Приклад 6
Аналіз лікарського засобу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕЖХ): аналіз будезоніду.
Дослідження за допомогою ВЕЖХ застосовується з різними цілями для визначення: змісту Будезоніду в ліпосомній готовій препаративній формі, ефективності інкапсулірування, змісту Будезоніда в аерозольних зразках, отриманих на моделі легенів. Концентрацію Будезонида визначають за допомогою ВЕЖХ аналізу з використанням автозагрузочного пристрою Waters WISP 717 і стовпчика Waters Nova-Pak C18 (3,9 x 150 мм) при кімнатній температурі. Пік реєструють при 238 нм, використовуючи детектор, що працює при різних довжинах хвиль в УФ і видимої частини спектра з кількісною оцінкою за Версією 2,15 Millenium 2010 Chromatography Manager фірми Waters. Рухлива фаза, що використовується при цих дослідженнях, представляє 50:50 етанол/ метанол при швидкості потоку 0,6 мол у мінуту (див. Anderson & Ryrfeldt, J. Pharm. Pharmacol. 36: 763-65 (1984)). Зразки для аналізу розчиняють безпосередньо в етанолі (для розчинення ліпосом). Стандарти лікарського засобу готовлять із вихідного розчину етанолу, що зберігається при -80 0С.
Приклад 7
Аналіз лікарського засобу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕЖХ): аналіз циклоспорину A.
Циклоспорин A у ліпосомних готових препаративних формах (для визначення змісту циклоспорину A і ефективності інкапсулювання) і аерозольних зразках визначався за допомогою ВЕЖХ. У дослідженні використовувалися автоматичний інжектор зразків Waters (Milford, MA) WISP і стовпчик Supelco LC-1, нагріта до 750С. Рухлива фаза складалася з 50 відсотків ацетонітрілу, 20 відсотків метанолу й 30 відсотків води (див. Charles et al., Ther. Drug Monitor. 10: 97-100 (1988)). Пік реєструють при 214 нм, використовуючи детектор, що працює на різних довжинах хвиль, і кількісно оцінюють за Версією 2,15 Millenium 2010 Chromatography Manager фірми Waters. Зразки для аналізу розчиняють безпосередньо в метанолі (для розчинення ліпосом). Стандарти лікарського засобу одержують із вихідного розчину метанолу, що зберігається при -800С.
Приклад 8
Аналіз лікарського засобу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕЖХ): аналіз DLPC
Була використана модифікація схеми проведення ВЕЖХ Grit and Commelin, Chem. & Phys. of Lipids 62: 113-22 (1992). Застосовувалися автоматичний інжектор зразка Waters 717 WISP і колонка-аміно-стовпчик Sperisorb S5 (0,25 см х 4,6 мм, 5 мкм) з рухливою фазою: ацетонітрил, метанол і 10 мМ аміак/трифторуксусна кислота, p 4,8 (64:28:8 по обсязі). Піки реєструють за допомогою випарного-мас-випарного детектора (SEDEX 55, Sedre, France) і кількісно оцінюють за Версією 2,15 Millenium 2010 Chromatography Manager фірми Waters. Зразки для аналізу розчиняють безпосередньо в етанолі або метанолі (для розчинення ліпосом).
Приклад 9
Модель легенів для тестування лікарського засобу на мишах: дослідження гострого запалення: (LPS) техніка бронхіолярного лаважа
Ліпополісахарид стінки грамвідемної клітки (LPS) використовувався для індукції, що відновлює, гострого пульмонологического запалення в миші.10-хвилинна експозиція Е. coli 055:B5 LPS (Sigma) аерозолю, випущеного з розпилювача PBsj 1600 (концентрація в резервуарі 100 мкг/мол; доставлена доза 60 нг), викликала сильний флогістичну відповідь, що визначено шляхом акумуляції PMN в альвеолах у відповідь на вироблення хемотаксических цитокінів (визначно на 3 годині; пік відповіді на 6 годині після стимулу). У різний час після застосування аерозолю LPS мишей забивали під метоксифлурною анестезією й знекровлювали через абдомінальну аорту. У трахею хірургічним шляхом вставлялася канюля з PE50 трубкою (зовнішній діаметр 0,965 мм. Clay Adams). Використовуючи збалансований розчин солей по Хенксу в загальному обсязі 2,0 мл (HBSS; Ca/Mg вільний з EDTA), легені зрошували 5 мінут обсягом приблизно в 1,0 мол. Вихід звичайно становив 85 відсотків витягу лаважної рідини. Отримані в результаті білі клітки підраховували за допомогою гемоцитометру, піддавали цитоцентріфугуванню й офарблювали. По різних підрахунках ефект лікарського засобу відзначається по зниженню кількості білих кліток і по зменшенню кількості PNM і/або міелопероксидази позитивних кліток щодо постійних макрофагів і/або міелопероксидази негативних кліток. Це дослідження використовується як стандарт для тестування режиму дії аерозолів, що містять лікарський засіб/ліпосоми, на біологічну активність за допомогою зменшення гострого запального клітинного розростання дихальних шляхів. Фіг. 7 показує протизапальний ефект високих доз Bud-DLPC на легеневий бронхоальвеолярний лаваж (BAL) лейкоцитів у відповідь на виклик LPS (ендотоксину).
