Для повышения тропности (способность воздействовать на что-либо)липосом к определенным органам и тканям их изготавливают из фосфолипидов, изолированных из этих органов, или фиксируют на поверхности специфические антитела против соответствующих тканевых антигенов, или применяют так называемые молекулы-посредники, обладающие двумя типами сродства: с одной стороны — к клеткам макроорганизма, с другой — к липосоме. Как отмечают исследователи, липиды в определенной степени участвуют в «узнавании» клеток, поскольку каждому типу мембран соответствует определенное, характерное только для него соотношение полярных липидов. В процессе «узнавания» важную роль играют также гликолипиды (ганглиозиды), участвующие в межклеточных взаимодействиях и являющиеся специфическими рецепторами ряда биологически активных веществ. То есть механизм взаимодействия липосом с клетками определяют не только фосфолипиды, но и ганглиозиды, входящие в состав липосом. Изучение распределения липосом, содержащих фосфатидилхолин, холестерин и гликолипид, при внутривенном введении в организм показало, что наилучшим гликолипидом для липосом в отношении их переноса в ткани головного мозга и печени является сульфатид, в ткани селезенки — ганглиозиды, в ткани легких — сфингомиелин. Так, например, человеческий a-интерферон, иммобилизованный в липосомы, мембрана которых построена из фосфатидилхолина, холестерина и сульфатида, после внутрибрюшинного введения в большей степени обнаруживается в крови, печени, селезенке и опухолевой ткани мозга.
Если необходимо локальное воздействие на клинический процесс, то для исключения системного влияния на организм целесообразно местное применение лекарственных препаратов.
Липосомальные препараты по сравнению с традиционными лекарственными формами для наружного применения, такими как мази и гели, обладают большей способностью проникать в кожу и волосы, а потому они более доступны для живых клеток-мишеней. Установлено, что липосомы интенсифицируют процессы взаимодействия активных веществ с кожей при лечебной наружной терапии, что приводит к повышению терапевтической эффективности иммобилизованных в них лекарственных веществ. Вероятнее всего, такой эффект вызван слиянием липосом с липидными ламеллами, не доходя до базального слоя, и высвобождением их внутреннего содержимого. Подвижные липиды липосом встраиваются в липидные ламеллы, увеличивая таким образом «жидкостность» барьера, что улучшает проницаемость. Другим важным путем проникновения липосом и их содержимого вглубь кожи являются волосяные фолликулы. Эффективность трансдермального липосомального переноса лекарственных веществ можно усиливать, используя методы ионо- и фонофореза.
2.3 Применение липосом в лечении вирусных заболеваний
Многие исследователи считают, что применение липосом в вакцинации способно усилить действие вакцин и при этом позволит сэкономить значительные денежные средства.
По мнению Марка Дж. Остро, вице-президента «Liposome Company» (USA), занимающей в мире ведущее положение в развитии липосомной технологии, в ближайшее время найдут свое применение не менее 15 новых терапевтических средств, основанных на липосомной технологии. По оценке американских специалистов, в ближайшее время продажа липосом на мировом рынке составит 20–25 % средств доставки лекарственных препаратов. Ведущее положение в исследованиях и разработках липосомальных форм введения лекарственных средств занимают три американские компании — «The Liposome Company» (TLC), «Liposome Technology Inc.» (LTI), «Vestar». Благодаря их исследованиям на рынок уже введены липосомальный амфотерицин В (TLC) для лечения системных микозов, противоопухолевые липосомальные препараты — даунорубицин («Vestar»), доксорубицин (TLC — Dox 99), цисплатин (TLC). Многие препараты проходят завершающие стадии клинических испытаний — это и липосомальные вакцины против гриппа и меланомы, и противодиабетический комплекс инсулин-липосомы, и противовирусные нуклеозиды для лечения СПИДа, и серия липосомальных бронхорасширяющих препаратов и т.д.
