Проводят биологические испытания на животных (кошки, собаки, кролики, лягушки и др.), отдельных изолированных органах (рог матки, часть кожи), отдельных группах клеток (форменные элементы крови), а также на определенных штаммах микроорганизмов. Активность препаратов выражают в единицах действия (ЕД).

Биологический контроль лекарств, содержащих сердечные гликози- ды. По ГФ XI проводят биологическую оценку активности лекарственного растительного сырья и полученных из него препаратов, содержащих сердечные гликозиды, в частности наперстянки (пурпурной, крупноцветковой и шерстистой), горицвета, ландыша, строфанта, желтушника серого. Испытания проводят на лягушках, кошках и голубях, устанавливая соответственно лягушачьи (ЛЕД), кошачьи (КЕД) и голубиные (ГЕД) единицы действия. Одна ЛЕД соответствует дозе стандартного образца, вызывающего в условиях опыта систолическую остановку сердца у большинства подопытных стандартных лягушек (самцы массой 28—33 г). Одна КЕД или ГЕД соответствует дозе стандартного образца или испытуемого препарата из расчета на 1 кг массы животного или птицы, вызывающего систолическую остановку сердца кошки или голубя. Содержание ЕД рассчитывают в 1,0 г исследуемого лекарственного средства, если испытывают растительное сырье или сухие концентраты; в одной таблетке или в 1 мл, если испытывают жидкие лекарственные формы.

Испытание на токсичность. В этот раздел ГФ XI, вып. 2 (с. 182) по сравнению с ГФ X внесен ряд дополнений и изменений, отражающих возрастающие требования к качеству лекарственных средств и необходимость унификации условий их испытаний. В статью введен раздел, в котором описан порядок отбора проб. Увеличена масса животных, на которых проводят испытание, указаны условия их содержания и срок наблюдения за ними. Для выполнения испытания отбирают по два флакона или ампулы от каждой серии, содержащей не более 10000 флаконов или ампул. Из партий с большим количеством отбирают по три ампулы (флакона) от каждой серии. Содержимое проб одной серии смешивают и испытывают на здоровых белых мышах обоего пола массой 19—21 г. Испытуемый раствор вводят в хвостовую вену пяти мышей и ведут наблюдение за животными 48 ч. Препарат считается выдержавшим испытание, если ни одна из подопытных мышей не погибнет в течение указанного срока. В случае гибели даже одной мыши испытание повторяют по определенной схеме. В частных статьях может быть указан и другой порядок проведения испытания на токсичность.

Испытания на пирогенность. Бактериальные пирогены представляют собой вещества микробного происхождения, способные вызвать у человека и теплокровных животных при попадании в кровяное русло повышение температуры тела, лейкопению, падение кровяного давления и другие изменения в различных органах и системах организма. Пирогенную реакцию вызывают грамотрицательные живые и мертвые микроорганизмы, а также продукты их распада. Допустимо содержание, например, в изотоническом растворе натрия хлорида 10 микроорганизмов в 1 мл, а при введении не более 100 мл допускается 100 на 1 мл. Испытанию на пирогенность подвергают воду для инъекций, инъекционные растворы, иммунобиологические лекарственные средства, растворители, используемые для приготовления инъекционных растворов, а также лекарственные формы, вызывающие, по сведениям клиник, пирогенную реакцию.

