Середовище № 3 — це сухе поживне середовище АГВ (сухе поживне середовище для визначення чутливості мікробів до антибіотиків). При його виготовленні користуються вказівками, що є на етикетці.

Длягемофільних мікроорганізмів у ці поживні середовища додають 5 % дефібринованої або гемолізованої крові. Середовище розливають по 20 мл у стерильні чашки Петрі (діаметр чашок 100 мм). Підготовлені чашки можна зберігати в холодильнику за температури 10 °С не більше ніж 7 діб. Перед посівом поверхню середовища підсушують за кімнатної температури, для цього їх витримують при злегка відкритій чашці протягом 30—40 хв.

Для посіву використовують 18—20-годинну агарову культуру бактерій або патологічний матеріал. При використанні агарової культури її спочатку змивають невеликою (4—5 мл) кількістю фізіологічного розчину натрію хлориду. Можна використати 18—20-годинну бульйонну культуру. Суспензію або бульйонну культуру розводять ізотонічним розчином натрію хлориду до густоти оптичного стандарту № 10 (1 млрд. мікроорганізмів на 1 мл суспензії), а при використанні середовища № 3 — до стандарту № 5 (500 млн. мікроорганізмів на 1 мл суспензії). Для цього суспензію чи бульйонну культуру стерильною піпеткою переносять у стерильну пробірку, яка за діаметром, товщиною стінок і кольором скла відповідає пробірці оптичного стандарту. Густоту інокулята порівнюють з густотою оптичного стандарту і в разі необхідності додають ізотонічний розчин натрію хлориду до потрібної густоти. Отриману мікробну суспензію (інокулят) розводять повторно ще в 10 разів тим самим ізотонічним розчином. Розведений інокулят в об'ємі 1—2 мл наносять піпеткою на поверхню середовища і, похитуючи чашку, рівномірно розподіляють по всій поверхні середовища; надлишок інокуляту переносять у дезінфікуючий розчин. Чашку знову підсушують за кімнатної температури протягом 10—15 хв.

За допомогою пінцета накладають диски на однаковій відстані один від одного і на відстані 2 см від краю чашки. На одну чашку — не більше 6 дисків [27].

Культивують мікроорганізми за температури 35—37 °С протягом 18—20 год.

Для контролю відтворення й точності результатів у випадку визначення чутливості при кожній постановці тесту паралельно зі штамами, які досліджуються, необхідно використовувати еталонні штами: Е. coli (ATCC25922), S. aureus (ATCC25923) і P. aeruginosa (ATCC27853).

Якщо діаметри зон затримки росту еталонних штамів виходять за встановлені межі, то результати визначення чутливості будуть необ'єктивними й свідчитимуть про незадовільну якість середовищ, дисків або порушення методики постановки тесту.

Проведення посіву з метою визначення чутливості мікроорганізмів до хіміопрепаратів та антибіотиків методом дифузії в агар.

Під час роботи з живою культурою обов`язково дотримувались правил техніки безпеки!

Алгоритм "Проведення посіву з метою визначення чутливості мікроорганізмів до хіміопрепаратів та антибіотиків методом дифузії в агар"'.

поставити чашку Петрі з поживним середовищем із злегка відкритою кришкою для підсушування (на 30—40 хв), потім закрити чашку кришкою;

підготувати культуру мікроорганізмів (інокулят) до посіву;

підписати чашку Петрі (вказати назву середовища, номер аналізу, назву культури, дату посіву);

провести посів інокулята піпеткою на поживне середовище;

поставити чашку зі злегка відкритою кришкою для підсушування поверхні середовища (на 10—15 хв), потім закрити чашку кришкою;

поставити чашку донизу дном біля спиртівки;

взяти у праву руку пінцет, зафламбувати його;

взяти у ліву руку флакон з дисками, зняти з нього пробку мізинцем правої руки, зафламбувати отвір флакона;

взяти пінцетом один диск, зафламбувати отвір флакона, закрити його пробкою, поставитина стіл;

лівою рукою злегка підняти кришку чашки й покласти диск на поверхню середовища, придавити його злегка бланшами пінцета.

