Заслуговують на увагу також результати хроматографічного розподілу білків сироватки крові хворого С-н. При дослідженні такої нефракціонованої сироватки методом РІА зв’язування її білків з 125 І-інсуліном було незначне (8,4-16,1 %), а при дослідженні методом ІФА вона вважалась позитивною. Останнє підтвердилось результатами поетапної хроматографії цієї сироватки крові: при незначній кількості білка в елюаті з інсулін-агарози (ОГ при l = 280 нм становила 0,085) у зразку чітко визначались ІА. Ці результати ще раз підтвердили, що при використанні методу РІА, враховуючи його особливості, існує ймовірність осадити разом з антитілами всі БЗІ, для виділення та дослідження яких слід застосувати спеціальні методичні підходи.
Таким чином, в результаті проведеної роботи з’ясовано, що використовуючи метод поетапної афінної хроматографії на сорбентах з інсуліном і білками А або G з сироваток крові донорів і хворих на ЦД можна виділити і дослідити низку білків, які мають властивість зв’язуватись з інсуліном. Запропонований спосіб може бути використаний для визначення співвідношень білків, що зв’язують інсулін у крові хворих на ЦД; та разом з визначенням ІА та ІАА опрацьованим імуноферментним методом це сприятиме глибшому розумінню можливої природи різних ускладнень, що виникають у хворих на ЦД в процесі лікування препаратами інсуліну.
Висновки
1. Вперше застосовано метод поетапної афінної хроматографії на сорбентах з інсуліном та білком А (або G) і продемонстровано його придатність для відокремлення антитіл до інсуліну від інших білків, що зв’язують інсулін в сироватках крові хворих на ЦД та здорових людей. Показано, що вміст білкових чинників, причетних до зв’язування інсуліну, в сироватках хворих на ЦД в 2,5 – 3 рази вищий, ніж у здорових людей.
2. Вперше в Україні розроблено метод гетерогенного твердофазного імуноферментного аналізу для визначення вмісту антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів у крові людей. Доведено його ефективність для виявлення ІА та ІАА, як в цільній сироватці крові людей, так і у складі білкових фракцій, виділених методом поетапної афінної хроматографії з цих сироваток.
3. Встановлено, що специфічність розробленого імуноферментного методу становить 90,9 %, а чутливість – 82,4 %; внутрішньосерійний коефіцієнт варіації складає 9,09 % для негативних зразків і 3,53 % для позитивних, а міжсерійний – 4,34 % для негативних зразків і 5,5 % для позитивних.
4. На основі розробленого методу створено вітчизняну імуноферментну тест-систему “ІФА-АТ-інс” та показано її придатність для виявлення ІА та ІАА при обстеженні здорових людей та хворих на ЦД.
5. За допомогою розробленої тест-системи проведено визначення антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів в сироватках крові здорових людей, та хворих на ЦД-1 і ЦД-2, які приймали таблетовані цукрознижуючі препарати, ін’єкції інсуліну або його аналогів. Відсоток осіб, у крові яких виявлено ІА або ІАА, у групі хворих на ЦД-1 дорівнював 10,96; у хворих на ЦД-2, лікованих інсуліном – 4,26; хворих на ЦД-2, які не отримували інсулін – 1,92. Серед донорів ІАА виявлено у однієї особи (0,52 % від загальної кількості обстежених).
6. Проведене порівняльне дослідження тест-системи “ІФА-АТ-інс” з імуноферментною комерційною системою “Anti-insulin ORG-520” виробництва фірми “ORGentech” (Німеччина), засвідчило її ефективність при визначенні антитіл до екзогенного (або ендогенного) інсуліну.
Список опублікованих праць за темою дисертації
Статті в наукових спеціалізованих виданнях
1. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко , Р.Г. Лукашова, Н.В. Іванська, Г.Є. Раєвська. Опрацювання методу імунофентного аналізу для визначення антитіл до інсуліну у сироватці крові здорових людей та хворих на цукровий діабет // Ендокринологія, 2003, Т. 8 , №1, С.24-30 (Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, підбір хворих, експериментальні дослідження (підбір оптимальних умов проведення імуноферментного аналізу), статистична обробка та узагальнення матеріалів, написання статті).
2. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко , П.М. Карабун, Р.Г. Лукашова, Н.В. Іванська. Порівняння розробленої імуноферментної тест-системи (“ІФА-АТ-інс”) з комерційними наборами для виявлення антиінсулінових антитіл у сироватках крові людей // Ендокринологія, 2003, Т. 8 , №2, С.158-168 (Автор самостійно здійснювала аналіз літератури, проводила порівняльні дослідження розробленої імуноферментної тест-системи „ІФА-АТ-інс” з комерційними наборами: імуноферментною тест-системою “Anti-insulin ORG-520” та радіоімунною – “Cis biointernational”).
