Состояние лимфоцитов при вирусных гепатитах В и С

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЬЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА

На правах рукописи

НИКОЛАЕНКО Светлана Леонидовна

ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ В И С

14. 00. 10 - инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном медицинском университете имени академика И.П. Павлова

Научный руководитель

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Е.П. Шувалова

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук профессор Т.В. Сологуб

доктор медицинских наук С.Л. Мукомолов

Ведущее учреждение Научно-исследовательский институт детских инфекций

Актуальность темы. Вирусные гепатиты, несмотря на определенные успехи в изучении этиологии, патогенеза, клиники и терапии, остаются проблемой, далекой от своего решения (Дунаевский О.А., 1993. Подымова С Д, 1993, Учайкин В Ф и др, 1994; Соринсон С Н, 1996, Alberti A et al, 1991; Barbara J A, 1994)

Необходимость дальнейшего изучения различных сторон патогенеза вирусных гепатитов возникает вследствие разработки новых методов ис­следования и возможности верификации гепатитов, ранее расцениваемых. как "ни А. ни В" (Мукомолов С Л и др, 1992, Рахманова А Г и др, 1995, Хазанов А И , 1996; Krogsgaard К et al. 1990, Chang W Y et al, 1992 )

Наряду с моноинфекциями, в результате общих путей и механизмов заражения, а также строго типоспецифического характера иммунитета, в последнее время наблюдается увеличение частоты ко- и суперинфицирования несколькими вирусами с развитием микст-гепатитов В большей мере это относится к вирусным гепатитам с парентеральным механизмом заражения (Соболевская О Л . 1995. Румянцев О.Н. и др., 1996, Шувалова ЕП. Антонова Т.В. 1996, Zeidis Y.B. et al, 1992, Liaw G.-F., 1995, Goranova Q et all, 1996)

Одной из причин развития затяжного течения вирусного гепатита счи­тают неполноценность ответной реакции организма в связи с нарушением функционирования иммунной системы (Соринсон С Н. и др . 1992. Шамшура О Л , Фролов А. В. , 1994. Баширова Д К. 1996, Собчак Д. М., Деречинская Е Л, 1996, Popper Н., Paronetto F . 1984: Paterlim P et al. 1993, Manns M P,1996).

Большое значение в патогенезе различных заболеваний придается структурно-метаболическом; состоянию иммунокомпетентных клеток (ИКК), от которого зависит функционирование иммунной системы в целом (Ляшенко ЮИ, 1988, 1992, Paronetto F, 1986. Bianchi FB, 1992. Schirmacher P et al. 1993) и, как следствие, течение инфекционного про­цесса. Одной из возможных причин несостоятельности лимфоцитов может явиться усиление процессов свободнорадикального окисления в их мем­бранах и нарушение его регуляции (Афонина Г Б , Бордонос В Г, 1990, Пастушенков В Л и др, 1993, Матвейков Г П и др. 1994, Devi M A . Das N P , 1994, Cardier YE et al, 1995), а также изменение внутриклеточного метаболизма, приводящего к нарушению созревания, дифференцировки и функционирования ИКК (Робинсон М.В , 1986, 1994, Николаев А И и др , 1989. Габрилович Д И и др . 1991, Гольтяпин Д Б . 1995, Huang С M et al, 1988,LosaGA., 1989)

Вышеизложенное послужило основанием для выбора направления наших исследований

Цель исследования: Оценить патогенетическое значение функционально-метаболического состояния лимфоцитов и их мембран при вирусных гепатитах различной этиологии, разработать на этой основе дополнительные критерии оценки тяжести и прогнозирования течения заболевания.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние процессов липопероксидации в мембранах лимфоцитов и в плазме крови по уровню малонового диальдегида в динамике вирусных гепатитов различной этиологии.

2. Изучить состояние антиоксидантной защиты в лимфоцитах по уров­ню активности ее основного фермента - супероксиддисмутазы и биосинте­тическую активность клеток при вирусных гепатитах.

3. Определить состояние внутриклеточного метаболизма лимфоцитов по изменению активности ведущих ферментов основных обменных циклов (СДГ, ЛДГ, альфа-ГФДГ, НАД- и НАДФ-оксидазы) при остром вирусном гепатите В (ОВГВ) и гепатите В+С.