Чашку тримати біля полум'я на відстані не далі ніж 10 см. Пінцет фламбувати кожного разу перед тим, як узяти новий диск; при накладанні наступних дисків чашку обертати так, щоб зручно було накладати диски; дотримуватися вимог асептики [27];

накласти рівномірно інші диски;

поставити чашку в термостат догори дном.

Методика обліку результатів дослідження.

Для визначення результатів дослідження чашки ставлять догори дном на темну матову поверхню (облік у відбитому світлі) або тримають чашку проти джерела світла (облік у світлі, яке проходить крізь чашку). Лінійкою вимірюють діаметр зони затримання росту мікроорганізмів з точністю до 1 мм, включаючи діаметр дисків. Якщо в зоні затримання росту мікроорганізмів є колонії, то це свідчить про присутність сторонньої мікрофлори або гетерорезистентність окремих штамів даної культури.

Результати оцінюють за таблицею, яка знаходиться в упаковці з дисками. У таблиці зазначено межі значень діаметрів зон затримання росту мікроорганізмів для стійких, помірно стійких і чутливих штамів у міліметрах, а також значення мінімальних пригнічувальних концентрацій (МПК) антибіотиків у мікрограмах на мілілітр розчину для помірно стійких і чутливих штамів мікроорганізмів [23].

Одержані значення діаметрів зон затримання росту мікроорганізмів порівнюють із зазначеними в таблиці й відносять досліджувані штами до однієї з трьох категорій чутливості, а також визначають МПК. У відповіді вказують не розмір діаметрів зон затримання росту мікроорганізмів, а ступінь чутливості штаму мікроорганізмів до лікувальних препаратів та МПК.

2.3 Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків методом серійних розведень

Цей метод можна виконувати із двох модифікаціях — на рідкому й на щільному поживному середовищі. Це точний кількісний метод. Його використовують у наукових дослідженнях і особливо важливих випадках у лабораторіях лікувальних і профілактичних закладів.

Для постановки досліду треба мати: чисту культуру мікроорганізмів, що досліджується, основний розчин антибіотика (32 ОД/см³ ), МПБ на переварі Хоттінгера, який містить 1,2— 1,4 г/дм³ амінного азоту.

Чисту культуру готували у вигляді мікробної суспензії. Для цього 18—20-годинну агарову культуру розводили ізотонічним розчином натрію хлориду до густоти оптичного стандарту № 10. Таким чином, отримали суспензію культури мікроорганізмів з концентрацією 10⁹ клітин у 1 мл її. Потім у дві пробірки наливали по 9,9 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. У 1-шу пробірку вносили 1 мл суспензії культури мікроорганізмів, розведеної до 10⁹ клітин в 1 мл, перемішували, отримали суспензію 10⁷ клітин в 1 мл. Потім 1 мл суспензії 10⁷ клітин в 1 мл переносили у 2-гу пробірку, перемішували, отримали культуру 10⁵ клітин в 1 мл. Розводили антибіотик з основного його розчину (табл. 2.1).

Таблиця 2.1

Отримання основного розчину антибіотика

2.4 Проведення посіву з метою визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотика методом розведення на рідкому поживному середовищі

Алгоритм "Проведення посіву з метою визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотика методом розведення на рідкому поживному середовищі":

виготовити мікробну суспензію 10⁵ мікробних клітин в 1 мл;

приготувати основний розчин антибіотика;

поставити в штатив 12 стерильних пробірок;

підписати пробірки: 1 — номер аналізу, номер пробірки й кількість антибіотика — 16 ОД. На всіх останніх пробірках — порядковий номер пробірки (2, 3... 10) і кількість антибіотика (8 ОД, 4 ОД і т. д.); на пробірці № 11 — "КК" (контроль культури); на пробірці № 12 — КС (контроль середовища);

внести в усі 12 пробірок по 1 мл МПБ;

внести у 1-шу пробірку 1 мл основного розчину антибіотика (32 ОД/мл), перемішати;

