Полусинтетический антибиотик semi-synthetic antibiotic – природный антибиотик, модифицированный в лабораторных условиях с целью повышения его стабильности. Полусинтетические антибиотики разработаны путем частичного изменения химической структуры природных антибиотиков. Особенно большие успехи достигнуты в получении полусинтетических пенициллинов. Полусинтетические пенициллины способны выдержать долгое хранение, при использовании их достигается постоянный уровень их в крови, отсутствует или очень медленно появляется резистентность микробной флоры, не вызывают явлений авитаминоза, не обладают токсическим действием.
5. Использование антибиотиков в качестве лекарственных средств.
Народной медицине давно были известны некоторые способы применения в качестве лечебных средств микроорганизмов или продуктов их обмена, однако причина их лечебного действия в то время оставалась неизвестной. Например, для лечения некоторых язв, кишечных расстройств и других заболеваний в народной медицине применялся заплесневевший хлеб.
В 1871–1872 гг. появились работы русских исследователей В. А. Манассеина и А. Г. Полотебнова, в которых сообщалось о практическом использовании зеленой плесени для заживления кожных язв у человека. Первые сведения об антагонизме бактерий были обнародованы основоположником микробиологии Луи Пастером в 1877 г. Он обратил внимание на подавление развития возбудителя сибирской язвы некоторыми сапрофитными бактериями и высказал мысль о возможности практического использования этого явления.
С именем русского ученого И. И. Мечникова (1894) связано научно обоснованное практическое использование антагонизма между энте-робактериями, вызывающими кишечные расстройства, и молочнокислыми микроорганизмами, в частности болгарской палочкой («мечниковская простокваша»), для лечения кишечных заболеваний человека.
Русский врач Э. Гартье (1905) применил кисломолочные продукты, приготовленные на заквасках, содержащих ацидофильную палочку, для лечения кишечных расстройств. Как оказалось, ацидофильная палочка обладает более ярко выраженными антагонистическими свойствами по сравнению с болгарской палочкой.
В конце XIX – начале XX в. были открыты антагонистические свойства у спорообразующих бактерий. К этому же периоду относятся первые работы, в которых описываются антагонистические свойства у актиномицетов. Позднее из культуры почвенной спороносной палочки Bacillus brevis Р. Дюбо (1939) удалось выделить антибиотическое вещество, названное тиротрицином, которое представляло собой смесь двух антибиотиков – тироцидина и грамицидина. В 1942 г. советскими исследователями Г.Ф. Гаузе и М. Г. Бражниковой был выделен из подмосковных почв новый штамм Bacillus brevis, синтезирующий антибиотик грамицидин С, отличающийся от грамицидина Дюбо.
В 1939 г. Н. А. Красильников и А. И. Кореняко из культуры фиолетового актиномицета Actinomyces violaceus, выделенного ими из почвы, получили первый антибиотик актиномицетного происхождения – мицетин – и изучили условия биосинтеза и применения мицетина в клинике.
А. Флеминг, изучая стрептококков, выращивал их на питательной среде в чашках Петри. На одной из чашек вместе со стафилококками выросла колония плесневого гриба, вокруг которой стафилококки не развивались. Заинтересовавшись этим явлением, Флеминг выделил культуру гриба, определенную затем как Penicilliurn notatum. Выделить вещество, подавляющее рост стафилококков, удалось только в 1940 г. оксфордской группе исследователей. Полученный антибиотик был назван пенициллином.
С открытия пенициллина началась новая эра в лечении инфекционных болезней – эра применения антибиотиков. В короткий срок возникла и развилась новая отрасль промышленности, производящая антибиотики в крупных масштабах. Теперь вопросы микробного антагонизма приобрели важное практическое значение и работы по выявлению новых микроорганизмов – продуцентов антибиотиков стали носить целенаправленный характер.
В СССР получением пенициллина успешно занималась группа исследователей под руководством 3. В. Ермольевой. В 1942г. был выработан отечественный препарат пенициллина. Ваксманом и Вудрафом из культуры Actinomyces antibioticus был выделен антибиотик актиномицин, который впоследствии стал использоваться как противораковое средство. Первым антибиотиком актиномицетного происхождения, нашедшим широкое применение особенно при лечении туберкулеза, был стрептомицин, открытый в 1944 г. Ваксманом с сотрудниками. К противотуберкулезным антибиотикам относятся также открытые позже вио-мицин (флоримицин), циклосерин, канамицин, рифамицин.