В ГФ XI, как и в фармакопеи других стран мира, включен биологический метод испытания пирогенности, основанный на измерении температуры тела кроликов после введения в ушную вену испытуемых стерильных жидкостей. Отбор проб проводится так же, как при испытании на токсичность. В общей статье (ГФ XI, вып. 2, с. 183—185) указаны требования к подопытным животным и порядок их подготовки к проведению испытаний. Испытуемый раствор проверяют на трех кроликах (не альбиносах), масса тела которых отличается не более чем на 0,5 кг. Температуру тела измеряют, вводя термометр в прямую кишку на глубину 5—7 см. Испытуемые жидкости считают непирогенными, если сумма повышенной температуры у трех кроликов равна или меньше 1,4°С. Если эта сумма превышает 2,2°С, то воду для инъекций или инъекционный раствор считают пирогенными. Если сумма повышения температуры у трех кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,2° С, испытание повторяют дополнительно на пяти кроликах. Испытуемые жидкости считают непирогенными, если сумма повышений температуры у всех восьми кроликов не превышает 3,7°С. В частных ФС могут быть указаны другие пределы отклонений температуры. Кроликов, бывших в опыте, можно использовать для этой цели повторно не ранее чем через 3 сут., если введенный им раствор был непирогенным. Если же введенный раствор оказался пирогенным, то кроликов повторно можно использовать только через 2—3 недели. В ГФ XI по сравнению с ГФ X введена проверка на реактивность кроликов, впервые используемых для испытаний, и уточнен раздел о возможности их использования для повторных испытаний.

Рекомендуемый ГФ XI биологический метод отличается специфичностью, но не дает количественной оценки содержания пирогенных веществ. К существенным его недостаткам следует отнести трудоемкость и продолжительность испытаний, необходимость содержания животных, ухода за ними, сложность подготовки к проведению испытаний, зависимость результатов от индивидуальных особенностей каждого животного и т.д. Поэтому предпринимались попытки разработки других методов определения пирогенности.

Наряду с определением пирогенности на кроликах за рубежом используют микробиологический метод, основанный на подсчете общего числа микроорганизмов в исследуемой лекарственной форме до ее стерилизации. В нашей стране предложена простая и доступная методика обнаружения пирогенов, основанная На избирательной идентификации грамотрицательных микроорганизмов по реакции образования геля с применением 3%-ного раствора гидроксида калия. Методика может быть использована на химико-фармацевтических предприятиях.

Предпринята попытка заменить биологический метод определения пирогенности химическим. Растворы, содержащие пирогены, после обработки хиноном показывали отрицательную реакцию с тетрабромфенолфталеином. Пирогенал с триптофаном в присутствии серной кислоты образует буро-малиновое окрашивание при содержании пирогенала 1 мкг и более.

Исследовалась возможность спектрофотометрического определения пирогенных веществ в УФ-области спектра. Растворы фильтрата пирогенсодержащих культур микроорганизмов обнаруживают слабовыраженный максимум поглощения при 260 нм. По чувствительности спектрофотометрический метод определения пирогенов в 7-8 раз уступает биологическому испытанию на кроликах. Однако если перед спектрофотометрированием провести ультрафильтрование, то вследствие концентрирования пирогенов можно достигнуть сопоставимых результатов определения биологическим и спектрофотометрическим методами.

После обработки хиноном растворы пирогенов приобретают красную окраску и появляется максимум светопоглощения при 390 нм. Это позволило разработать фотоколориметрический способ определения пирогенов.

Высокая чувствительность люминесцентного метода создала предпосылки использования его для определения пирогенных веществ в концентрации до 1*10^-11 г/мл. Разработаны методики люминесцентного обнаружения пирогенов в воде для инъекций и в некоторых инъекционных растворах с применением красителей родамина 6Ж и 1-анилино-нафталин-8-сульфоната. Методики основаны на способности пирогенов увеличивать интенсивность люминесценции указанных красителей. Они позволяют получать результаты, сопоставимые с биологическим методом.

Относительная ошибка спектрофотометрического и люминесцентного определения не превышает ±3%. Для определения пирогенности воды для инъекций используют также хемилюминесцентный метод.

Перспективным методом является полярография. Установлено, что фильтраты пирогенных культур даже в очень разбавленном состоянии оказывают сильное подавляющее действие на полярографический максимум кислорода. На этой основе разработан способ полярографической оценки качества воды для инъекций и некоторых инъекционных растворов.

Испытание на содержание веществ гистаминоподобного действия.

