Прогресс генетической инженерии во многом обусловлен получением новых специализированных векторов. Для клонирования (размножения) сравнительно небольших фрагментов ДНК длиной до 10 тыс. пар нуклеотидов используют плазмидные векторы. Фрагменты ДНК длиной до 10-25 тыс. пар нуклеотидов клонируют с помощью векторов, полученных на основе фага лямбда. Гибридный геном такого фага, содержащий фрагмент чужой ДНК, искусственным путем «упаковывают» в белковую оболочку и этим реконструированным фагом заражают бактерии. Гибридный фаг при размножении лизирует клетку, образуя несколько тысяч копий, которые выделяются в культуральную среду. Для клонирования фрагментов ДНК длиной до 35-45 тыс. пар нуклеотидов используют космидные векторы, представляющие собой гибрид фага лямбда и плазмиды. Космиды содержат так называемые COS-последовательности ДНК фага, необходимые для упаковки геномов фага в белковую оболочку, и участок ДНК плазмиды, позволяющий космидным векторам размножаться в бактериях, не лизируя их. Для клонирования небольших фрагментов ДНК длиной до 300-400 пар нуклеотидов в качестве векторов используют производные геномов фагов с однонитевой молекулой ДНК. Вектор, несущий чужеродную ДНК, вводят в бактериальную клетку, где эти гибридные фаги размножаются, не лизируя клетку-хозяина, и «отпочковываются» в культуральную среду как вирусные частицы с однонитевой молекулой ДНК.
Сравнивая структуру фрагментов геномной ДНК и соответствующей клонированной ДНК-копии (кДНК), получают важную информацию об организации генетического материала, а в случае наследственных болезней – о характере аномалий в клонированном генетическом материале, следствием которых и является это заболевание. Созданы полные библиотеки генов многих микроорганизмов, растений и животных (вплоть до млекопитающих и человека). Клонировано и в той или иной мере изучено около 1000 генов и других последовательностей нуклеотидов ДНК человека[6] .
Возможности генетической инженерии не ограничиваются клонированием гена и получением большого числа его копий. Часто необходимо обеспечить экспрессию гена в клетке, т.е. реализовать заключенную в нем генетическую информацию. Если вводимый в бактериальную клетку ген получен из бактерий той же (или близкой) видовой принадлежности, то достаточно выделить ген с его собственными регуляторными элементами, контролирующими экспрессию. Однако, если не считать нескольких исключений, регуляторные нуклеотидные последовательности эволюционно далеких друг от друга организмов не являются взаимозаменяемыми. Поэтому, чтобы добиться, например, экспрессии гена высших организмов в клетках Е, coli, у него удаляют регуляторную область, а структурную часть такого гена присоединяют (на определенном расстоянии) к регуляторной области бактериального гена.
Существенный прогресс в разработке этой методики был достигнут после открытия фермента нуклеазы BAL31, которая обладает уникальным свойством удалять с конца фрагмента ДНК «лишние» последовательности нуклеотидов любой протяженности. В настоящее время структурную и регуляторную области выделяют порознь с помощью тех рестриктаз, участки «узнавания» которых расположены наиболее удачно на полинуклеотидной цепи. Затем убирают «лишние» нуклеотидные последовательности и соединяют структурную область гена высшего организма (эукариотического гена) с регуляторной областью бактериального гена. Таким путем удается добиться не только экспрессии генов эукариотов в бактериальных клетках, но и, наоборот, бактериальных генов в клетках высших и низших эукариотов. В качестве реципиентов эффективно используют не только бактериальные клетки, но и клетки высших организмов[7] .
