Опрацювання складу, технології та дослідження вагінальних супозиторіїв противірусної дії з протефлазідом

Кількісний вміст флавоноїдів у перерахунку на рутин визначали розробленим нами спектрофотометричним методом при довжині хвилі л = 405 нм. За даними статистичної обробки результатів кількісного аналізу відносна похибка визначення флавоноїдів не перевищує ± 5,4 %.

При стандартизації вагінальних супозиторіїв з Протефлазідом вивчали показники якості та незмінність цих показників у процесі зберігання згідно з вимогами ДФ України: опис, однорідність маси, однорідність вмісту, ідентифікація, кількісне визначення, розпадання, розчинення, мікробіологічна чистота. Всі показники відповідають вимогам ДФУ, встановленим для вагінальних супозиторіїв (табл.3).

За допомогою періодичного контролю (з інтервалом у 6 місяців) встановлено незмінність показників якості вагінальних супозиторіїв з Протефлазідом протягом двох років зберігання.

Таблиця3

Фізико-хімічні показники супозиторіїв з Протефлазідом

У четвертому розділі наведені результати імунофармакологічних та біологічних досліджень.

Імунофармакологічні дослідження проводили на кафедрі клінічної лабораторної діагностики ЛНМУ імені Данила Галицького. Консультативну допомогу на всіх етапах проведення цих досліджень надавав д.мед.н., проф. Б.Д.Луцик, за що автор висловлює щиру подяку.

Вивчення впливу Протефлазіду на лімфоцити проводили з тією частиною донорів, які мали лімфоцити з високою проліферативною активністю при культивуванні їх з фітогемаглютиніном (ФГА). Рецепторну характеристику лімфоцитів після БТЛ наведено у табл.4.

Результати досліджень свідчать, що у всіх серіях бласттрансформація лімфоцитів проходить за рахунок Т-хелперів. У процесі БТЛ на клітинах зберігаються маркери до нейтрофілів та до В-лімфоцитів. При порівнянні між апоптозозалежними лімфоцитами (CD 95) у трьох серіях дослідів різниця була істотною, критерій Стьюдента (t=3,7) й істотність різниці (Р < 0,004).

Різниця при порівнянні між В-лімфоцитами (СД-19), нейтрофілами (СД-16), Т-хелперами (СД-4) та Т-супресорами (СД-8) у всіх серіях дослідів не істотна. Протефлазід має виражений імуномодулюючий вплив на лімфоцити людини, знижуючи апоптозозалежність лімфоцитів. У процесі БТЛ з ФГА, Протефлазідом та екстрактом елеутерокока залишаються функціонально активними імунні синапси на лімфоцитах до моноклональних антитіл (СД-16, 19, 95).

Білковий спектр сироватки крові та культуральної рідини після БТЛ досліджували для вивчення можливого впливу Протефлазіду на білки плазми крові. Протефлазід та екстракт елеутерокока, перебуваючи в контакті з лейкоцитами і білками упродовж 3-х днів у застосованих концентраціях, не денатурують білки (зберігаються їх ізоелектрична точка і молекулярна маса, що забезпечує їх електрофоретичне розділення).

Нами вивчено вплив Протефлазіду на В-лімфоцити (при дослідженні invitro) при визначенні імуноглобулінів сироватки крові донорів і культуральної рідини після БТЛ. ФГА, Протефлазід та екстракт елеутерокока, перебуваючи в контакті з лейкоцитами протягом 3-х днів у застосованих концентраціях, не активують В-лімфоцити до продукції імуноглобулінів.

Таблиця 4

Рецепторна характеристика лімфоцитів після реакції БТЛ

Цитокіни (г-інтерферон та 1b-інтерлейкін) у сироватці крові донорів і культуральних рідинах після бласттрансформації лімфоцитів з ФГА, Протефлазідом та екстрактом елеутерокока вивчали для визначення функціональної активності лімфоцитів. В утворенні г-інтерферону приймають участь Т-хелпери. Більшість клітин людського організму можуть продукувати 1b-інтерлейкін, але для цього вони повинні бути активовані.

На даний час активно вивчається значення цього інтерлейкіну для ендокринної системи, фібробластів, епітеліальних клітин, остеокластів, клітин головного мозку, гепатоцитів та інших систем. Результати дослідження наведено в табл.5.

Таблиця 5

Гама-інтерферон і інтерлейкін-1b у сироватці крові і культуральних рідинах після бласттрансформації лімфоцитів

1 (b) –БТЛ під впливом ФГА; 2 (с) – БТЛ під впливом ФГА і Протефлазіду;

3 (d) – БТЛ під впливом ФГА та екстракту елеутерокока

Під впливом ФГА, Протефлазіду та екстракту елеутерокока значно зростає концентрація г-інтерферону (різниця істотна). При порівнянні концентрації g-інтерферону у культуральних рідинах з Протефлазідом та екстрактом елеутерокока не було істотної різниці: t – 0,27, P> 0,7. Протефлазід виступає в ролі супресора продукції прозапального цитокіна (1в-інтерлейкіну) лімфоцитами (при порівнянні з ФГА, різниця достовірна).