Приклад 10
Цитологія: легеневий лаваж Клітинні препарати (лаваж, тимоцити, лімфовузли або спленоцити) підраховувалися на гемоцитомітрі, піддавалися цитоцентрифугуванню на слайди (використовуючи Miles Cyto-Tek) і офарблювалися за допомогою Wright-Giemsa. May-Grunwald-Giemsa або лейкоцитарна пероксидаза прямо залежить від способу готування. Диференціальний підрахунок був зроблений шляхом мікроскопічного спостереження з масляної імерсії. Біологічний ефект режиму застосування аерозолю з комплексом лікарський засіб-ліпосоми відзначався по зниженню загальної кількості білих кліток і по зниженню числа PMN або міелопероксидази позитивних кліток щодо звичайних макрофагів.
Приклад 11
Інгібірувані антиген/мітоген індукованого лімфоцитарного бластогенезу in vitro за допомогою Cs, виділеного із тканини легенів миші, після аерозольної доставки Cs-DLPC ліпосом (див. табл.A)
Біологічна активність Cs, доставленого в легені з ліпосомним аерозолем. Первинна імунна відповідь для тестування була викликана в пов'язаній із бронхами лімфоїдної тканини й у пов'язаних з легенями медіастинальних лімфатичних вузлах. Після місцевої інтраназальної імунізації мишей лінії Balb/c обложеним квасцами яєчним альбуміном ( AP-OVA (80 мкг), доповнений вакциною Bordetella pertussis) мишей забивали через 7 днів, медіастинальну тканину видаляли й ізолювали лімфоцити для аналізу in vitro. Дослідження проліферації складається в зміні в стимулюванні лімфоцитів після активації сенсибілізіруючим антигеном яєчним білком або неспецифічним T-Клітинним мітогеном, Con А плюс з’єднаною з культурою Cs ізольований із тканини легенів миші при твердофазної екстракції при ВЕЖХ. Поглинання 3[H]-Td у ДНК визначалося протягом 48-72 годин. Інгібірування специфічної або неспецифічної активації лімфоцитів було продемонстровано шляхом знищення або зменшення антиген-специфічного стимулювання або в інгібірування нечутливості до мітогену.
Приклад 12
Фізико-хімічний аналіз.
Просторовий натяг і в'язкість: Просторовий натяг (дини/див) виміряється з використанням Tensiomat (Model 21, Fisher Scientific, Indiana, PA).Платино-Іридієве кільце відомого розміру було піднято з поверхні рідини для тестування при точно контрольованих умовах. "Гадане" значення з дисплея приладу множать на фактор корекції, що включає розмір вимірювального кільця, щільність рідини й інші параметри (відповідно до інструкції виготовлювача). Вимір в'язкості проводять із використанням віскозиметра Gilmont Falling Ball (Gilmont Instruments, Barrington, IL). В'язкість у сантипуазах визначають при кімнатній температурі навколишнього середовища.
Вимір розміру комплексу лікарський засіб-ліпосоми: розмір часток комплексу лікарський засіб-ліпосоми вимірюють із Nicomp Model 370, Submicron Particle Sizer (Program Version 5,0 Nicomp Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA). Зразки комплексу лікарський засіб-ліпосоми, диспергірувані у воді, аналізували відповідно до інструкції виробника й дані виражали як розмір зважених везикул. Комплекс лікарський засіб-ліпосом має на увазі, що діаметр часток вимірюють із резервуарних зразків у початковому періоді через 10 хвилин розпилення й з аерозольних зразків, виділених з використанням відсікувача AGI-4, як описано Waldrep et al., Int'l J. of Pharmaceutics 97: 205-12 (1993).