Данному испытанию подвергают парентеральные лекарственные средства. Выполняют его на кошках обоего пола массой не менее 2 кг под уретановым наркозом. Вначале животному, находящемуся под наркозом, вводят гистамин, проверяя его чувствительность к этому веществу. Затем с интервалом 5 мин продолжают повторные введения (0,1 мкг/кг) стандартного раствора гистамина до тех пор, пока при двух последовательных введениях не будет получено одинаковое снижение артериального давления, которое принимается за стандартное. После этого с интервалом 5 мин животному вводят испытуемый раствор с той же скоростью, с которой вводили гистамин. Препарат считают выдержавшим испытание, если снижение артериального давления после введения тест-дозы не превышает реакции на введение 0,1 мкг/кг в стандартном растворе.

5.2 Микробиологический контроль лекарственных средств

Впервые в ГФ XI включен новый вид биологического контроля — определение микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств, т.е. установление состава и количества имеющейся в препарате микрофлоры и ее соответствие нормам, ограничивающим микробную обсемененность (контаминацию). Патогенные микроорганизмы (синегнойная палочка, кишечные бактерии) способны находиться в таблетках и гранулах от 6 до 18 мес., сохраняя морфологические и биохимические свойства. Микробиологическая чистота нестерильных лекарственных средств находится в зависимости от санитарно-гигиенических условий производства, дополнительной обработки сырья с целью его деконтаминации и состояния микробиологического контроля ОТК на всех этапах производства.

Испытание на микробиологическую чистоту. Необходимость проведения этого испытания вызвана тем, что лекарственные средства, в том числе выпускаемые в виде таких лекарственных форм, как таблетки, капсулы, гранулы, растворы, сиропы, мази, не стерилизуются в процессе производства. Поэтому они могут быть загрязнены микроорганизмами. Испытание включает количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов и выявление некоторых видов микроорганизмов, представителей кишечной флоры и стафилококка, содержание которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах.

Выполняют испытание на микробиологическую чистоту в асептических условиях. В общей статье подробно описаны методы и питательные среды для контроля всех видов нестерильных лекарственных средств (ГФ XI, вып. 2, с. 193). Количественное определение микроорганизмов выполняют двухслойным агаровым методом в чашках Петри. Образец лекарственного средства в количестве 10 г (мл) растворяют, суспендируют или эмульгируют в фосфатном буферном растворе (рН 7,0) с таким расчетом, чтобы конечный объем раствора был 100 мл. Затем по 1 мл образца смешивают с питательной средой (4 мл).

Через 5 сут инкубирования при 30—35° С подсчитывают число бактериальных колоний на двух чашках и вычисляют число бактерий в 1 г (мл) образца.

Испытания на стерильность. Целью этого испытания является доказательство отсутствия в лекарственном средстве жизнеспособных микроорганизмов любого вида с максимально возможной достоверностью. Результаты испытания на стерильность — один из важнейших показателей безопасности лекарственных средств.

Этому испытанию подвергаются все лекарства для парентерального введения, глазные капли и мази, лекарства, наносимые на открытую рану, и др. Эффективность данного вида контроля определяют такие факторы, как отбор образца для анализа, техника посева лекарственного средства, состав питательных сред, время инкубации йосевов, интерпретация и учет результатов испытания.

Приведенные в общей статье на стерильность (ГФ XI, вып.2, с. 187) методы контроля применяют для испытаний всех лекарственных средств независимо от их химической природы и лекарственной формы, если нет других указаний в частных статьях.

Для установления стерильности лекарства вначале определяют его антимикробное действие. Для контроля стерильности применяют биогликолевую среду и жидкую среду Сабуро, используя при этом метод прямого посева на питательные среды. Если лекарственное средство обладает выраженным антимикробным действием или разлито в емкости более 100 мл, то для контроля его стерильности используют метод мембранной фильтрации. Испытание выполняют на фильтрационной установке, включающей фильтродержатель с мембранным фильтром и колбу-приемник.