4. Определить характер иммунологических сдвигов при ОВГВ по состоянию Т-, В-клеточного звена иммунитета и неспецифической резистентности.

5. Оценить клиническое и патогенетическое значение состояния лимфоцитов в периферической крови и разработать дополнительные критерии оценки тяжести и прогнозирования течения вирусных гепатитов.

Основные положения, выносимые на защиту . В работе обосновывается положение о закономерном усилении перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран лимфоцитов, соответствующее периоду и форме тяжести вирусных гепатитов. Изменение уровня малонового диальдегида (МДА) в лимфоцитах имеет количественные различия и разнонаправленный характер в динамике заболевания при гепатитах различной этиологии.

Обсуждается положение о том, что дополнительным фактором. влияющим на функционирование иммунокомпетентных клеток (ИКК) при вирусных гепатитах, является измененное внутриклеточное метаболическое состояние лимфоцитов, оцениваемое по активности ключевых ферментов основных обменных циклов и содержанию РНК. ДНК и ПДН,

Состояние процессов ПОЛ и метаболизм лимфоцитов имеют важное патогенетическое значение, что обосновывает значение их показателей для оценки тяжести и прогнозирования течения вирусных гепатитов.

Научная новизна работы. Впервые выявлены преимущественно однотипные изменения метаболических процессов и функционирования иммунокомпетентных клеток при ОВГВ и ВГВ+С.

Получены новые данные о зависимости интенсивности ПОЛ в мембра­нах лимфоцитов и активности СОД от этиологии гепатита. Так, при лег­кой форме ВГС уровень МДА лимфоцитов в разгар заболевания не повышался и был существенно ниже, чем при ОВГВ и ВГВ+С. Если при циклической форме ОВГВ наблюдалось компенсаторное усиление активности СОД к периоду реконвалесценции, то у больных гепатитом В+С показатель оставался стабильным на протяжении заболевания.

Интенсивность ПОЛ и активность СОД лимфоцитов соответствовали тяжести и периоду вирусного гепатита.

Впервые выявлено достоверное увеличение эндонуклеолиза хроматина лимфоцитов при ОВГВ и усиление биосинтетической активности клеток независимо от тяжести и периода заболевания.

Практическая ценность работы. Выявленные закономерности изме­нения показателей МДА, активности СОД лимфоцитов при вирусных гепатитах в зависимости от тяжести и периода заболевания, обосновывают их прогностическое значение, а также возможность использования их определения для оценки тяжести заболевания и полноты выздоровления.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на заседании Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научного общества инфекционистов (1997). представлены на 1. 2 и 3 Всероссийской неделе гастроэнтерологов(1995, 1996. 1997).

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Пути реализации работы. Результаты исследования внедрены в практику работы Научно-исследовательского института детских инфекций (г. Санкт-Петербург) и инфекционного отделения в/ч 22412 ЛенВО, а также в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней и эпидемиологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа изложена на 167 страницах машинописи, из них 132 страницы основного текста, содержит 23 таблицы и 12 рисунков, снабжена указателем литературы, включающим 182 отечественных и 139 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Под наблюдением находились 166 больныхвирусными гепатитами: 137 мужчин и 29 женщин. Возраст 86,2% обследованных не превышал 30 лет. В результате серологической верификации ВГ у 99 больных установ­лен диагноз ОВГВ, у 11 - ВГС, 56 больных имели одновременно маркеры ОВГВ и антитела к HCV (ВГВ+С).

Оценка формы тяжести вирусных гепатитов проводилась по общепри­нятым критериям. Легкая форма заболевания диагностирована у 23 больных ОВГВ, в том числе в 4 случаях - безжелтушная, средней тяжести - у 58. тяжелая - у 18 больных. В 4 случаях заболевание осложнилось разви­тием острой печеночной недостаточности (ОПН). У 3 из этих больных наблюдалось прогрессирующее течение заболевания, развитие печеночной комы с летальным исходом.

Гепатит В+С в легкой форме переносили 29 больных, в том числе в 3 случаях - безжелтушную, средней тяжести - 21 больной, тяжелую - 6 больных. В 3 случаях тяжелое течение заболевания осложнилось развитием ОПН, в одном из них - печеночной комой и легальным исходом.