Результати на фіг. 9 (графік побудований для концентрації DLPC) демонструють, що відбувається збільшення виходу аерозолю DLPC ліпосом до 170 мг/мл зі зменшенням виходу при більше високих концентраціях. Поширення цих даних на Cs-DLPC ліпосоми дає подібні результати з максимальним ліпосомним аерозольним виходом з 21,3 мг Cs: 160 мг DLPC/мол (фіг. 9). Для ліпосом Bud-DLPC максимальний вихід DLPC аерозолю був продемонстрований з готовою препаративною формою, що складається з 12,5 мг Bud:187,5 мг DLPC/мл. Аналіз порушень розпилення рідкої індиферентної речовини, продемонстрований на фіг. 10 (графік побудований для DLPC), показує залежне від концентрації зниження виходу, як визначено по масі, перетвореної в аерозоль у хвилину.
З підвищенням концентрації ліпосом відбувається супутнє подібне ж підвищення виходу аерозолю аж до критичної крапки (фіг. 11) (графік побудований для концентрації лікарського засобу). Вимір виходу аерозольного лікарського засобу Cs і Bud при ВЕЖХ аналізі показує максимальні концентрації для розпилення (фіг. 11). Для Cs-DLPC ліпосом максимальний вихід становив 21,3 мг Cs: 160 мг/мл. Для Bud-DLPC максимум становив 12,5 мг Bud:187,5 мг DLPC. Фізико- хімічний аналіз цих ліпосомних готових препаративних форм демонстрував паралельне підвищення в'язкості (графік побудований для концентрації DLPC) (фіг. 12). Результати для DLPC, Bud-DLPC і CsA-DLPC були однаковими. В'язкість готових препаративних форм Bud-DLPC була приблизно на 20 відсотків менше, ніж тільки для порожнього DLPC. В'язкість Cs-DLPC була непохитно самою низкою й коливалася між 16 мг Cs/120 мг DLPC і 24 мг Cs/180 мг DLPC/мол. Ці результати припускають, що для кожної готової препаративної форми існує максимальна в'язкість, сумісна з розпиленням аерозолю; вище цих значень не існує додаткового виходу з підвищеною концентрацією комплексу лікарського засобу-ліпосоми.
Результати на фіг. 13 (графік побудований для концентрації DLPC) демонструють, що додавання Cs і Bud до DLPC ліпосомам викликає зниження в просторовому натягу готової препаративної форми. Зниження просторового натягу залежить від концентрації, досягаючи плато при близько 100 мг DLPC/мол. Не існує певного зв'язку між аерозольним виходом ліпосомної готової препаративної форми й просторовим натягом. Однак, з підвищенням концентрації липосомной готової препаративної форми відзначається інверсивне споріднення між просторовим натягом і вимірами в'язкості.
Аналізи готових препаратів комплексу лікарський засіб-липосомы до розпилення при квазіпружному світлорозсіюванні демонстрували гетерогенний стартовий діапазон розміру часток приблизно від 2,2 до 11,6 мкм (це в або біля верхньої точної межі Nicomp 370). Після розпилення визначені мінімальні розходження між будь-якими готовими препаративними формами. Розмір часток ліпосом усередині резервуара для розпилення становив 294-502 нм, і зразки аерозолю збирали за допомогою відсікувача AGI- 4, у діапазоні від 271 до 555 нм.
Готові високодозовані препарати лікарський засіб-ліпосоми, що складаються з 10 мг Bud:150 мг DLPC і Cs 20 мг:DLPC 150 мг, обрані для подальшого аерозольного вивчення. Аналізи з каскадним вимірником ударів Андерсена показують значення 2,0 мкм MMAD/1,5 GSD для Bud-DLPC і 2,0 мкм/1,8 для s-DLPC (таблиця 1). Аналізи цих готових препаративних форм на моделі, що імітує легені людини, при 15 ВРМ і 500 мл загального обсягу демонструють, що за 3 хвилини вдихання можна вдихнути 1000 мкг денної дози Bud у ліпосомах, а за 12 хвилин аж до 5000 мкг (таблиця 1). Результати вдихання Cs-DLPC на моделі легенів людини демонструють, що з високими дозами Cs-DLPC потрібно 4 хвилини для вдихання 5000 мкг що розпорошується Cs у ліпосомах; 11,5 хвилин потрібно для вдихання 15000 мкг Cs (таблиця 1). Ці результати демонструють високу здатність ліпосом для аерозольної доставки лікарського засобу.