Разумеется, создателям липосомальных препаратов предстоят дальнейшие исследования в данной области. Необходимо совершенствовать технологию производства липосомальных препаратов, добиваться большей стабильности готовых лекарственных форм, удешевлять производство. Однако опыт производства российского липосомального интерферона свидетельствует о возможности решения этих задач. По нашему мнению, на данном этапе развития науки о липосомах важно использовать в производстве липосомальных препаратов только природные материалы, поскольку введение липосом, приготовленных на основе природного лецитина (фосфолипид, в состав которого входит холин), не связано с риском развития токсичности, иммуногенности и возникновения аллергических реакций. Кроме того, на применение природного лецитина в производстве пищевых продуктов, косметических и лекарственных средств отсутствуют ограничения как в Европейском союзе, так и в инструкциях Управления по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA). Очень осторожно нужно подходить к применению у людей липосом, приготовленных из синтетических, полимеризованных липидов. Безусловно, полимерные липосомы, или липосомы второго поколения, значительно увеличат время циркуляции лекарств в кровотоке и, вероятно, за ними большое будущее, однако необходимо решить проблему токсичности и плохой биодеградации полимерных носителей
Липоферон – липосомированный препарат рекомбинантного α-2b интерферона – хорошо переносится больными и имеет высокую эффективность как в профилактике, так и лечении вирусных инфекций (грипп, ОРВИ, гепатиты В и С). Естественный путь введения (через рот) делает препарат незаменимым в педиатрической практике и при амбулаторном лечении.
Рекомбинантные α2-интерфероны (ИФН) обладают антивирусной, противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью. Препараты ИФН широко применяются в комплексной терапии вирусных, бактериальных и онкологических заболеваний человека. Для достижения терапевтического эффекта необходимы ежедневные инъекции высоких доз препарата – от 1-2 до 50 млн МЕ, так как протеазы крови и других биологических жидкостей организма быстро разрушают ИФН. Парентеральное введение высоких доз ИФН часто сопровождается повышением температуры, ознобом, утомляемостью, кожными высыпаниями, лейко- и тромбоцитопенией и другими побочными эффектами. Так, при лечении хронического гепатита С побочные эффекты наблюдаются у 72% больных.
Создание препаратов рекомбинантного ИФН, не вызывающих побочных эффектов, – крайне актуальная проблема. Одним из подходов к решению этой сложной задачи является липосомирование, т. е. заключение ИФН в липосому. На международном фармрынке уже представлен липосомальный амфотерицин В для лечения системных микозов, противоопухолевые липосомальные препараты – даунорубицин, доксорубицин, цисплатин. Целый ряд препаратов находится на завершающих фазах клинических испытаний: липосомальные вакцины против гриппа и меланомы, противодиабетический комплекс инсулин-липосомы, противовирусные нуклеозиды для лечения СПИДа, серия липосомальных бронхорасширяющих препаратов и др. Эти препараты значительно менее токсичны, чем нелипосомированные.
Достоинства липосом как носителей лекарств состоят в том, что, полученные из природных фосфолипидов, они в отличие от полимерных систем доставки лекарств полностью биодеградируемы и биосовместимы. Включенные в липосомы лекарственные вещества оказываются более устойчивыми в организме, так как изолированы липидной мембраной от повреждающих воздействий, в частности от разрушения в желудочно-кишечном тракте, поэтому в меньшей степени оказывают общетоксическое действие на организм. Уникальной особенностью липосом является возможность доставки лекарственных препаратов внутрь клеток, с которыми они взаимодействуют, путем слияния или эндоцитоза. Особый интерес вызывает возможность орального применения липосомальных белковых препаратов.
Специалисты ДГУ «Вектор-Фарм» ГНЦ ВБ «Вектор» в течение 10 лет разрабатывали и внедряли в медицинскую практику липосомальный генно-инженерный α-2b ИФН (торговое название в Украине – Липоферон) для перорального применения. В состав препарата Липоферон входят только фармацевтически приемлемые компоненты. Препарат выгодно отличается отсутствием в составе альбумина, способного вызывать аллергические реакции. Пероральное применение Липоферона надежно защищает организм больного от риска передачи инфекций (ВИЧ, вирусы гепатитов В, С (ВГВ, ВГС)) при инъекциях. Также отсутствует психоэмоциональный фактор, характерный для инъекций, особенно у детей. Готовая форма препарата представляет собой лиофильно высушенный продукт, восстанавливающий липосомальную структуру при добавлении воды.