С помощью методов генетической инженерии были обнаружены отклонения в строении определенных участков генов человека, которые являются причиной наследственных болезней. Чаще всего таким методом служит так называемый блот-анализ. Выделенную клеточную ДНК подвергают расщеплению рестриктазой, полученные фрагменты разделяют по величине с помощью электрофореза. Однотипные фрагменты ДНК инкубируют с ранее клонированным геном (или его частью) либо с полученной путем химического синтеза последовательностью нуклеотидов, содержащих радиоактивную метку. Меченая ДНК связывается только с теми фрагментами анализируемой клеточной ДНК, которые имеют комплементарные ей последовательности нуклеотидов/
Изменение распределения и количества фиксированной метки по сравнению с нормой позволяет судить о перестройках в анализируемом гене или в близлежащих к нему последовательностях нуклеотидов. Участки «узнавания» определенных рестриктаз в молекуле ДНК располагаются неравномерно, поэтому при расщеплении этими ферментами молекула ДНК распадается на ряд фрагментов различной длины (так называемые рестрикционные фрагменты). Перестройка структуры ДНК, в результате которой исчезают имевшиеся или появляются новые участки «узнавания». приводит к изменению набора этих фрагментов, т.е. к появлению полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Перестройки в молекуле ДНК могут вызывать или не вызывать изменения в процессе синтеза или в структуре кодируемого белка; перестроек, не вызывающих изменений, большинство, и они служат причиной нормального ПДРФ. Выяснилось, что ПДРФ является четким генетическим признаком. Для ряда наследственных болезней описаны формы ПДРФ, прямо свидетельствующие о наличии заболевания или о носительстве патологически измененного гена. В настоящее время анализ ПДРФ стал одним из наиболее точных методов, используемых в генетике человека и медицинской генетике.
Генетическая инженерия положила начало новому направлению исследований, получившему название «генетика наоборот». Традиционный генетический анализ проводят в следующей последовательности: выбирается признак, устанавливается связь признака с генетической детерминантой и локализация этой детерминанты по отношению к уже известным. В «генетике наоборот» все происходит в обратном порядке. Из набора клонированных участков генома (или кДНК) с неизвестной функцией, характеризующихся определенным ПДРФ, выделяют те из них, которые наиболее тесно сцеплены с конкретным признаком. Если признаком является наследственное заболевание, с помощью выявления тесно сцепленного с ним полиморфного фрагмента можно осуществить диагностику этого заболевания по наличию той или иной формы ПДРФ. Этот подход позволил разработать методы ранней пренатальной диагностики, выявления носителей патологического гена в семьях даже для таких заболеваний, как хорея Гентингтона, болезнь Дюшенна, муковисцидоз, природа генетических дефектов при которых была абсолютно не известна. Затем можно точно определить положение соответствующего гена на хромосоме, выделить и проанализировать не только ген, но и продукты его так называемой экспрессии (мРНК и белок) в норме и при патологии. Полностью принципиальная схема «генетики наоборот» успешно реализована в случае болезни Дюшенна, муковисцидоза.
На пути внедрения в медицинскую практику методов, используемых в генетической инженерии, еще много трудностей технического порядка. Во многих лабораториях мира активно ведется разработка практически пригодных генно-инженерных диагностических методов, и можно надеяться, что такого рода методы уже в ближайшем будущем найдут применение для выборочного обследования групп повышенного риска в отношении наследственных болезней.
Практическое значение генетической инженерии для медицины связано с перспективами исправления наследственных дефектов у человека, создания и использования микроорганизмов, потерявших свою патогенность, но сохранивших способность к формированию иммунитета. Разработаны методы синтеза антибиотиков, аминокислот, гормонов, витаминов, ферментов и т.д., основанные на использовании микроорганизмов, включивших соответствующие гены.
Генетическая инженерия позволяет не только копировать природные соединения и процессы, но и модифицировать их, делать их более эффективными. Примером этого может служить новое направление исследований, названное белковой инженерией. Расчеты, производимые на основании данных об аминокислотной последовательности и пространственной организации молекул белков, показывают, что при определенных заменах некоторых аминокислотных остатков в молекулах ряда ферментов возможно значительное усиление их ферментативной активности. В изолированном гене, кодирующем синтез конкретного фермента, методами генетической инженерии проводят строго контролируемую замену определенных нуклеотидов. При синтезе ферментного белка под контролем такого модифицированного гена происходит заранее спланированная замена аминокислотных остатков в полипептидной цепи, что вызывает повышение ферментативной активности модифицированного фермента во много раз по сравнению с активностью природного прототипа.