Все 11 больных ВГС переносили заболевание в легкой форме, безжелтушную - в 4 случаях.

Одновременно с общепринятым клинико-лабораторным обследованием в динамике заболевания у 94 больных изучали состояние процессов ПОЛ мембран по уровню малонового диальдегида (МДА) в лимфоцитах и в плазме крови в тесте с тиобарбитуровой кислотой (Андреева Л.И, и др., 1988; Пастушенков В. Л. и др., 1993). Состояние системы антиоксидантной защиты в лимфоцитах оценивали по степени активности супероксиддисмутазы (СОД) методом Fndovich J. (1989). Функционально-метаболическую активность лимфоцитов изучали по активности ключевых ферментов основных обменных циклов, сукцинатдегидрогеназа (СДГ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), альфа-глицерофосфатдегидрогеназа (альфа-ГФДГ) в цитозольной и митохондриальной изоформах. НАД-оксидаза и НАДФ-оксидаза методом С.Loida(1982).

Биосинтетическую активность лимфоцитов оценивали по величине коэффициента (альфа (К-альфа,), отражающего соотношение РНК/ДНК в методе люминесцентного микроспектрального анализа (Карнаухов В Н., 1978) Выраженность эндонуклеолиза ядерного хроматина характеризовали по уровню продуктов деградации нуклеотидов (ПДН), являющихся маркером данного процесса методом Иванника В П. и др.(198б).

Для оценки иммунного статуса 30 больных ОВГВ исследовали показатели клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности. Иммунологические исследования проводились на базе НИЛ СПИД и инфекционных заболеваний в ВС РФ (ВМА) под руководством д.м.н Е.И. Змушко - начальника лаборатории.

Клинико-биохимическое и иммунологическое обследование больных ВГ проводили дважды - в периоды разгара заболевания и ранней реконвалесцснции. Полученные данные сопоставляли с результатами обследования 25 здоровых доноров и подвергли вариационно-статистической обра­ботке в соответствии с общепринятыми методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

У подавляющего большинства больных ОВГВ уже с первых дней желтуш­ного периода выявлено значительное усиление процессов липопероксидации мембран лимфоцитов, о чем свидетельствовало достоверное повышение уровня МДА Так. при норме МДА в лимфоцитах (МДАл) 1,10±0,02 нмоль/2х10⁶ кл. показатель был увеличен при легкой форме в 1.4 раза (1.54±0,04 нмоль/2х10⁶ . Р<0.001). при средней тяжести - в 1,5 раза (1,63±0,05 нмоль/2х10⁶ кл, Р<0,001), при тяжелой- в 1,6-1,8 раза 1,89±0,12 нмоль/2х 10⁶ кл, Р<0,001).

Уровень МДА в плазме крови (МДАпл) изменялся согласованно с показателями МДАл и превышал показатели здоровых лиц в 2,9-3,1 раза при легкой форме (38,9±2,27 нмоль/мл, норма - 12,6±0,52 нмоль/мл, Р<0,001). в 4,2-4,6 раза при средней тяжести (55,5±4,29 нмоль/мл, Р<0,001) и в 7,2-8,0 раза при тяжелой форме ОВГВ (96,5±8,88 нмоль/мл, Р<0,001). Таким образом, степень повышения уровня МДА соответствовала форме тяжести заболевания и имела достоверные различия показателя в плазме крови в зависимости от выраженности патологического процесса при всех формах тяжести ВГ Содержание МДАл имело достоверные различия у больных средней тяжести и тяжелой формой заболевания

Выявленное нами повышение количества продуктов ПОЛ в плазме крови отражает степень свободнорадикального повреждения мембран гепатоцитов. что является общепризнанным механизмом, обуславливающим выраженность проявления основных синдромов ОВГ (цитолитический, интоксикационный и синдром желтухи) (Дудник Л.Б,. 1988; Антонова Т.В. и др. 1991, Пак С Г., Никитин Е.В, 1991; Левина Л.Д и др., 1992).

Функционирование ИКК при развитии иммунного ответа сопровожда­ется активацией процессов ПОЛ в мембранах лимфоцитов (Ляшенко В.А. и др., 1988) и определяет их состояние и эффективность иммунологической защиты (Иванова В В. и др.. 1986; Лебедев К А, Понякина И.Д. 1986; Афонина Г.Б., Бордонос В Г., 1990). Выявленная корреляция уровня МДАч с формой тяжести ОВГВ отражает усиление процессов липопероксидации в мембранах лимфоцитов, соответствующее напряженности иммунного ответа.