В результате доклинического исследования было установлено, что ИФН, заключенный в липосомы, сохраняет биологическую активность в желудочно-кишечном тракте и всасывается в кровь. По скорости всасывания ИФН, заключенный в липосомы и применяемый перорально, оказался близок к свободному ИФН, вводимому внутримышечно, но в остальном фармакокинетика препаратов заметно отличалась. Так, например, высокий уровень накопления ИФН в сыворотке крови мышей регистрировался через 1 ч независимо от применяемой лекарственной формы препарата. Липосомальный ИФН отличался более длительным периодом циркуляции в крови лабораторных животных, его период полувыведения составлял 6 ч, в то время как у Реаферона-ЕС – 3 ч. К 6 ч уровень ИФН в сыворотке крови после введения Реаферона падал до фоновых значений, после введения Липоферона это происходило к 9 ч, с последующим новым подъемом к 15 ч.
2.4 Липосомы и противотуберкулезная терапия
Гидразид никотиновой кислоты — основной противотуберкулёзный препарат. Если упаковать его в липосомы, это позволит адресно доставлять лекарство к микобактериям туберкулёза. Исследованиями в этой области занимаются специалисты Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН при поддержке федеральной целевой программы Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2012 годы.
При туберкулёзном воспалении образуются гранулемы, которые состоят из клеток иммунной системы макрофагов, набитых микобактериями туберкулёза. Поэтому в макрофаги необходимо доставить лекарство. Адресная доставка позволит снизить токсическую нагрузку на печень. Макрофаги обладают способностью заглатывать мелкие частицы, поэтому предлагаемое лекарство, гидразид никотиновой кислоты, упаковывают в липосомы. Новосибирские учёные создали молекулярно-липосомальные гибридные композиции (МЛГК) размером от 200 до 450 нм, которые содержат окисленные декстраны, связанные с лекарством. Теперь исследователи проверяют, какие факторы могут повлиять на эффективность заглатывания МЛГК фагоцитами.
Учёные провели эксперименты на мышиных макрофагах. Клетки обработали ферментами и соединениями, которые теоретически могли бы помешать макрофагам поглощать липосомы. Процесс поглощения можно условно разделить на две стадии: сначала МЛГК налипают на клетки, а потом попадают внутрь. Оказалось, что слущивание с поверхности фагоцитов белковых молекул, способных выполнять функции рецепторов, не играет роли в прилипании МЛГК к мембранам клеток. Несколько ослабить этот процесс может пониженный метаболизм в клеточных мембранах.
Собственно фагоцитоз, то есть доля клеток, поглощающих липосомы, и количество липосом, которые заглатывает одна клетка, зависит от подвижности цитоскелета клетки, то есть возможности мембраны втягиваться и выпячиваться, и от уровня метаболизма на клеточных мембранах. Нарушения этих процессов снижают активность фагоцитоза вдвое, но, тем не менее, поглощение МЛГК всё равно происходит. Исследователи пришли к выводу, что макрофаги активно захватывают лекарство, заключённое в липосомах, поэтому МЛГК в состоянии обеспечить его адресную доставку к микобактериям туберкулёза.
2.5 Использование липосом в химиотерапии при онкозаболеваниях
Стандартной экструзией через калиброванные ядерные мембраны получены стабильные липосомы среднего диаметра 100 нм на основе природных фосфолипидов и липофильных пролекарств широко применяемых химиотерапевтических средств – метотрексата и мелфалана. Липосомы показали эффективность при системном введении мышам с экспериментальными опухолями. Фармакокинетика метотрексата в плазме крови мышей свидетельствует о преимуществах его применения в виде липофильного пролекарства в липосомах.