Из практических достижений генетической инженерии наиболее важными являются создание продуцентов биологически активных белков – инсулина, интерферона, гормона роста и др., а также разработка способов активизации звеньев обмена веществ, которые связаны с образованием низкомолекулярных биологически активных соединений. Таким путем получены продуценты ряда антибиотиков, аминокислот, витаминов, во много раз более эффективные, чем их продуценты, выведенные традиционными методами генетики и селекции, генетической инженерии , разрабатываются способы получения чисто белковых вакцин против вирусов гепатита, гриппа, герпеса, ящура, реализована идея использования для вакцинации комбинированного вируса осповакцины, в геном которого встроены гены, кодирующие синтез белков других вирусов (например, вирусов гепатита или гриппа). В результате прививки таким вирусом организм получает возможность выработать иммунитет не только против оспы, но и против гепатита, гриппа или другого заболевания, вызываемого тем вирусом, синтез белка которого котируется встроенным геном.
Как и любое достижение науки, успехи генетической инженерии могут быть использованы не только на благо, но и во вред человеку. Специально проведенные исследования показали, что опасность неконтролируемого распространения гибридных (рекомбинантных) ДНК не так велика, как представлялось ранее.
Гибридные ДНК и несущие их бактерии оказались очень неустойчивыми к влияниям окружающей среды, нежизнеспособными в организме человека и животных при случайном проникновении. Известно, что в природе и без вмешательства человека имеются условия, которые обеспечивают обмен генетической информацией (так называемый поток генов). Однако на пути случайного проникновения в организм чужеродной генетической информации природа создала много эффективных барьеров. При работе с большинством гибридных молекул ДНК вполне достаточно обычных мер предосторожности, которые применяют, например, микробиологи при работе с инфекционным материалом. Для особых случаев разработаны эффективные способы биологической защиты и физической изоляции экспериментальных объектов от человека и окружающей среды.
РНК имеет две формы: транспортную (тРНК) и рибосомную (рРНК). Они имеют довольно сложную структуру. Третья форма – это информационная, или матричная, РНК (мРНК). Все эти формы участвуют в синтезе белка. МРНК – это одноцепочная молекула, образующаяся на одной из цепей ДНК в процессе транскрипции. При синтезе мРНК копируется только одна цепь молекулы ДНК. Нуклеотиды, из которых синтезируются мРНК, присоединяются к ДНК в соответствии с правилами спаривания оснований и при участии фермента РНК – полимеразы. Последовательность оснований в мРНК представляет собой комплиментарную копию цепи ДНК – матрицу. Длина ее может быть различной в зависимости от длины полипептидной цепи, которую она кодирует. Большинство мРНК существует в клетке в течение короткого времени.
Рибосомная РНК кодируется особыми генами, находящимися в нескольких хромосомах. Последовательность в рРНК сходная у всех организмов. Она содержится в цитоплазме, где образует вместе с белковыми молекулами клеточные органеллы, называемые рибосомами. На рибосомах происходит синтез белка. Здесь “код”, заключенный в мРНК, транслируется в аминокислотную последовательность строящейся полипептидной цепи. Группы, образуемые рибосомами – полирибосомы (полисомы) – делают возможным одновременный синтез нескольких молекул полипептидов при участии одной молекулы мРНК.
Механизм, благодаря которому генетическая информация ДНК "транскрибируется" в матричную РНК, а затем транслируется в белок, выяснился через несколько лет после того, как молекулярные биологи осознали, что нуклеотидные последовательности в ДНК генов прямо ответственны за аминокислотные последовательности белка. Тот факт, что некоторые вирусы растений и животных содержат в качестве генетического материала РНК и что вирусная РНК сама по себе инфекционна, уже говорит о вероятной промежуточной роли РНК в переносе генетической информации.