Метод мембранной фильтрации включен во многие зарубежные фармакопеи, как основной для проведения стерилизации. Несмотря на отдельные недостатки, этот метод имеет целый ряд преимуществ в отличие от прямого посева. Он устраняет антимикробное действие препаратов, которое при прямом посеве может исказить результаты определения, дает возможность исследовать большие объемы лекарственного средства, сократить время инкубации посевов, экономить питательные среды и т.д.

Выводы

Одна из наиболее важных задач фармацевтической химии — это разработка и совершенствование методов оценки качества лекарственных средств.

Для установления чистоты лекарственных веществ используют различные физические, физико-химические, химические методы анализа или их сочетание. ГФ предлагает следующие методы контроля качества ЛC.

Физические и физико-химические методы. К ним относятся:

· определение температур плавления и затвердевания, а также температурных пределов перегонки;

· определение плотности,

· определение показателей преломления (рефрактометрия),

· определение оптического вращения (поляриметрия);

· спектрофотометрия (ультрафиолетовая, инфракрасная);

· фотоколориметрия,

· эмиссионная и атомно-абсорбционная спектрометрия,

· флуориметрия,

· спектроскопия ядерного магнитного резонанса,

· масс-спектрометрия;

· хроматография (адсорбционная, распределительная, ионообменная, газовая, высокоэффективная жидкостная);

· электрофорез (фронтальный, зональный, капиллярный);

· электрометрические методы (потенциометрическое определение рН, потенциометрическое титрование, амперометрическое титрование, вольтамперометрия).

Кроме того, возможно применение методов, альтернативных фармакопейным, которые иногда имеют более совершенные аналитические характеристики (скорость, точность анализа, автоматизация). В некоторых случаях фармацевтическое предприятие приобретает прибор, в основе использования которого лежит метод, еще не включенный в Фармакопею (например, метод рамановской спектроскопии — оптический дихроизм). Иногда целесообразно при определении подлинности или испытании на чистоту заменить хроматографическую методику на спектрофотометрическую. Фармакопейный метод определения примесей тяжелых металлов осаждением их в виде сульфидов или тиоацетамидов обладает рядом недостатков. Для определения примесей тяжелых металлов многие производители внедряют такие физико-химические методы анализа, как атомно-абсорбционная спектрометрия и атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно связанной плазмой.

Важной физической константой, характеризующей подлинность и степень чистоты ЛC, является температура плавления. Чистое вещество имеет четкую температуру плавления, которая изменяется в присутствии примесей. Для веществ, которые плавятся с разложением, обычно указывается температура, при которой вещество разлагается и происходит резкое изменение его вида.

В некоторых частных статьях ГФ X рекомендуется определять температуру затвердевания или температуру кипения (по ГФ XI — "температурные пределы перегонки") для ряда жидких ЛC. Температура кипения должна укладываться в интервал, приведенный в частной статье. Более широкий интервал свидетельствует о присутствии примесей.

Во многих частных статьях ГФ X приведены допустимые значения плотности, реже вязкости, подтверждающие подлинность и доброкачественность ЛC.

Практически все частные статьи ГФ X нормируют такой показатель качества ЛC, как растворимость в различных растворителях. Присутствие примесей в ЛBможет повлиять на его растворимость, снижая или повышая ее в зависимости от природы примеси.

Критериями чистоты являются также цвет ЛBи/или прозрачность жидких лекарственных форм.

Определенным критерием чистоты JICмогут служить такие физические константы, как показатель преломления луча света в растворе испытуемого вещества (рефрактометрия) и удельное вращение, обусловленное способностью ряда веществ или их растворов вращать плоскость поляризации при прохождении через них плоскополяризованного света (поляриметрия). Методы определения этих констант относятся к оптическим методам анализа и применяются также для установления подлинности и количественного анализа ЛС и их лекарственных форм.