перенести 1 мл рідини з 1-ї пробірки в 2-гу, перемішати; 1 мл перенести з 2-ої пробірки в 3-тю й т. д. до пробірки № 10;

вилити 1 мл рідини з 10-ї пробірки в банку з дезінфекційним розчином;

Кожний інгредієнт беруть окремою піпеткою. У всіх пробірках повинен бути однаковий об'єм рідини [27];

внести у пробірки № 1 — 11 по 1 мл культури, що досліджується, у розведенні 100 000 клітин в 1 мл (10⁵ клітин в 1 мл);

штатив з пробірками поставити в термостат на 18—24 год. (температура — 37 °С).

Методика визначення результатів дослідження.

Результати починають визначати з контрольних пробірок. В 11-й пробірці "КК" повинен бути ріст культури (помутніння середовища), у пробірці "КС" середовище повинне бути прозорим. Потім розглядають дослідні пробірки. Відзначають останню пробірку, в якій середовище залишається прозорим. Кількість антибіотика в цій пробірці і є його мінімальною дозою, здатною пригнічувати ріст мікроорганізмів. У відповіді вказують мінімальну концентрацію антибіотика, що пригнічує ріст мікроорганізмів.

Проведення посіву з метою визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків методом серійних розведень на щільному поживному середовищі.

Алгоритм "Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків методом серійних розведень на щільному поживному середовищі":

виготовити мікробну суспензію 10⁷ мікробних клітин в 1 мл;

виготовити з основного розчину двократне розведення антибіотика в 10 пробірках [23];

поставити в штатив 10 пробірок, в яких міститься по 9,9 мл розплавленого й охолодженого до 45 °С МПА; пронумеруйте їх від 1 до 10,11-та пробірка — контроль середовища;

поставити перед штативом 11 стерильних порожніх чашок Петрі, підписати на кожній чашці номер аналізу, порядковий номер і кількість антибіотика (16 ОД, 8 ОД 4 ОД і т.д.); на 11-й чашці - "КС";

вилити з 1-ї пробірки розчин антибіотика в 1-шу пробірку з агаром, перемішти, вилити у 1-шу чашку Петрі;

вилити з 2-ї пробірки розчин антибіотика в 2-гу пробірку з агаром, перемішати, вилити у 2-гу чашку Петрі і т. д., до 10;

з 11-ї пробірки вилити МПА в 11-ту чашку Петрі, витримати до охолодження МПА;

зробити бактеріологічною петлею посів культури, що досліджується (у розведенні 10⁷ клітин мікроорганізмів и 1 мл), на 11 чашках Петрі штрихом;

поставити чашки Петрі в термостат догори дном на 16—20 год. (температура 37 °С).

Методика визначення результатів дослідження.

Урахування результатів починають з контрольної чашки, на якій повинен бути ріст культури. Потім розглядають дослідні чашки. Мінімальну пригнічувальну концентрацію антибіотика (МПК) визначають за останньою чашкою, в якій є повна затримка росту мікроорганізмів, і вказують її у відповіді.

РОЗДІЛ 3

ДОСЛІДЖЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ЗАСТОСУВАННЯ АНТИБІОТИКІВ

3.1 Дослідження ефективності застосування антибіотику лораксону та лоразидиму при обструктивних уропатіях у дітей

На сучасному етапі одним з обов'язкових компонентів в комплексному лікуванні гнійної хірургічної інфекції у дітей залишається антибактеріальна терапія. Затримка з застосуванням останньої значно підвищує ризик розвитку несприятливого виходу. Максимально більш раннє призначення антибіотиків широкого спектру дії особливо доцільно, коли мова йде про небезпеку генералізації інфекції. Саме цим визначений часто емпіричний, ще до ідентифікації виду збудника з вогнища запалення, вибір антибіотика. При госпіталізації хворого вибір антибактеріальних препаратів частіше грунтується на відомих і розповсюджених варіантах домінуючої бактеріальної чутливості при даній патології. Як показує клінічний досвід, зараз найбільш ефективними є цефалоспорини ІІІ покоління (лораксон, лоразидим). Застосування їх в якості монотерапії в максимальних вікових дозах виправдано у дітей будь-якого віку як при локальній інфекції м'яких тканин (флегмона, абсцес, лімфоаденіт), так і в якості стартової терапії при потенціально септичних станах (гострий гематогенний остеомієліт, гостра деструктивна пневмонія, перитоніт) [21]. Контролем ефективності антибактеріальної терапії служили традиційні загальноклінічні симптоми: зниження і нормалізація температури, покращення апетиту; місцеві: зменшення болю, набряку, інфільтрації, кількості гнійного виділення у вогнищі запалення; лабораторні критерії: зменшення лейкоцитозу і лейкоцитарного індексу, інтоксикації, швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ).