Когда Жакоб и Моно предсказали существование короткоживущего, нестойкого посредника между генами и аппаратом белкового синтеза, поиски молекулы РНК с такими свойствами были уже начаты[8] . Первые указания на наличие фаговой РНК, которая вновь синтезировалась после фаговой инфекции и была ассоциирована с предсуществовавшими бактериальными рибосомами. Окончательное доказательство роли м РНК в синтезе полипептидов было получено в опытах с бесклеточной белок-синтезирующей системой. Экстракты нормальных клеток Е coli могли быть запрограммированы для синтеза специфических белков фага F 2 добавлением РНК из этого фага.
В дальнейшем мРНК была идентифицирована и изучена как в бактериальных, так и в животных клетках. Позже было показано, что многие молекулы м РНК, и вирусные и невирусные, способны программировать синтез специфических белков в самых разных клеточных экстрактах. Это подтверждало, что специфичность синтеза белка в различных системах зависит от м РНК, а не от системы, синтезирующей белок. Во всех клетках первым этапом экспрессии генов оказалась "транскрипция" ДНК с образованием соответствующей мРНК.
4.Проблемы резистентности микроорганизмов к антибиотикам. Необходимость поиска и создания новых антибиотиков. Полусинтетические антибиотики.
Одной из характерных особенностей антибиотиков является избирательность действия – каждый антибиотик действует на определенный набор видов микроорганизмов, т. е. имеет свой специфический антимикробный спектр действия организмов.
Продуцирование антибиотиков – один из факторов, дающий определенные преимущества микроорганизму-антагонисту в борьбе за существование в сложных естественных микробных ассоциациях. Согласно другой точке зрения, антибиотики представляют собой «отбросы» обмена веществ у микроорганизма, не играющие приспособительной, эволюционной роли. Эта точка зрения разделяется 3. Ваксманом, X. Лешевалье и некоторыми другими зарубежными исследователями[9] . Свою трактовку они обосновывают главным образом тем, что, во-первых, антибиотики образуются не всеми широко распространенными микробами; во-вторых, антибиотики быстро инактивируются в почве. Но продуцирование антибиотиков — лишь одно из приспособлений, выработанное микробами в борьбе за существование. Антагонизм микробов может обусловливаться и рядом других веществ, помимо антибиотиков, а также приспособительными механизмами, не связанными с образованием каких-либо химических соединений. Все это также может способствовать широкому распространению микробов, у которых не выявлена способность синтезировать антибиотики. К этому же следует добавить, что в лабораторных условиях, когда тот или иной актиномицет выращивают изолированно (вне естественного микробного сообщества) на искусственных питательных средах, не всегда удается выявить способность к синтезу антибиотика. То есть неактивные в лабораторных условиях штаммы актино-мицетов способны к биосинтезу антибиотиков.
Согласно международному определению «микроорганизм считается резистентным к антибиотику, если он имеет механизмы защиты к данному препарату и при лечении инфекций, вызванных этим возбудителем, нет клинического эффекта даже при использовании максимальных доз антибиотика.
Различают природную и приобретенную резистентность. Природная – это генетически обусловленное отсутствие чувствительности микроорганизма к антибактериальным средствам. Например, вирусы генетически не чувствительны к антибиотикам, большинство грамотрицательных бактерий – к пенициллину, анаэробных – к цефалоспоринам I поколения. Приобретенная резистентность возникает вследствие мутации отдельных штаммов бактерий и селекции устойчивых клонов микроорганизмов или в результате внехромосомного (плазмидного) обмена генетической информации между бактериями.
Проблема резистентности к антибиотикам достигла глобального масштаба. С ней связаны неудачи в лечении различных инфекций. Резистентность к антибиотикам приводит к увеличению смертности, значительному повышению расходов на лечение.