Важным критерием доброкачественности целого ряда ЛС является содержание в них воды. Изменение этого показателя (особенно при хранении) может изменить концентрацию действующего вещества, а, следовательно, и фармакологическую активность и сделать ЛС не пригодным к применению.

Химические методы. К ним относятся: качественные реакции на подлинность, растворимость, определение летучих веществ и воды, определение содержания азота в органических соединениях, титриметрические методы (кислотно-основное титрование, титрование в неводных растворителях, комплексонометрия), нитритометрия, кислотное число, число омыления, эфирное число, йодное число и др.

Биологические методы. Биологические методы контроля качества ЛС весьма разнообразны. Среди них испытания на токсичность, стерильность, микробиологическую чистоту.

Для проведения физико-химического анализа полупродуктов, субстанций лекарственных средств и готовых лекарственных форм при проверке их качества на соответствие требованиям ФС контрольно-аналитическая лаборатория должна быть оснащена следующим минимальным набором оборудования и приборов:

· ИК-спектрофотометр (для определения подлинности); спектрофотометр для спектрометрии в видимой и УФ-области (определение подлинности, количественное определение, однородность дозирования, растворимость);

· оборудование для тонкослойной хроматографии (ТСХ) (определение подлинности, родственных примесей);

· хроматограф для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (определение подлинности, количественное определение, определение родственных примесей, однородности дозирования, растворимости);

· газожидкостной хроматограф (ГЖХ) (содержание примесей, определение однородности дозирования);

· поляриметр (определение подлинности, количественное определение);

· потенциометр (измерение рН, количественное определение);

· атомно-абсорбционный спектрофотометр (элементный анализ тяжелых металлов и неметаллов);

· титратор К. Фишера (определение содержания воды);

· дериватограф (определение потери массы при высушивании).

Список использованной литературы

1. Арзамасцев А.П. Фармакопейный анализ – М.: Медицина, 1971.

2. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 частях. Часть 1. Общая фармацевтическая химия: Учеб. для фармац. ин-тов и фак. мед. ин-тов. — М.: Высш. шк., 1993. - 432 с.

3. Глущенко Н. Н. Фармацевтическая химия: Учебник для студ. сред. проф. учеб. заведений / Н. Н. Глущенко, Т. В. Плетенева, В. А. Попков; Под ред. Т. В. Плетеневой. — М.: Издательский центр "Академия", 2004. — 384 с.

4. Драго Р. Физические методы в химии – М.: Мир, 1981

5. Кольтгоф И.М., Стенгер В.А. Объемный анализ В 2 томах – М.: Государственное научно-техническое издательство химической литературы, 1950

6. Коренман И.М. Фотометрический анализ – М.: Химия, 1970

7. Коростелев П. П, Фотометрический и комплексометрический анализ в металлургии – М.: Металлургия, 1984, 272 с.

8. Логинова Н. В., Полозов Г. И. Введение в фармацевтическую химию: Учеб. пособие – Мн.: БГУ, 2003.-250 с.

9. Мелентьева Г. А., Антонова Л. А. Фармацевтическая химия. — М.: Медицина, 1985.— 480 с.

10. Мискнджьян С.П. Кравченюк Л.П. Полярография лекарственных препаратов. – К.: Вища школа, 1976. 232 с

11. Фармацевтическая химия: Учеб. пособие / Под ред. Л.П.Арзамасцева. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 640 с.

12. Фармацевтический анализ лекарственных средств / Под общей редакцией В.А.Шаповаловой – Харьков: ИМП "Рубикон", 1995

13. Фармацевтичний аналіз: Навч. посіб. для студ. вищ. фармац. навч. закл. III—IV рівнів акредитації/П.О. Безуглий, В. О. Грудько, С. Г. Леонова та ін.; За ред. П.О. Безуглого,— X.: Вид-во НФАУ; Золоті сторінки, 2001.— 240 с.

14. Халецкий A.M. Фармацевтическая химия – Ленинград: Медицина, 1966