В последующие годы интенсивные поиски новых соединений привели к открытию ряда других терапевтически ценных антибиотиков, нашедших широкое применение в медицине. К ним относятся препараты с широким спектром антимикробного действия. Они подавляют рост не только грамположительных бактерий, которые более чувствительны к действию антибиотиков (возбудители пневмонии, различных нагноений, сибирской язвы, столбняка, дифтерии, туберкулеза), но и грамотрицательных микроорганизмов, которые более устойчивы к действию антибиотиков (возбудители брюшного тифа, дизентерии, холеры, бруцеллеза, туляремии), а также риккетсий (возбудители сыпного тифа) и крупных вирусов (возбудители пситтакоза, лимфогрануломатоза, трахомы и др.). К таким антибиотикам относятся хлор-амфеникол (левомицетин), хлортетрациклин (биомицин), окситетрациклин (террамицин), тетрациклин, неомицин (колимицин, мицерин), канамицин, паромомицин (мономицин) и др. Кроме того, в распоряжении врачей в настоящее время имеется группа антибиотиков резерва, активных в отношении устойчивых к пенициллину грамположительных болезнетворных микроорганизмов, а также противогрибные антибиотики (нистатин, гризеофульвин, амфотерицин В, леворин)[11] .
В настоящее время число известных антибиотиков приближается к 2000, однако в клинической практике используется всего около 50.
6. Производство столбнячного анатоксина.
Столбнячный анатоксин применяют с профилактической целью против заболевания животных столбняком. Концентрированный столбнячный анатоксин представляет собой преципитат 1-процентного квасцового анатоксина, изготовляемого из нативного столбнячного токсина. По внешнему виду анатоксин представляет жидкость прозрачно-желтого цвета с рыхлым осадеом на дне ампулы. При взбалтывании ампулы осадок легко разбивается в равномерную взвесь, придавая анатоксину беловато-желтоватый цвет. На каждой коробке с анатоксином должна быть этикетка с указанием наименования и товарного знака предприятия-изготовителя, наименование препарата, количества анатоксина в ампуле, номера серии и контроля, даты изготовления, дозы, срока годности, условий хранения, обозначения ГОСТа.
Ампулы с анатоксином, содержащие плесень, неразбивающийся осадок и посторонние примеси, без этикетки, а также плохо укупоренные, выбраковывают. Анатоксин, не использованный в день открытия ампулы, обезвреживается кипячением в течение 15 минут.. Срок годности анатоксина 3 года при условии хранения в сухом, темном помещении при температуре от 2 до 15°С. Анатоксин, подвергшийся замораживанию, к применению не пригоден.
Анатоксин применяют в дозе 1 куб.см для крупных животных и 0, 5 куб.см – для молодняка и мелких животных. Анатоксин вводят подкожно, в средней части верхней трети шеи животного, однократно. Иммунитет наступает через 30 дней после прививки и сохранятся у лошадей в течение 5 лет, а у остальных животных – свыше одного года.
Анатоксин столбнячный адсорбированный - препарат состоит из очищенного столбнячного анатоксина и геля гидроокиси алюминия. Консервант - мертиолят в концентрации 0, 01 %. В 1мл содержится 20 единиц связывания (ЕС) анатоксина.
Анатоксин столбнячный представляет собой суспензию желтовато-белого цвета, при стоянии разделяющуюся на рыхлый осадок и прозрачную надосадочную жидкость. Осадок легко разбивается при встряхивании[12] .
Адсорбированный столбнячный анатоксин при введении в организм вызывает образование антитоксина.
Полный курс иммунизации, включающий вакцинацию и ревакцинацию, создает у привитых надежную защиту против столбняка. Препарат предназначен для активной иммунизации против столбняка в рамках плановой и экстренной профилактики.
7. Получение гамма-интерферона.
Гамма-интерферон человека (hIFN-g) – иммуномодулятор, обладающий антивирусным и антипролиферативным действием. hIFN-g – гликопротеин, секретируемый Т-лимфоцитами и моноцитами. Один из путей получения гликозилированного hIFN-g в промышленных масштабах состоит в создании трансгенных животных, синтезирующих hIFN-g в молочной железе и секретирующих его в молоко[13] .
На основе регуляторных последовательностей гена b-лактоглобулина овцы (BLG) и транскрипционной единицы гена g-интерферона человека (hIFN-g) сконструирован гибридный ген BLG-hIFN-g. Этот ген был использован для создания трансгенных мышей. Показано, что hIFN-g эффективно экспрессировался в молочной железе таких мышей (до 570 мкг/мл молока), гликозилирован и обладает биологичской активностью. Проводятся работы по созданию трансгенных кроликов-продуцентов hIFN-g.