Справжній винахід ставиться до високодозованої ліпосомної аерозольної композиції циклоспорину A, що містить до близько 30 мг/мл циклоспорину A у до близько 225 мг фосфоліпіду/мл вихідної концентрації в резервуарі. Переважно, ліпосомна аерозольна композиція містить до близько 21,3 мг/мл циклоспорину A у до близько 160 мг фосфоліпіду/мл вихідної концентрації в резервуарі. Звичайно відповідно до винаходу, у ліпосомної аерозольної композиції із циклоспорином A розмір часток, як обмірювано методом аеродинамічного діаметра по медіані маси, перебуває на рівні від близько 1,0 мкм до близько 3,0 мкм. Крім того, у циклоспорин A ліпосомної аерозольної композиції співвідношення циклоспорину A і фосфоліпіду становить від близько 1 до близько 7,5. Переважно, фосфоліпід обраний із групи, що складає з фосфатидилхоліду яєчного білка, фосфатидилхоліду гідрованих соєвих бобів, дімірістоіфосфатіділхоліду, діоліеолілдіпальмітоілеолілфосфатіділхоліду й діпальмітоїл фосфатіділхоліду. У цілому, ліпосомна аерозольна композиція із циклоспорином A відповідно до винаходу може бути використана для лікування імунологічних легеневих захворювань. Переважно, подібні імунологічні легеневі захворювання обрані із групи, що складає з реакції відторгнення трансплантата, бронхолітичною облітерацією, алергії, гіперчутливості й астми.
Справжній винахід також стосується високодозованої будезонід-ліпосомної аерозольної композиції, що складає з до близько 15 мг/мл будезоніду до близько 225 мг фосфоліпіду/мл вихідної концентрації в резервуарі. Переважно, будезонид-липосомная аерозольна композиція містить до близько 15 мг/мл будезоніду до близько 225 мг фосфоліпіду/мол стартової концентрації в резервуарі. Для будезоніду-ліпосомної аерозольної композиції відповідно до винаходу розмір часток, обмірюваний по діапазоні аеродинамічного діаметра по медіані маси, перебуває на рівні від близько 1,0 мкм до 2,0 мкм. У цілому, будезонід-ліпосомна аерозольна композиція має співвідношення будезоніду до фосфоліпіду від близько 1 до близько 15. Характерні приклади фосфоліпідів дані вище. Звичайно будезонід-ліпосомна аерозольна композиція може використовуватися для лікування імунологічних і запальних легеневих захворювань.
Характерні приклади імунологічних і запальних легеневих захворювань наведені вище. Циклоспорин A побічно інгібірує запалення шляхом блокади імунної відповіді. Будезонід інгібірує як імунні відповіді, так і запалення. Ці легеневі захворювання мають обидва компоненти.
Справжній винахід, крім того, спрямовано на спосіб лікування хворих, що мають імунологічні легеневі захворювання, що включає етап призначення даному хворому фармакологічно прийнятної дози циклоспорину A. Справжній винахід, крім того, спрямовано на спосіб лікування хворих, що мають імунологічне легеневе захворювання, що включає етап призначення названому хворому фармакологічно прийнятної дози аерозольної композиції будезонід-ліпосоми. Одержання підходящих фармацевтичних композицій і концентрацій для застосування за наведеною методикою очевидні для кваліфікованих фахівців.
Справжній винахід також спрямований на ліпосомну аерозольну композицію із циклоспорином A, що містить до близько 30 мг/мл циклоспорину A у до близько 225 мг дилауроїлфосфатидилхоліну/мл вихідної концентрації в резервуарі. Крім того, пропонується високодозована аерозольна будезонід-ліпосомна композиція, що містить до близько 15 мг/мл будезоніду в до близько 225 мг ділауроілфосфатидилхоліну/мл вихідної концентрації в резервуарі.
Справжній винахід ставиться в цілому до високодозованих ліпосомних аерозольних композицій, що містять біля 12-30 мг/мл фармацевтичного з'єднання й біля 130-375 мг фосфоліпіду/мол вихідної концентрації в резервуарі. Наприклад, справжній винахід ставиться до протизапальних глюкокортикоїдам, імуносупресивним з'єднанням, противогрибковим з'єднанням, антибіотиків, противірусним з'єднанням і протираковим з'єднанням, що доставляється за допомогою ліпосомної аерозольної композиції у фосфоліпіді з високою дозою.
Будь-які патенти й публікації, згадані в даному описі, ілюструють лише рівень техніки в області винаходу. Ці патенти й публікації включені тут у вигляді посилань.
Справжні приклади з описаними способами, методиками, лікуванням і специфічними з'єднаннями наведені як кращі втілення й не обмежують обсяг заявленого винаходу.