По мере купирования патологического процесса наблюдалось снижение МДАл и МДАпл во всех обследованных группах, за исключением группы больных средней тяжести, где отмечено незначительное увеличение среднего уровня МДАл.

Хотя средние значения МДАл и МДАпл в период ранней реконвалес-ценции оказались достоверно выше контрольных значений, в динамике ОВГВ наблюдалась явная тенденция к их нормализации, наиболее демон­стративная при тяжелой форме (снижение содержания МДАл при легкой форме от 1,54±0,04 до 1,46±0,08 нмоль/2х10⁶ кл; при тяжелой форме - от 1,89±0.12 до 1,55±0,09 нмоль/2х10⁶ кл; в плазме крови - при легкой форме от 38,9 ± 2,27 до 21,4 ± 3,96 нмоль/мл; при средней тяжести - от 55.5±4,29 до 34.4±3,95 нмоль/мл; при тяжелой форме - от 96,5±8,88 до 26,2±3,62 нмоль/мл).

В группе больных средней тяжести ВГВ среднее значение уровня МДАт в динамике заболевания имело тенденцию к повышению (от 1,6310.05 до 1,68±0,08 нмодь/2х10⁶ кл) и было связано с тем. что у 31,8% больных наблюдалось увеличение показателя после курса АЛОК, который применялся в качестве дополнительного метода эфферентной терапии у пациентов с отклонениями в нормальном течении восстановительного периода (длительная гиперферментемия и антигенемия), расцениваемые многими авторами как критерии затяжной реконвалесценции (Соринсон С.Н., 1987, 1996, Угрюмова Б.Л. 1941; Шамшура ОЛ. Фролов А.В., 1994). Результаты изучения содержания МДА в лимфоцитах в этой группе больных значительно превышали средние (2,02+0,11 против 1,68+0,08 нмоль/2х10⁶ кл, Р<0,05).

Вопреки тому, что многие авторы указывают на усугубление патологи­ческого процесса и. как следствие, большую выраженность функциональных нарушений печени и тяжесть клинических проявлений при развитии вирусных гепатитов смешанной этиологии, в частности В+С, мы не выявили существенных различий уровня МДАл и МДАпл на протяжении ОВГВ и гепатита В+С при всех формах тяжести Полученные нами данные свидетельствуют о повышении, в сравнении с показателями здоровых лиц. уровня МДАл в разгар легкой формы гепатита В+С в 1.4-1.5 раза (1,60+0,05 нмоль/2х10⁶ кл, Р<0.001), в 1,6 раза при средней тяжести (1,72+0,05 нмоль/2*10⁶ кл. Р<0,001), в 1.6-1,8 раза при тяжелой форме (1,88+0,14 нмоль/2х10⁶ кл, P<0,001),

Содержание МДАпл изменялись аналогично показателю в лимфоцитах и соответствовали форме тяжести, при легкой форме - в 2,8-3,3 раза (38,9±4.90 нмоль/мл. Р<0.001). при средней тяжести - в 4,1-4,9 раза (57,4±7,23 нмоль/мл, Р<0.001). при тяжелой форме - в 5,8-7,3 раза (83.1±12,5 нмоль/мл. Р<0.001).

В период угасания основных клинико-биохимических проявлений гепа­тита В+С отмечалось снижение содержания МДАл и МДАпл, за исключе­нием группы больных легкой формой, где выявлена тенденция к повыше­нию среднего уровня МДАл (до 1,63+0,12 нмоль/2х10⁶ кл), что связано с тем, что в данной группе 25% больных обследованы после курса АЛОК, результаты обследования которых достоверно превышали средние в груп­пе (2,46+0.23 нмоль/2х10⁶ кл, Р<0.02).

Достоверное снижение МДАл в динамике гепатита В+С выявлено при средней тяжести (до 1.39+0,11 нмоль/2х10⁶ кл. Р<0.05). В плазме крови содержание МДА в процессе развития заболевания достоверно снижалось при всех формах тяжести (легкая форма - до 24,5±4,43 нмоль/мл, Р<0,05, форма средней тяжести - до 24,8±5,45 нмоль/мл, Р<0.01; тяжелая форма -до 39,8±4,18 нмоль/мл, Р<0,01) и в реконвалесценцию существенно отли­чалось от показателей здоровых лиц только при тяжелой форме заболевания.