3. В.В. Корпачев, Н.М. Гуріна, С.В. Мельниченко , Р.Г. Лукашова, А.А. Шупрович. Білки, що зв’язують інсулін, та контррецепторні білки сироватки крові хворих на цукровий діабет і здорових людей // Ендокринологія. - 2004.-Т.9.-№2.-С.221-235 (Автором здійснювалось написання фрагменту статті на підставі власних експериментальних досліджень сироваткових чинників, що блокують дію інсуліну (афінна хроматографія, електрофорез в поліакриламідному гелі).
4. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко , Р.Г. Лукашова, П.М. Карабун, Н.В. Іванська. Антигенність інсуліну та методи визначення антитіл до нього в сироватках крові здорових людей та хворих на цукровий діабет // Ендокринологія. - 2005.-Т.10.-№2.-С.206-223 (Автором самостійно здійснювався пошук літератури за темою, експериментальні дослідження (імуноферментне визначення вмісту антитіл), статистична обробка та узагальнення матеріалів, написання статті. ).
Статті в наукових виданнях
1. Р.Г. Лукашова, С.В. Мельниченко . Методы определения антител к инсулину. //В кн. В.В Корпачева: Инсулин и инсулинотерапия.- Киев, РИА «Триумф», 2001.- С.309-322 (Пошук літератури та її аналіз, оформлення).
2. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко , Р.Г. Лукашова, П.М. Карабун, Н.В. Іванська. Дослідження цукрознижувальної та антигенної властивостей Новорапіду – аналога людського інсуліну ультракороткої дії // Клінічна ендокринологія та ендокринна хірургія, 2004, №3 (8), С.46-52 (Автором здійснювались: аналіз літератури, експериментальні дослідження (визначення вмісту антитіл до інсуліну), участь у написанні статті).
3. С.В. Мельниченко , Н.В. Іванська, В.В. Корпачев. Патогенетичне значення антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів // Сімейна медицина. – 2005.- №3.- С.45-47 (Аналіз літератури, написання статті).
Тези доповідей на наукових конференціях і з’їздах
1. С.В. Мельниченко , В.В. Корпачев, Р.Г. Лукашова, О.А. Шевчук, Н.В. Іванська. Розробка методу визначення антитіл до інсуліну в сироватці крові людей на основі твердофазного імуноферментного аналізу // Ендокринологія, 2001, Т.6 (додаток), С. 194.
2. В.В.Корпачев, С.В. Мельниченко , Н.В.Иванская, Г.А.Раевская, Р.Г. Лукашова. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к инсулину в сыворотках крови людей // Материалы I съезда аллергологов Украины, 2002, С. 79.
3. В.В.Корпачев, Н.В.Иванская, С.В. Мельниченко , Р.Г.Лукашова, Г.Е. Раевская. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к инсулину // Укр. біохім. ж., 2002, 74, 4а (додаток 1), С.101-102.
4. С.В. Мельниченко . Розробка тест-системи для визначення антитіл до інсуліну в сироватці крові людей на основі твердофазного імуноферментного аналізу // Ендокринологія, 2002, Т. 7 , №1, С.142.
5. В.В. Корпачев, Н.М.Гурина, С.В. Мельниченко . Нарушение толерантности к глюкозе у крыс после введения инсулинсвязывающих белков из сыворотки крови интактных животных // Укр. біохім. журнал.- 2002.- Т.74, №4а (додаток 1).- С.147.
6. С.В. Мельниченко . Выделение и анализ инсулинсвязывающих белков сывороток крови больных сахарным диабетом // Укр. биохим. журнал.- 2006.- Т.2, (спец.выпуск).- С.88.
7. В.В. Корпачев, Н.В. Іванська, Р.Г. Лукашова, С.В. Мельниченко . Розробка та апробація імуноферментної тест-системи для виявлення антитіл до інсуліну //Вісник Вінницького держ. Мед. університету.- 2003.- №1-2.- с.57.
8. В.В. Корпачев, Р.Г. Лукашова, С.В. Мельниченко , П.М. Карабун. Визначення вмісту антитіл до інсуліну та дослідження інших інсулінзв’язуючих білків в сироватці крові хворих на цукровий діабет // Ендокринологія. - 2007.-Т.12 (додаток).-С.122.
Патент
1. В.В. Корпачев, Р.Г. Лукашова, С.В. Мельниченко , О.А. Шевчук, Н.В. Іванська, Г.Є. Раєвська, В.Г.Пилипенко. “Тест-система для виявлення аутоантитіл до ендогенного або антитіл до екзогенного інсулінів в сироватках та плазмі крові людей (ІФА-АТ-інс)” // Деклараційний патент на винахід 57640 А “Тест-система для виявлення аутоантитіл до ендогенного або антитіл до екзогенного інсулінів в сироватках та плазмі крові людей (ІФА-АТ-інс)” 16.06.2003.- бюл. №6.