Серед нефроурологічної патології питома вага обструктивних уропатій у дітей сягає 10-15%. В останні роки висів Pseudomonasaeruginosa з сечі хворих складає 19%. Труднощі при проведенні антибактеріальної терапії ускладнень інфекцій сечовивідних шляхів пов'язані з порушенням уродинаміки, наявністю в сечовивідних шляхах чужорідних предметів (дренажів) в післяопераційному періоді, інвазивними діагностичними та лікувальними заходами. В цьому плані пошук нових підходів до антибактеріальної терапії дітей з обструктивними уропатіями є вельми актуальним [32]. Нами була вивчена ефективність застосування лораксону для лікування цієї патології. Під наглядом було 10 дітей у віці від 11 місяців до 5 років з обструктивним пієлонефритом обумовленим, в 7 випадках міхурово-сечовивідний рефлексом I-IІ ступеня, в 3 - обструктивним мегауретером. Всім дітям проведено обстеження, яке включало загальний аналіз сечі, крові, бактеріологічні обстеження сечі (до та після терапії). При бактеріологічному досліджені сечі виявлений широкий спектр мікроорганізмів (табл. 3.1).

Таблиця 3.1

Мікроорганізми, виділені з сечі хворих на

обструктивн і уропаті ї при надходженні до стаціонару

Обстежені нами діти були розподілені на 2 групи. Першу групу склали 5 дітей, яким антибактеріальна терапія проводилась лораксоном в дозі 50-100 мг/кг внутрішньом`язево(в/м) через 24 години за 3-4 дні до оперативного втручання та протягом 4-5 днів після операції. Другу групу склали 5 дітей, яким призначались інші цефалоспорини III покоління.

В першій групі дітей вже на перший день відмічалось зниження частоти загальних симптомів: лихоманки, болів в животі, суттєво знижувалась виразність сечового синдрому [32]. На 2 добу зникнення загальних симптомів відмічено практично у всіх дітей першої групи, тоді як в другій групі ця симптоматика зникала лише на 3-4 день лікування. Нормалізація бактеріологічних аналізів сечі у хворих, які отримували лораксон також наступала раніше, ніж при використанні інших антибіотиків.

Проведені спостереження показали, що позитивна клініко-лабораторна динаміка від початку лікування лораксоном і лоразидимом відмічається при локальній інфекції на 2,5±0,5 добу і 4,8±1,2 добу при тяжкому перебігу захворювання. Тривалість повного курсу лікування визначалася індивідуально з урахуванням клініко-лабораторного моніторинга і в середньому склав від 5,3±1,2 діб при місцевій до 12,6±2,4 діб при генералізованій хірургічній інфекції. У 28% дітей, хворих на гнійну хірургічну інфекцію при її тяжкому перебігу монотерапія лораксоном або лоразидимом була посилена комбінацією з аміноглікозидами. В жодному випадку в дослідній групі хворих не було відмічено побічних реакцій.

Таким чином, використання у дітей з обструктивними уропатіями лораксона в передопераційному та післяопераційному періодах призводить до більш ранньої санації сечі, нормалізації клініко-лабораторних показників на 1-2 добу раніше, ніж при звичайній антибіотикотерапії.