Сходные результаты активности ПОЛ при ОВГВ и гепатите В+С сви­детельствуют о близости механизмов патогенеза, что связано с единством путей и механизмов заражения и. возможно, определяющим значением вируса В на состояние лимфоцитов В то же время, согласно литературным данным, при гепатите В+С вирус гепатита С подавляет репликацию HBV, что оказывает влияние на течение микстинфекции (Корочкина О.В , Со­болевская О.Л.. 1996; Румянцев О.Н. и др. 1996). В целях выявления возможной зависимости этиологии вирусных гепатитов и степени активности процессов ПОЛ мы провели сравнительный анализ уровня МДАл и МДАпл в группе больных легкой формой ОВГВ, ВГС, ВГВ+С, Выбор данной группы обусловлен тем, что, во-первых. ОВГС в большинстве случаев протекает в легких, безжелтушных формах, а во-вторых, после легких форм ВГ, при которых, как правило, наблюдается слабый иммун­ный ответ, чаще развиваются затяжные и хронические формы заболевания (Редечкина С.И и др., 1-992; Соринсон С.Н. и др., 1996; Хазанов А И,, 1996, Lai M. et al, 1994; Van der Poel C.L , 1994) Было выявлено, что в разгар ВГС уровень МДАл достоверно не отличался от нормы (1,23+0,08 нмоль/2х10⁶ кл), а уровень МДАпл в 4,3-5,6 раза превышал показатели здоровых лиц (63,0±10,6 нмоль/мл, Р<0,001). По мере купирования клинических проявлений ВГС наблюдалось увеличение уровня МДАл. Показатель в 1,3-1.4 раза превышал норму (1,48+0,04 нмоль/2х10⁶ кл. Р<0.001) при нормализации уровня МДАлл (15,1 ±3,00 нмоль/мл).

Эти данные свидетельствуют о достоверно менее выраженных процес­сах липопероксидации в мембранах лимфоцитов в разгар ВГС в сравнении с ОВГВ и ВГВ+С по уровню МДА и более существенном повышении со­держания продуктов ПОЛ в плазме крови В динамике ВГС наблюдалась противоположная направленность изменения МДАл в отличие от ВГ дру­гой этиологии. Полученные данные могут быть следствием особенностей патогенеза ВГС, в частности, существующим в литературе мнением о ха­рактерном воздействии HCV на тропные органы и ткани, а именно, гепатоциты и мононуклеарные клетки периферической крови (Koskinas J et al.. 1994, AbrignaniS., 1995; Dicpolder H M et al, 1995: Thomas H S.. 1995).

Вместе с тем, усиление ПОЛ в лимфоцитах по мере угасания клинико-биохимических признаков заболевания при ВГС может свидетельствовать о продолжающемся патологическом процессе, персистенции вируса и хронизации заболевания.

Как известно, в процессе развития любого инфекционного заболевания происходит формирование адаптационных реакций организма, которое осуществляется на различных уровнях - мембранном, органном, систем­ном и имеют универсальный характер при различной патологии (Антонова Т В.. 1996). Одной из этих систем являются компоненты АОЗ. так как от соотношения активности прооксидантных и антиоксидантных систем зави­сит степень активности процессов липопероксидации мембран

Мы выявили повышение активности одного из основных ферментов АОЗ - СОД в лимфоцитах в разгар ОВГВ, степень которого соответство­вала форме тяжести При нетяжелых формах заболевания активность СОД была увеличена в среднем в 1,4 раза (66,0±20,9 ед приликой форме и б6,3±12,3 ед при средней тяжести) и достоверно превышала норму (45,3±4,51 ед) у больных средней тяжести. При тяжелом течении ОВГВ активность СОД в желтушный период была повышена в 2,3-3,8 раза по сравнению со здоровыми лицами (142,0±48,0 ед. Р<0.001) и достоверно превышала аналогичный показатели” у больных средней тяжести. Эти ре­зультаты согласуются с данными других исследователей, выявивших


8-09-2015, 21:45