опиатных рецепторов на развитие локального иммунного ответа у мышей // Российский физиологический журнал им. Сеченова. - 2006. - Т. 92, № 7. - С. 827-834.
13. Горшкова К.Г., Гейн С.В., Тендрякова С.П. Роль бета-эндорфина в регуляции продукции IL-1b и IL-8 моноцитами и
8-09-2015, 23:00