Результати проведених досліджень показали, щоПротефлазід стимулює продукцію г-інтерферону лімфоцитами людського організму invitro в процесі БТЛ. На фоні ФГА (invitro в процесі БТЛ) Протефлазід виступає інгібітором прозапального цитокіна 1в-інтерлейкіну.

Протигерпетичну активність супозиторіїв з Протефлазідом вивчали на моделі генітальної герпетичної інфекції морських свинок у порівнянні з Протефлазідом. Встановлено, що супозиторії з Протефлазідом, як і Протефлазід, мають протигерпетичну активність.

Дослідження місцевоподразнюючої дії супозиторіїв з Протефлазідом проводили на базі Центральної науково-дослідної лабораторії та лабораторії промислової токсикології ЛНМУ імені Данила Галицького (зав.лабораторії д.мед.н., проф. Б.П.Кузьмінов). Встановлено, що супозиторії з Протефлазідом не виявляють місцевоподразнюючої дії на слизову оболонку піхви дослідних тварин.

ВИСНОВКИ

1. На основі вивчення асортименту противірусних лікарських засобів встановлено, що на фармацевтичному ринку України широко представлені засоби для системного лікування вірусних захворювань, проте номенклатура противірусних засобів для місцевого застосування недостатня, зовсім відсутні засоби для ректального і вагінального застосування.

2. Теоретично обґрунтовано актуальність розробки противірусного засобу у формі вагінальних супозиторіїв для місцевого лікування герпес-вірусних захворювань урогенітальної системи. У результаті пошуку ефективних противірусних засобів в Україні встановлено, що перспективним засобом є Протефлазід - препарат, який за механізмом дії належить як до віростатиків (пригнічує ДНК-полімеразу у клітинах, інфікованих вірусами герпесу, ВІЛ), так і до інтерфероногенів (збільшує продукцію ендогенного альфа- і гама-інтерферону), а також сприяє підвищенню загального рівня імунного статусу організму, тобто діє як своєрідний адаптоген.

3. На основі проведених технологічних, фізико-хімічних, біофармацевтичних та біологічних досліджень вперше запропоновано склад і розроблено технологію вагінальних супозиторіїв з Протефлазідом. Як оптимальну основу для супозиторіїв з Протефлазідом запропоновано суміш поліетиленоксидів 400 і 1500 у співвідношенні 2:8.

4. Проведено оцінку якості запропонованих супозиторіїв з Протефлазідом згідно з вимогами ДФ України. Розроблено спектрофотометричний метод стандартизації Протефлазіду і супозиторіїв з Протефлазідом за сумою флавоноїдів у перерахунку на рутин (як основних діючих речовин Протефлазіду). Відносні похибки методу становлять ± 3,12 % і ± 5,40 % відповідно.

5. Вивчено стабільність запропонованих супозиторіїв при зберіганні при кімнатній температурі (18±2°С) і в умовах холодильника (4±1°С). Встановлено, що при зберіганні супозиторії з Протефлазідом є стабільними, що підтверджується наступними показниками: зовнішній вигляд, середня маса, однорідність маси, однорідність вмісту, час розчинення, ідентифікація та кількісний вміст флавоноїдів, мікробіологічна чистота. На підставі проведених експериментальних досліджень встановлено термін зберігання супозиторіїв (не менше 2-х років). Доведено відсутність взаємодії між компонентами супозиторіїв за допомогою хроматографічного методу у тонкому шарі сорбенту на пластинках Silufol.

6. Запропонована модель дослідження противірусної активності лікарських речовин на основі реакції бласттрансформації лейкоцитів людини під впливом фітогемаглютиніну з наступним фенотипуванням трансформованих лімфоцитів моноклональними антитілами та дослідженням культуральної рідини на наявність цитокінів. Імунофлюоресцентний метод за допомогою моноклональних антитіл та дослідженням культуральної рідини (після бласттрансформації) можна застосовувати для вивчення імунної активності противірусних засобів.

7. Імунофармакологічні дослідження Протефлазіду, вперше проведені на культурі клітин людини, показали, що Протефлазід є активатором продукції гама-інтерферону, виступає інгібітором прозапального цитокіна і знижує апоптозозалежність лімфоцитів.

8. У результаті біологічних досліджень доказано протигерпетичну активність розроблених супозиторіїв з Протефлазідом, доведено відсутність місцевоподразнюючої дії супозиторіїв на слизову оболонку піхви дослідних тварин.