Открытие явления пассивного транспорта частиц примерно 100-нм размеров в опухоли и очаги воспаления [1] послужило импульсом для бурного развития исследований в области разработки систем доставки лекарств. Применение нанотехнологий уже является общепризнанной в мире стратегией развития фармацевтического производства на ближайшие десятилетия. Включение лекарств в биосовместимые полимерные или супрамолекулярные носители уменьшает концентрацию свободных препаратов в кровотоке и препятствует их быстрому выведению почечной системой, что позволяет уменьшить общую токсичность и увеличить терапевтический индекс за счет улучшения фармакокинетики и биораспределения. Накопление наноразмерных носителей в опухолях и очагах воспаления осуществляется благодаря дефектной архитектуре формирующейся de novo сосудистой системы и повышенной проницаемости ее эндотелия. В то же время, высокое интерстициальное давление в солидных (твердых) опухолях не позволяет удерживаться в них частицам с размерами менее 30–40 нм (эффект enhanced permeability and retention). Оптимальный размер носителей, обеспечивающий пассивный транспорт лекарств, попадает в интервал 50–150 нм. Липосомы, наряду с липидными наносферами, относятся к наиболее био- и гемосовместимым носителям и пригодны для системного введения в организм. Липосомы более 30 лет назад привлекли внимание в качестве систем доставки лекарств. Исследования получили новый импульс после разработки технологии получения липосом Stealth® [2]. Поверхность таких липосом защищена от опсонизации (адсорбции белков плазмы) и преждевременного вывода из кровотока клетками иммунной системы благодаря экранированию привитыми высокогидратированными остатками полиэтиленгликоля. Препараты на основе Stealth-липосом применяются в клинике уже более 10 лет: например, липосомы с доксорубицином (Doxil, Caelix и др. производства США, стран ЕС, Украины) – для лечения саркомы Капоши и рака яичников [3]. Однако создание подобных конструкций для широкого спектра водорастворимых средств оказалось невозможным, поскольку метод активной загрузки, применяемый при их производстве, пригоден лишь для ограниченного числа лекарств, имеющих природу слабых амфифильных кислот или оснований (например, антибиотики антрациклинового ряда типа доксорубицина). Альтернативный лабораторный способ – формирование липосом в водно-солевом растворе лекарства с последующим отделением от невключившегося агента – нетехнологичен.
Мы предлагаем включать лекарства в липидный бислой липосом в виде липидных производных – липофильных пролекарств, которые расщепляются внутриклеточными ферментами с высвобождением исходного препарата. Такой подход упрощает технологию получения лекарственных липосом и делает ее универсальной. Более того, по сравнению с инкапсулированием в водный объем липосом, включение в бислой позволяет улучшить фармакологические свойства системы доставки в целом, благодаря уменьшению потерь лекарства как в кровотоке, так и при взаимодействии липосомы с клеткой. Очевидно также, что липидные производные способны к прямому трансмембранному переносу, что кардинально меняет механизм эндоцитоза и внутриклеточного трафика препарата и облегчает разгрузку липосом. Для сравнения, чтобы обеспечить выход лекарства из водного объема Stealth-липосом после их попадания в эндосомы клетки-мишени, предлагается использовать рН-чувствительные молекулярные триггеры, в том числе пептидные, фосфолипидные и др. Низкая эффективность внутриклеточной разгрузки, обусловленная жесткостью липидного бислоя (температура его фазового перехода превышает 60°С) и затрудненным слиянием с клеточными мембранами – один из существенных недостатков Stealth-липосом.
Нами разработаны синтезы липидных производных широко применяемых в клинике химиотерапевтических средств: мелфалана (и его рацемата сарколизина) и метотрексата [4, 5]. Цитотоксик мелфалан – алкилирующий агент, действующий независимо от стадии клеточного цикла, – применяется в химиотерапии почти 50 лет. Цитостатик метотрексат, антиметаболит фолиевой кислоты, также давно используется для лечения онкологических и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, где он по-прежнему остается «лекарством номер один». Связь между лекарством и остальной частью молекулы пролекарства должна легко гидролизоваться внутри клетки. Поскольку эстеразы обладают меньшей специфичностью, чем амидазы, и широко представлены во всех органах и тканях, предпочтительна сложноэфирная связь, а не амидная. Кроме того, при разработке молекулярных структур липидных конъюгатов учитывалось их наилучшее соответствие упаковке липидного бислоя липосом (рис. 1).