По данным статистики, в России резистентность бета1гемолитического стрептококка к тетрациклину составляет 46, 6%, к макролидным антибиотикам – около 12%. К комбинации сульфаметоксазола и триметоприма устойчивы 32, 4% пневмококков, к тетрациклину – 27, 1%.
В Европе, по данным авторитетного мониторингового документа Alexander Project (1998n2000), резистентность S.рneumoniae к пенициллину составляет 18, 2%, кларитромицину – 24, 1%. Результаты собственных исследований свидетельствуют о том, что устойчивость к цефазолину S. рneumoniae, выделенного у больных пульмонологического отделения в 2000n2001 гг. (г. Винница), составила 39, 2%, доксициклину o 42, 3%[10] .
Что же приводит к развитию резистентности? Наиболее весомой причиной является нерациональная антибиотикотерапия, а также применение антибактериальных препаратов при вирусных инфекциях, гриппе, назначение антибиотиков в низких дозах, короткими курсами, частая их смена. Часто неправильное назначение антибиотиков объясняется тем, что врачи не знают механизма их действия.
Большой «вклад» в развитие антибиотикорезистентности вносит неграмотное самолечение больных. Несмотря на то, что антибиотики следует отпускать только по рецептам, в аптеках их продают по требованию клиента. Определенную лепту в развитие антибиотикорезистентности вносит их использование в животноводстве и сельском хозяйстве.
На современном этапе развития медицины существуют два пути преодоления антибиотикорезистентности.
Первый – это создание принципиально новых лекарственных средств – дорогостоящий и длительный. Второй – это усовершенствование уже имеющихся антибиотиков с учетом причин и механизмов, которые привели к потере чувствительности к тем или иным микроорганизмам. Один из наиболее удачных проектов – создание около 30 лет тому назад защищенных аминопенициллинов. Долгое время они были препаратами № 1 в борьбе с инфекционными заболеваниями. Но многие микробы к ним приспособились и стали вырабатывать бета-лактамазу – фермент, разрушающий аминопенициллины. В ответ на это к «молекуле» аминопенициллина присоединили клавулановую кислоту. Получился уникальный антибиотик Аугментин (амоксициллин/клавулановая кислота). Бета1лактамазы, соединяясь с клавулановой кислотой, теряют свою разрушающую способность. Практически фермент полностью нейтрализуется этой кислотой, а амоксициллин беспрепятственно выполняет свою благородную миссию – уничтожает патогены. Аугментин (амоксициллин/клавулановая кислота) является самым назначаемым антибиотиком в мире. Это препарат № 1 при лечении пневмонии, обострений хронической обструктивной болезни легких, отита, синусита. Большинство микробов, несмотря на свою изобретательность, так и не смогли защититься от этого препарата, и резистентность к нему минимальная.
К числу наиболее актуальных задач в разработке проблемы антибиотиков сегодня относятся: создание и разработка способов преодоления антибиотикорезистентности микробов; изыскание природных и создание полусинтетических антибиотиков, эффективных в борьбе со стафилококковой, синегнойной и другими инфекциями, злокачественными опухолями; поиски новых продуцентов среди малоизученных групп организмов; изучение генетических рекомбинаций у микроорганизмов с продукцией новых антибиотиков; получение новых антибиотиков путем направленного биосинтеза и подбора соответствующих мутантов и рекомбинантов.
Антибиотики – вещества, избирательно подавляющие жизнеспособность микроорганизмов. По спектру действия антибиотики разделяются на антибактериальные, противогрибковые и противоопухолевые. Среди первых различают следующие основные группы: пенициллин и цефалоспорины, антибиотики, действующие преимущественно на грамположительные формы микробов, антибиотики – амипогликозиды, тетрациклины, левомицетины. По характеру действия антибиотиков па бактерии их можно разделить на две группы: бактериостатического и бактерицидного действия. По молекулярному механизму действия антибиотики можно разделить на следующие группы. Ингибирующие
29-04-2015, 05:15