9. Розроблено технологічну і апаратурну схеми виробництва, інструкцію щодо виготовлення супозиторіїв з Протефлазідом в умовах аптек, проект аналітичної нормативної документації на запропонований лікарський засіб, проект технологічного регламенту на виробництво супозиторіїв з Протефлазідом.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Імунокоригуючий вплив Протефлазіду на лейкоцити донорів / Ф.Зейдо, Б.Д.Луцик, Т. М.Федоришин, Л. Є. Лаповець,О. О.Ястремська // Фармац. журнал. – 2006. – № 2. – С.90-93 (Особистий внесок дисертанта: літературний пошук, участь у експериментальній частині досліджень, аналіз результатів і підготовка статті до друку).

2. Зейдо Фірас, Луцик Б.Д., Лозюк Л.В. Супозиторії з Протефлазідом (клініко-фармацевтичні аспекти) // Фармац. журнал. – 2006. – № 4. - С.70 –73 (Особистий внесок: розробка складу і технології супозиторіїв, аналіз матеріалу, підготовка статті).

3. Деклараційний патент на корисну модель UA 4337 7 А61 К9 /02, затв. 17.01.2005, Бюл № 1. Супозиторій противірусний / Л.В.Лозюк, Б.Д.Луцик, Ф.Зейдо (Особистий внесок: патентний пошук, розробка оптимального складу супозиторіїв, оформлення матеріалів патенту).

4. Супозиторії з ізатізоном на основі поліетиленгліколю з противірус-ною активністю (клініко-фармацевтичні аспекти) / Ф.Зейдо, Б. Д.Луцик, Л. В.Лозюк, Р. М. Лозюк // ActaMedica (Львівський медичний часопис). – 2005. – т. Х1, № 1. – С.67-69 (Особистий внесок: інформаційний пошук, виготовлення супозиторіїв, підготовка статті).

5. Застосування препарату "Протефлазід" у лікуванні вірусних ендо-цервіцитів, ерозій шийки матки / Б.Д.Луцик, С.О.Кравець, В.А. Філіпський, Ф. Зейдо // Медицина залізничного транспорту України. – 2003. – № 4. – С. 57-59 (Особистий внесок: інформаційний пошук, аналіз результатів і підготовка матеріалу до публікації).

6. Зейдо Фирас, Луцик Б. Д., Сорокивська С. А. Протефлазид в комплексном лечении вирусных инфекций // InternationalJournalonImmunorehabilitation. Выпуск “Физиология и патология иммунной системы”. – 2004. – Т. 6. – № 1. – С. 108-109 (Особистий внесок: участь у дослідженнях, аналіз результатів і підготовка матеріалу до публікації).

7. Зейдо Фирас, Луцик Б. Д. Исследование Протефлазида на культуре клеток человеческого организма. // Аллергология и иммунология. – 2004. – Т. 5.- № 1. - С. 91-92 (Особистий внесок: участь у дослідженнях, підготовка матеріалу до публікації).

8. Зейдо Фірас, Луцик Б. Д. Дослідження Протефлазіду на культурі клітин людського організму // Тези доповідей Х конгресу світової федерації Українських лікарських товариств. – Чернівці-Київ-Чикаго, 2004. – С. 518 - 519 (Особистий внесок: участь у дослідженнях, підготовка тез до публікації).

9. Зейдо Фірас, Луцик Б. Д., Лаповець Л. Є. Дослідження імуномодулюючого впливу Протефлазіду на лейкоцити здорових донорів // Українські медичні вісті (Науково-практичний часопис Всеукраїнського лікарського товариства). - Київ. – 2005. – Т. 6 (1-2). – С.205-206 (Особистий внесок: участь у дослідженнях, оформлення матеріалів і підготовка до публікації).

АНОТАЦІЯ

Зейдо Фірас Мазен. Опрацювання складу, технології та дослідження вагінальних супозиторіїв противірусної дії з Протефлазідом. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.01 – технологія ліків та організація фармацевтичної справи. – Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Львів, 2008.

Дисертацію присвячено розробці складу, технології та дослідженню лікарського засобу у формі супозиторіїв для лікування вірусних інфекцій урогенітальної системи. Вперше теоретично та експериментально обґрунтовано склад і раціональну технологію супозиторіїв на гідрофільній основі, діючими речовинами яких є рослинний екстракт Протефлазід.

Проведено дослідження показників якості запропонованого лікарського засобу, розроблено методики ідентифікації та кількісного визначення діючих речовин, вивчено стабільність опрацьованих супозиторіїв у процесі зберігання.