Рис. 3. Молекулярные структуры липидных конъюгатов лекарств и схематическое изображение лекарственной липосомы
Липосомы с пролекарствами формируются стандартным методом экструзии: липидные пленки, полученные из смеси всех амфифильных компонентов (яичный фосфатидилхолин, фосфатидилинозит из пекарских дрожжей и пролекарства), подвергаются гидратации буферным физраствором, затем 5-6 циклам замораживания (жидкий азот) – оттаивания и наконец, 10-20-кратной экструзии при температуре не выше +40°С через поликарбонатные мембранные фильтры с размерами пор 100 нм. Для экструзии мы используем установку фирмы Lipex (Канада) при давлении азота до 50 ат или ручной экструдер Avanti (США), в зависимости от количества требуемых препаратов. На рис. 2 приведены электронные микрофотографии дисперсий липосом, полученные методом замораживания-скалывания, который наиболее адекватно отражает размеры и структуру исходных липосом в водной фазе [6].
Рис. 4. Электронные микрофотографии реплик с поверхностей скола замороженных дисперсий липосом, нагруженных: А , а – липидным конъюгатом метотрексата; Б , б – липидным конъюгатом мелфалана
Очевидно, что липосомы, содержащие до 10 мол. % липофильных пролекарств, действительно представляют собой моноламеллярные везикулы диаметром до 100 нм. Известно, что фосфатидилинозит стабилизирует мембрану липосом, подобно остаткам полимера в Stealth-липосомах. Мы полагаем, что этот природный фосфолипид не должен вызывать нежелательные побочные эффекты, которые сопутствуют повторному применению липосом с полиэтиленгликолем [7].
Физико-химическая стабильность липосом исследована нами с помощью динамического лазерного светорассеяния, электронной микроскопии и гель-хроматографии в сочетании со спектрофотометрическим анализом на хромофоры лекарств и липидный фосфор. Показано, что пролекарства полностью (нагрузка липидного бислоя до 10 мол. %) встраиваются в мембрану липосом и образуют стабильные дисперсии, содержащие лекарственное начало в концентрациях, пригодных для системного введения животным. Такие дисперсии можно хранить несколько дней при +4 °С. Однако сами лекарства, в особенности остаток мелфалана, в водной среде подвергаются постепенной деградации. Для длительного хранения дисперсии можно замораживать при –196 °С и хранить при температурах ниже –20 °C; перед применением их необходимо разморозить и кратковременно обработать на ультразвуковой бане. Действительно, агрегаты липосом, образовавшиеся после размораживания дисперсий (рис. 3,б ), диспергируются с восстановлением исходных наноразмерных липосом (рис. 3,в ).
Рис. 5. Электронные микрофотографии липосом с липофильным пролекарством мелфалана (метод негативного контрастирования):
а – через 20 ч после получения; б – после размораживания замороженных в жидком азоте дисперсий; в – после обработки размороженных дисперсий на ультразвуковой бане
Состав липосом при этом также сохраняется: липофильнеые пролекарства не выделяются из липидного бислоя липосом в отдельные агрегаты [6]. Таким образом, глубокое замораживание без криопротекторов может быть одним из способов длительного хранения липосомальных препаратов с липидными конъюгатами мелфалана и метотрексата.
Другой вопрос: какова стабильность сложноэфирных связей липофильных пролекарств после внутривенного введения липосомальных дисперсий? На примере конъюгата метотрексата нами показано, что пролекарства в составе липосом устойчивы к преждевременному гидролизу эстеразами плазмы крови человека [8]. Действительно, высокоэффективная жидкостная хроматография со спектрофотометрическим детектированием продемонстрировала стабильность пролекарства метотрексата при инкубации in vitro в плазме крови вплоть до 24 ч. Очевидно, липосомы защищают сложноэфирные конъюгаты от действия внеклеточных эстераз.
Проведена
8-09-2015, 20:13