3.2 Дослідження чутливості збудників негоспітальних пневмоній дітей до деяких антибіотиків

В дослідження включали хворих лише за умови їх добровільної згоди батьків хворих дітей віком від 3 до 7 років з метою та об'ємом запланованих обстежень, необхідністю призначення антибактеріальної терапії та можливим ризиком виникнення її побічних ефектів. Основні критерїї включення пацієнтів у дослідження: наявність клінічних та рентгенологічних ознак пневмонїї, яка виникла у них в амбулаторних умовах та мала нетяжкий перебіг, який не зумовлював необхідність в госпіталізацїї; виділення хворим мокроти, яка відповідала критеріям доцільності проведення її мікробіологічного дослідження; а також відсутність попередньої антибактеріальної терапії [25]. Діагноз негоспітальної пневмонії (НП) нетяжкого перебігу встановлювали на основі аналізу даних клінічного, рентгенологічного та лабораторних методів досліджень.

Усі обстежені були поділені на 2 групи. До складу 1-ї групи дослідження включили 25 хворих на НП з нетяжким перебігом без наявності супутньої патологи та інших «модифікуючих» факторів. До 2-ї групи увійшли 25 хворих на НП з нетяжким перебігом з наявністю супутньої патології (хронічні обструктивні захворювання легень, ниркова та серцева недостатність, цереброваскулярні захворювання, цукровий діабет, хронічні захворювання печінки різної етіології, психічні розлади, хронічний алкоголізм) та/або інших «модифікуючих» факторів.

Для виявлення основних етіологічних агентів НП досліджували мокроту, яка була отримана після глибокого відкашлювання до прийому їжі та до початку проведення антибактеріальної терапії. Доцільність подальшого проведення мікробіологічного дослідження мокроти визначали за результатами аналізу забарвленого за Грамом мазка — наявність не менше 25 лейкоцитів та не більше 10 епітеліальних клітин в полі зору (X100). Кількісну оцінку мікробної популяцїї, яка вегетує в мокроті, проводили шляхом посіву на відповідні щільні поживні середовища.

Результати дослідження мокроти вважали діагностично значущими у разі виявлення потенційного патогену в титрі не нижче 10⁶ колонієутворюючих одиниць (КУО) в 1 мл [3].

При дослідженні мокроти та сироватки крові у 25 хворих 1-ї групи виділили 3 найбільш поширені штами етіопатогенів (табл. 3.2).

Таблиця 3.2

Видовий склад та кількість етіопатогенів НП у хворих 1-ї групи

Основним збудником НП у хворих цієї групи виступав Streptococcus рпеитопіае (у 59,2% випадків), з яких резистентними до пеніцилінів та амінопеніцилінів були 6,7% штамів, до захищених амінопеніцилінів — 4,4% (табл. 3.3).

Таблиця 3.3

Резистентність до антибактеріальних препаратів основних етіопатогенів НП у хворих 1-ї групи, %

Примітка: „-” - дослідження не проводилось

Ця стійкість зумовлена модифікацією пеніцилінзв'язуючого білка, який знаходиться в стінці клітини даного мікроорганізму. Привертає увагу наявність у цих штамів S. рпеитопіае асоційованої резистентності до макролідів та цефалоспоринів І покоління. Крім того, у 4,4% штамів S. рпеитопіае виявили стійкість до фторхінолонів IIпокоління. В той же час усі штами цього збудника були чутливими до фторхінолонів IIIпокоління (левофлоксацину) [5].

Менш поширеним збудником НП у таких хворих була Haemophilus influenzae— 7,9% випадків. Резистентними до пеніцилінів, амінопеніцилінів, цефалоспоринів І покоління та гентаміцину були 16,7% штамів цього збудника. У 2,6% пацієнтів НП була зумовлена Moraxella catarrhalis. Резистентними до пеніцилінів, амінопеніцилінів, еритроміцину та гентаміцину були 50,0% виділених штамів.

Основним механізмом резистентності виділених штамів Н. influenzaeта М. catarrhalisдо β-лактамних антибіотиків є вироблення β-лактамаз. Наведені результати дослідження свідчать, що S. рпеитопіае та


8-09-2015, 23:18