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Високодозована ліпосомна аерозольна композиція, що містить 12-30 мг/мл циклоспорину А або будезоніду й 130-375 мг/мл фосфоліпіду в надчистій воді, що перебуває в ємності розпилювача.
2. Композиція по п.1, що відрізняється тим, що містить до близько 30 мг/мл циклоспорину А и до близько 225 мг фосфоліпіду/мол вихідної концентрації в резервуарі.
3. Композиція по п.1, що відрізняється тим, що містить до близько 21,3 мг/мл циклоспорину А до близько 160 мг фосфоліпіду/мол вихідної концентрації в резервуарі.
4. Композиція по п.1, що відрізняється тим, що розмір часток названих ліпосом перебуває в діапазоні від близько 1 мкм до близько 3,0 мкм.
5. Композиція по п.1, що відрізняється тим, що відношення циклоспорину А к фосфоліпіду становить від близько 1 до близько 7,5.6.
6. Композиція по п.1, що відрізняється тим, що фосфоліпід обраний із групи, що складає з фосфатидилхоліду яєчного жовтка, фосфатидилхоліду гідрованих соєвих бобів, дімірістоіфосфатіділхоліду, ділауроїлфосфатидилхоліну, діоліеолілдіпальмітоілеолілфосфатіділхоліду й діпальмітоїл фосфатіділхоліду.
7. Композиція по п.1, що відрізняється тим, що неї використовують для лікування імунологічних легеневих захворювань.
8. Композиція по п.7, що відрізняється тим, що імунологічні легеневі захворювання являють собою групу, що складається з відторгнення трансплантата, бронхолітичної облітерації, алергії, гіперчутливості й астми.
9. Композиція по п.1, що відрізняється тим, що містить до близько 15 мг/мл будезоніду й до близько 225 мг фосфоліпіду/мл вихідної концентрації в резервуарі, причому розмір часток названих ліпосом при зміні аеродинамічного діаметра по медіані маси перебуває в діапазоні від близько 1,0 мкм до близько 3,0 мкм.
10. Композиція по п. 9, що відрізняється тим, що містить до близько 12,5 мг/мл будезоніду в до близько 187,5 мг фосфоліпіду/мл вихідної концентрації в резервуарі.
11. Композиція по п.9, що відрізняється тим, що відношення будезоніду до фосфоліпіду становить від близько 1 до близько 15.12.
12. Композиція по п. 9, що відрізняється тим, що фосфоліпід обраний із групи, що складає з фосфатидилхоліду яєчного жовтка, фосфатидилхоліду гідрованих соєвих бобів, дімірістоіфосфатіділхоліду, ділауроїлфосфатидилхоліну, діоліеолілдіпальмітоілеолілфосфатіділхоліду й діпальмітоїл фосфатіділхоліду.
13. Композиція по п.9, що відрізняється тим, що неї використовують для лікування імунологічних і запальних легеневих захворювань.
14. Композиція по п.13, що відрізняється тим, що названі імунологічні й запальні легеневі захворювання являють собою групу, що складається з відторгнення трансплантата, бронхолітичної облітерації, алергії, гіперчутливості й астми.
15. Високодозована ліпосомна аерозольна композиція із циклоспорином А, що містить до близько 21,3 мг/мл циклоспорина А в до близько 160 мг ділауроїлфосфатидилхоліну/мл початкової концентрації в резервуарі.
16. Високодозована ліпосомна аерозольна композиція з будезонідом, що містить до близько 12,5 мг/мл будезоніду в до близько 187,5 мг ділауроїлфосфатидилхоліну/мл початкової концентрації в резервуарі, що відрізняється тим, що діапазон розміру часток названої ліпосоми, як обмірювано по аеродинамічному діаметрі по медіані маси, становить від близько 1,0 мкм до близько 3,0 мкм.
Висновки
В курсовій роботі я провела дослідження технології аерозольних лікарських форм промислового виробництва, визначила переваги та недоліки аерозольних лікарських препаратів. Внаслідок проведених аналізів зрозуміла, що аерозолі досить широко застосовуються в медичній практиці, особливо при таких захворюваннях як Бронхіальна астма, хронічне обструктивне захворювання легень, а також, що досить широкий арсенал фармакологічних засобів для інгаляції пропонується в аптечній мережі, до них відносять такі:
- Сальбутамол (Вентолін, Сальгім); Тербуталін (Бриканія), Фенотерол (Беротен), Іпратронію бромід (Атровент), Іпратронію бромід + фенотерол (Беродуал), Беклометазона дипропіонат (Бекломет, Беладон “ Легке дихання”), Будесоніт
8-09-2015, 23:30