Анотація
Мельниченко С.В. Виділення та характеристика білкових чинників, що зв’язують інсулін в крові людей, хворих на цукровий діабет. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю14. 01. 14 – ендокринологія. – Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, Київ, 2007 р.
Дисертаційну роботу присвячено дослідженню білкових чинників (БЗІ), які здатні зв’язувати інсулін в крові людей, хворих на цукровий діабет, і визначенню антитіл до ендогенного (ІА) або екзогенного (ІАА) інсулінів у складі цих білків.
Білки, що зв’язують інсулін в сироватках крові людей, виділяли методом афінної хроматографії на сорбенті інсулін-сефароза 4В. Отриманий матеріал в подальшому фракціонували на сорбенті білок G-сефароза 4В, відокремлюючи при цьому ІА та ІАА від інших білків, що блокують дію інсуліну. Всі отримані білкові фракції досліджували методом електрофорезу в поліакриламідному гелі. Вміст ІА та ІАА, як в нативних сироватках, так і в отриманих фракціях, визначали розробленим гетерогенним твердофазним імуноферментним методом. В результаті проведення поетапної афінної хроматографії сироваток крові хворих на ЦД та донорів показано, що кількість білкових фракцій в елюатах (як від донорських сироваток, так і від хворих на ЦД) коливається від 8 до 10. Співвідношення білків в окремих зразках різні, але кількість фракцій не залежить від того, з яких сироваток – від здорових людей чи від хворих на ЦД – виділено ці білки.
На основі опрацьованого гетерогенного твердофазного імуноферментного методу визначення ІА та ІАА створено тест-систему “ІФА-АТ-інс”. Проведено порівняльне дослідження тест-системи “ІФА-АТ-інс” з імуноферментною комерційною системою “Anti-insulin ORG-520” виробництва фірми “ORGentech” (Німеччина) засвідчило її ефективність при виявленні антитіл до екзогенного (або ендогенного) інсуліну як у нативних сироватках, так і в складі білкових фракцій, виділених методом поетапної афінної хроматографії з сироваток крові людей. Використання методу поетапної афінної хроматографії і дослідження вмісту ІА та ІАА в отриманих елюатах дозволило пояснити розбіжності в результатах визначення цих антитіл методами імуноферментного та радіоімунного (РІА) аналізів. Причиною такого явища може бути те, що в РІА, для вилучення комплексів 125 І-інсуліну з ІА або ІАА використовують поліетиленгліколь. Останній, крім антитіл до інсуліну, здатен осаджувати також й інші БЗІ і тим самим, призводити до завищення результатів визначення ІА та ІАА.
Ключові слова: цукровий діабет, інсулін, антитіла до інсуліну; білки, що зв’язують інсулін, імуноферментний аналіз.
Аннотация
Мельниченко С.В. Выделение и характеристика белковых факторов, связывающих инсулин в крови людей, больных сахарным диабетом. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14. 01. 14 – эндокринология. – Институт эндокринологии и обмена веществ им. В.П.Комиссаренко АМН Украины, Киев, 2007 г.
Диссертационная работа посвящена выделению и исследованию белков, связывающих инсулин в крови больных сахарным диабетом и доноров, а также определению содержания антител к эндогенному (ИА) или экзогенному (ИАА) инсулину, входящих в состав этих белков.
Одной из причин снижения эффективности инсулинотерапии при лечении больных сахарным диабетом (СД) может быть блокирование связывания инсулина с его рецептором веществами, имеющими сродство к инсулину. Наиболее известны среди них ИА и ИАА. Роль других факторов, участвующих в этом процессе, изучена недостаточно. В работе предложен методический подход, обеспечивающий извлечение из сывороток крови людей различных фракций инсулинсвязывающих белков и анализ этих белков.
Исследуемые белки выделяли методом поэтапной аффинной хроматографии сывороток крови на сорбенте, содержащем инсулин-сефарозу 4В, с последующим фракционированием полученного материала на сорбенте белок G-сефарозе 4В. Применение последнего направлено на отделение ИА и ИАА от других белков, блокирующих действие инсулина в крови людей. Все выделенные белковые фракции исследовали методом электрофореза в полиакриламидном геле. Содержание ИА и ИАА как в полученных фракциях, так и в цельных сыворотках, определяли разработанным методом гетерогенного твердофазного иммуноферментного анализа. Показано, что количество белковых фракций в элюатах полученных с инсулинового сорбента колеблется (8-10) и, что существует разница в количественном соотношении белков в отдельных образцах.