Получено несколько животных, содержащих ген hIFN-g в составе своего генома. По литературным данным потребность в этом препарате в России составляет ~100 г/год. Таким образом, небольшое стадо кроликов (~100 голов) может обеспечить потребности всей страны в hIFN-g. g-Интерферон человека важен для практического здравоохранения, так как через него осуществляется Т-хелперный контроль функции макрофагов и цитолитических эффекторов иммунитета. Введение этого цитокина способствует восстановлению фагоцитарной цитолитической функции и повышает иммунную защиту организма.
При инфекциях, вызванных простейшими (лейшманиоз, хламидиоз, малярия), при которых роль макрофагов в процессах выздоровления велика, hIFN-g представляется особенно перспективным. Эффективность препарата кажется вероятной при иммунокомплексной патологии (артриты, системная красная волчанка), также связанной с функцией макрофагов. Так как hIFN-g участвует в регуляции ранних этапов гемопоэза, он будет полезен также при комплексной терапии гемобластозов (лейкозов, лейкемий, лимфом), связанных с нарушением ранних стадий дифференцировки предшественников.
Гамма-интерферон применяют для коррекции нарушений клеточного иммунитета, а также для лечения инфекционных, аутоиммунных, аллергических и онкологических заболеваний.
8. Неорганические носители, используемые для иммобилизации ферментов. Их характеристика.
В последние 15–20 лет на стыке ряда химических и биологических дисциплин сложилось новое "инженерное" направление – химическая энзимология, стремительное развитие которой было обусловлено созданием биологических катализаторов нового типа – иммобилизованных ферментов. А разработка метода иммобилизованных ферментов определялась, в свою очередь, рядом существенных факторов, затрудняющих использование чистых ферментов во многих промышленных производствах.
Во-первых, чистые препараты ферментов неустойчивы при длительном хранении, а также при разного рода воздействиях, особенно тепловых. Во-вторых, в виду сложности отделения ферментов от различных реагентов смеси многократное их использование весьма затруднено.
Однако принципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимологией с разработкой принципов создания иммобилизованных ферментов. Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании в прикладных (промышленных целях) производствах по сравнению с чистыми препаратами. Гетерогенный (иммобилизованный) катализатор легко отделить от реакционной среды, что обусловливает[14] :
• возможность остановки реакции в любой нужный момент;
• повторное использование катализатора;
• получение конечного продукта, не загрязненного ферментом.
Последний момент весьма важен при производстве пищевых и медицинских продуктов. Применение иммобилизованного катализатора позволяет проводить ферментный процесс непрерывно и регулировать скорость реакции, а также изменять количество получаемого продукта в соответствии с изменениями скорости протока реакционной смеси.
Иммобилизация или некоторая модификация фермента может обусловить изменения и некоторых его свойств (специфичность взаимодействия с субстратом; зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, а также его стабильность по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям).
Иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность за счет изменения свойств носителя. Для иммобилизации ферментов используются также различные типы неорганических носителей, таких, как создаваемые на основе силикагеля, глины, керамик, природных минералов, металлов и их оксидов.
Основными качествами, определяющими широкое внедрение неорганических носителей в производственные процессы, является легкость их регенерации и возможность придания им любой конфигурации. Они могут применяться как в виде порошков, шариков, так и монолитов; они могут быть как пористыми, так и сплошными (непористыми).
Определенное преимущество для различного рода работ имеют носители, приготавливаемые на основе микропористых кремнеземов. К их достоинствам следует отнести механическую прочность, химическую инертность по отношению ко многим растворителям, наличие жесткого скелета с заданным размером пор, а также устойчивость к микроорганизмам. Недостатками кремнеземов является их использование в ограниченном диапазоне рН, а также явление неспецифической сорбции на их поверхности, хотя последнее может быть устранено различными модифицирующими воздействиями. Правда, стоимость кремнеземных носителей относительно высока, и модификация еще больше повышает цену, поэтому внедрение их в промышленность существенно ограничено.
Более пригодными для промышленного использования могут оказаться природные алюмосиликаты – глины, а также пористая керамика, в состав которой, помимо алюмосиликатов, входят окислы титана, циркония или другие добавки. Следует также упомянуть такие широко распространенные носители, как уголь и графитированная сажа. Весьма перспективными носителями являются приготавливаемые на основе металлов и их оксидов, которые характеризуются высокой механической прочностью, относительной дешевизной, стабильностью и хорошими гидродинамическими свойствами.
Иммобилизация представляет собой включение u1092 фермента в такую среду, в которой для него доступной оказывается лишь ограниченная часть общего объема. На практике для иммобилизации ферментов используют рутинные физические и химические методы. Все существующие методы физической иммобилизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соединяется с носителем ковалентными связями) могут быть подразделены на четыре основные группы:
• адсорбция на поверхности нерастворимого носителя (или как иногда говорят матрикса);
• включение в поры геля;
• пространственное разделение фермента от остальной части реакционной смеси с помощью полупроницаемой мембраны;
• введение фермента а двухфазную реакционную среду, в которой он растворим, но может находиться только в одной из фаз.