В результаті імунофармакологічних досліджень встановлено, що Протефлазід має виражений імуномодулюючий вплив на лімфоцити людини, знижуючи апоптозозалежність лімфоцитів. На фоні фітогемаглютиніну (invitro в процесі бласттрансформації) Протефлазід виступає інгібітором прозапального цитокіна 1в-інтерлейкіну.

Ключові слова : Протефлазід, вагінальні супозиторії, противірусна активність, бласттрансформація.

АННОТАЦИЯ

Зейдо Фирас Мазен. Разработка состава, технологии и иссл е дование вагинальн ы х суп п озитор иев проти во в и русно го действия с Протефлаз и дом. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.01 – технология лекарств и организация фармацевтического дела. – Львовский национальный медицинский университет имени Данила Галицкого, Львов, 2008.

Впервые проведено комплексное исследование с целью создания противовирусного средства для местного применения – вагинальных суппозиториев с Протефлазидом – жидким экстрактом из растенийDeschampsia caespitosa L. и Calamagrostis epigeios L. Основные биологически ак­тивные вещества Протефлазида- флавоноидные гликозиды, которые по химической структуре идентичны кверцетину и рутину. Флавоноидные гликозиды способны подавлять вирусспецифические ферменты тимидинкиназу и ДНК - полимеразу в вирусинфицированных клетках. Это приводит к снижению способности или к полному блокированию репликации вирусных белков и, как следствие, препятствует размножению вирусов.

Выбор оптимальной основы был произведен в результате технологических и биофармацевтических исследований с использованием основ гидрофобного и гидрофильного характера. Из семи изученных основ как оптимальная основа для суппозиториев с Протефлазидом выбрана полиэтиленоксидная основа (сплав ПЭО 400 и ПЭО 1500 в соотношении 2:8). Теоретически и экспериментально обосновано количество Протефлазида в суппозиториях.

В процессе разработки рациональной технологии суппозиториев с Протефлазидом были изучены такие параметры, как порядок смешивания компонентов, температурный режим, отсутствие взаимодействия между компонентами суппозиториев.

Разработаны технологическая и аппаратурная схемы производства суппозиториев с Протефлазидом.

Предложены методики качественного и количественного анализа основных действующих веществ в Протефлазиде и суппозиториях с Протефлазидом. Идентификацию флавоноидов проводили по реакции с алюминия хлоридом и хроматографическим методом, определение фенолокислот – хроматографическим методом.

Для количественного определения флавоноидов (в перерасчете на рутин) предложена методика спектрофотометрического определения при длине волныл=405 нм. Относительная ошибка метода не превышает ±5,4 %.

При стандартизации вагинальных суппозиториев с Протефлазидом изучали показатели качества и стабильность этих показателей в процессе хранения согласно требованиям ГФ Украины: описание, однородность массы, однородность содержания, идентификация, количественное определение, распадание, растворение, микробиологическая чистота. В результате периодического контроля (с интервалом в 6 месяцев) установлена стабильность показателей качества вагинальных суппозиториев на протяжении 2-х лет хранения при комнатной температуре (18±2°С) и в условиях холодильника (4±1°С).

Суппозитории с Протефлазидом проявляют выраженную антивирусную активность и не оказывают местнораздражающего действия.

Результатыиммунофармакологических исследованийпоказали, что Протефлазид имеет выраженное иммуномодулирующее влияние на Т- лимфоцитычеловека, снижая апоптозозависимость лимфоцитов. На фоне фитогемаглютинина (invitro в процессе бласттрансформации) Протефлазид являетсяингибитором провоспалительного цитокина 1в-интерлейкина.

Ключевые слова : Протефлазид, вагинальные суппозитории, антивирусная активность, бласттрасформация.

SUMMARY

Zidou Feras Mazen. Elaboration of composition, technology and investigation of vaginal suppositories with antiviral activity containing proteflazid. - A typescript

Thesis for a Candidate of Pharmaceutical Sciences in specialty 15.00.01 "Technology of drugs and organization of pharmaceutical business".- Danylo Halytsky Lviv National Medical University Ministry of Public Health of Ukraine, Lviv, 2008.

The thesis concerns on the elaboration of composition, technology and investigation of suppositories for the treatment of viral infections of urogenital system. For the first time theoretical of background, experimental composition and rational technology for the production of suppositories on hydrophylic base containing plant extract Proteflazid has been proposed. Quality control of the proposed preparation has been accomplished, methods of identification and quantitative analysis of active ingredients has been elaborated, and stability of developed suppositories during storage has been studied. Based on the results of immuno-pharmacological investigations, which revealed decreased apoptozodependancy of human lymphocytes, strong immunocorrective activity of Proteflazid was demonstrated. In vitro investigations of blast-transformation in the presence of phytohemagglutinin proved that Proteflazid acts as inhibitor of pro-inflammatory


8-09-2015, 22:33