На основе разработанного иммуноферментного метода определения ИА и ИАА создана тест-система “ИФА-АТ-инс”. Сравнение ее с иммуноферментной коммерческой тест-системой “Anti-insulin ORG-520” производства фирмы “ORGentech” (Германия) показало ее эффективность.
Использование метода поэтапной аффинной хроматографии и определения содержания ИА и ИАА в полученных элюатах позволило объяснить несоответствия при определении содержания антител к инсулину в отдельных сыворотках крови больных СД при исследовании их методами иммуноферментного и радиоиммунного анализов. Причиной этого, может быть то, что в радиоимунных наборах, для извлечения комплексов 125 І-инсулина с ИА и ИАА используют полиэтиленгликоль. Последний, кроме антител к инсулину, способен осаждать также и другие инсулинсвязывающие белки и тем самым, приводить к завышению результатов определения ИА и ИАА.
Тест-система “ИФА-АТ-инс” использована для определения содержания ИА и ИАА в сыворотках крови 438 больных СД типа 1 (СД-1), 188 больных СД типа 2 (СД-2), леченных инсулином, 104 больных СД-2, не получавших инсулин, и 194 доноров. В группе больных СД-1 ИА и ИАА выявлены у 10,96 % лиц; среди больных СД-2, леченных инсулином – 4,26 %; у больных СД-2, не получавших инсулин – 1,92 %. В группе доноров ИАА выявлены у одного человека (0,52 % от общего количества обследованных). Кроме того, тест-систему “ИФА-АТ-инс” использовали для обследования 110 детей в возрасте от 5 до 18 лет. Среди них 35 детей входили в группу риска заболевания СД-1 (СД у них болели ближайшие родственники), 30 детей болели СД-1 и 65 здоровых детей, соответствующего возраста. ИАА выявлены у 5,71 % детей, входящих в группу риска, ИА – у 16,67 % детей, болеющих СД-1. У здоровых детей ИАА не выявлены.
Ключевые слова: сахарный диабет, инсулин, антитела к инсулину, инсулинсвязывающие белки, иммуноферментный анализ.
Summary
Melnychenko S. V. – Isolation and characterization of insulin-binding protein factors in blood of diabetic patients. – Manuscript.
The thesis for scientific degree of the Candidate of Biological Sciences in specialty 14.01.14 - endocrinology. - V.Р. Komisarenko Institute of Endocrinology and Metabolism, Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine, 2007.
The thesis deals devoted to studying of serum factors participating in insulin binding process in blood of diabetic patients as well as the investigating of antibody levels against endogenous (IA) and exogenous (IAA) insulin which is present among these factors.
Insulin-binding proteins (IBP) of human blood serum were obtained by using an affine chromatography approach. Sepharose 4B-insulin was used as a sorbent. Preparations from this sorbent were then fractioned on protein G-Sepharose sorbent which permitted to separate the IAA from other insulin-blocking proteins. Both IAA levels as native serum as obtained fractions were evaluated by a heterogenic solid-phase enzyme-linked immunoassay approach (ELISA) elaborated by the author. The results of step-by-step chromatography of blood serum from diabetic patients and donors showed that the quantity of fractions in both groups was the same (8-10), but ratios of insulin-binding components in these fractions were different in these preparations.
A new ELISA-based IAA-evaluating test-system – “IFA-AT-ins” – was elaborated. The author performed a comparative study of the “IFA-AT-ins” and a popular commercial test-kit “Anti-insulin ORG-520” (ORGentech, Germany). The results obtained without any doubt that demonstrate the “IFA-AT-ins” has a high effectiveness for estimation of both IA and IAA levels in native human serum as well as in protein fractions isolated by using the step-by-step chromatography. The last approach permitted to explain the absence of concordance in blood serum samples of patients with diabetes IA and IAA levels estimation of some in following study of the same samples using the ELISA and radioimmune assay.
Key words: diabetes mellitus, insulin, insulin-binding proteins, insulin antibodies, insulin autoantibodies, ELISA, radioimmune assay.
Перелік умовних позначень
| БЗІ | білки, що зв’язують інсулін; |
| ГЗ | граничне значення в системі; |
| ІА | антитіла до екзогенного інсуліну; |
| ІАА | антитіла до ендогенного інсуліну; |
| I нс. | інсулін; |
| ІФА | імуноферментний аналіз; |
| КВ | коефіцієнт варіації. |
| МКА | моноклональні антитіла; |
| ОГ | оптична густина; |
| ОФД | о -фенілендіамін; |
| ПААГ | поліакриламідний гель; |
| ПКА | поліклональні антитіла; |
| РІА | радіоімунний аналіз; |
| ТМБ | 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин; |
| ЦД | цукровий діабет; |
| ЦД-1 | цукровий діабет 1-го типу; |
| ЦД-2 | цукровий діабет 2-го типу; |
8-09-2015, 23:22