Как и всякая другая классификация, приведенная ниже, является в значительной степени условной, так как не всегда существует возможность проведения четкой границы между различными способами иммобилизации.
Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из всех существующих в настоящее время способов иммобилизации ферментов. Носителями при данном способе иммобилизации могут быть как органические, так и неорганические вещества, которые применяются а виде порошка, мелких гранул или шариков. Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нерастворимых носителях отличается исключительной простотой и достигается путем обеспечения контакта водного раствора фермента с избранным для конкретной цели носителем.
После отмывки неадсорбированного фермента препарат готов к применению.
На процесс адсорбции и прочность связывания фермента с носителем оказывают определенное влияние различные факторы внешней среды, основными из которых являются: удельная поверхность и пористость носителя, значения рН среды, ионная сила раствора фермента, его концентрация, а также температура проведения адсорбции.
Иными словами, эффективность иммобилизации ферментов определяется сбалансированностью ряда факторов и нарушение этого u1073 баланса может привести к резкому ослаблению взаимодействия фермента с носителем. Для исключения подобной ситуации, на практике используется набор методических приемов, способствующих повышению эффективности процесса и, следовательно, получению более качественных препаратов.
Иммобилизация путем включения в гели состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку, образованную тесно переплетающимися нитями (цепями), формирующими гель. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой приходится обычно значительная часть общего объема геля.
Для иммобилизации фермента в геле существует два основных способа:
• при одном из них фермент вводится в водный раствор мономера, а затем уже проводят полимеризацию, в результате которой формируется гель с включенными в него молекулами фермента;
• второй способ состоит в том, что фермент вносится в раствор уже готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в требуемое состояние, гелеобразное состояние.
Иммобилизация путем включения в полупроницаемые мембраны –состоит в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой мембраной, способной легко пропускать небольшие молекулы субстрата, задерживая крупные молекулы фермента. Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемых мембран и их природой.
К этим модификациям относятся: микрокапсулирование в замкнутых сферических пузырьках, имеющих тонкую полимерную стенку (мембрану).
Метод двойного эмульгирования, в соответствии с которым приготовленная заранее эмульсия водного раствора фермента в органическом растворе полимера вновь диспергируется в воде. После затвердевания органического раствора образуются полимерные сферические частицы с иммобилизованными в них молекулами фермента.
Способ включения в волокна отличается от метода микрокапсулирования главным образом формой получаемых препаратов. Если при микрокапсулировании образуются сферические микрокапсулы, то при этом способе формируются нити. Для иммобилизации ферментов можно использовать также выпускаемые промышленностью полимерные полые волокна, изготавливаемые из природных или синтетических материалов. Для проведения ферментативной реакции волокна, по которым циркулирует раствор фермента, погружаются в сосуд с раствором субстрата, диффундирующим через мембрану внутрь волокна.
В медицинских целях и некоторых фундаментальных исследованиях достаточно широко используется метод иммобилизации ферментов путем их включения в липосомы, поскольку такие системы близки природным мембранам и могут дать весьма ценную информацию о ферментативных процессах, протекающих в клетках. Существует несколько модификаций данного способа, самой последней из которых является иммобилизация путем включения в полимерные липосомы. Полимерные липосомы характеризуются более высокой стабильностью по сравнению с обычными.
Основным недостатком всех мембранных систем, применяемых для иммобилизации ферментов, является невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов, для которых мембраны представляют собой непреодолимые барьеры.
Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного типа сводится к тому, что ограничение свободы перемещения фермента в системе достигается не вследствие его фиксирования на жестком носителе, а в результате его способности растворяться только в одной из фаз двухфазной системы.
Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что вследствие химических взаимодействий в молекуле фермента возникают новые ковалентные связи, в частности между ним и носителем[15] . Препараты иммобилизованных ферментов, получаемые с использованием химических методов, обладают, по крайней мере, двумя существенными достоинствами. Во-первых, формирующаяся ковалентная связь между ферментом и носителем обеспечивает высокую прочность образующих конъюгатов. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств (субстратной специфичности, каталитической активности и стабильности).
Существует большое число химических реакций, используемых для ковалентного связывания ферментов с неорганическими носителями (такими, как керамика, стекло, железо, цирконий и титан) или природными полимерами (такими, как сефароза и целлюлоза), а также синтетическими полимерными веществами (нейлон, полиакриламид и другие виниловые полимеры или сополимеры, обладающие
29-04-2015, 05:15