Методи статистичного аналізу.
Результати клінічного й лабораторного дослідження хворих досліджуваних груп опрацьовували за відомими методами статистичного аналізу.
Математичне опрацювання основних показників виконували на ЕОМ БЕСМ-6 обчислювального центру НВО "Хартрон", а також із використанням статистичної програми SPSS8. При цьому обчислювали середнє арифметичне значення (М), середньоквадратичне відхилення (SD) і стандартну помилку середнього (m). Рівні значущості (p) визначали за допомогою таблиць Стьюдента – Фішера (критерію t). Статистично вірогідною приймали умову p ≤0,05.
Результати дослідження.
Біохімічна характеристика сполучної тканини аорти у хворих з АА в порівнянні з тканиною аорти в інших клінічних групах.
Для рішення поставлених завдань були досліджені 36 зразків тканини аорти, отриманих при післяопераційній біопсії (АА1 "гладенька" й "шорсткувата" ділянки, СЛ та контроль – КА) і 9 зразків тканини аорти (АС), отриманих у результаті автопсії. В цьому матеріалі визначали вміст оксипроліну (ОПР), тирозину (ТИР), гексозамів (ГА) і гексуронових кислот (ГК), сумарних глікозаміногліканів (ГАГ) їх фракцій, що містять гіалуронову кислоту, хондроїтинсульфати, гепарансульфат. Результати дослідження представлені в таблиці 1.
Аналіз характеристик зразків сполучної тканини аорти в обраних групах показав, що "шорсткувата" (найбільш уражена атеросклеротичними бляшками) ділянка аорти, в якій зазвичай відбувається розрив, при АА1 характеризувалася нижчим рівнем вмісту неколагенових білків (за вмістом тирозину) у порівнянні з рівнем цього показника в групі з АС і контрольній групі, а також зниженням рівня протеогліканів (за вмістом гексуронових кислот) у порівнянні з АС.
Рівень колагенових білків (за вмістом оксипроліну) на цій ділянці аорти був знижений у порівнянні з контролем, а вміст гексозаміну вірогідно не відрізнявся від показника у контрольній групі. Зважаючи на зниження вмісту гексуронових кислот і тирозіну, на тлі стабільного рівня гексозамінів, зниження вуглеводних компонентів тканини аорти відбувалося за рахунок саме протеогліканів.
На відміну від "шорсткуватої" ділянки, тканина "гладенької" ділянки аорти при АА1 характеризувалася більшим вмістом колагену порівняно з АС і контролем.
У хворих з діагнозом АС вміст тирозину в стінці аорти був підвищений порівняно з контролем, а також із показниками на "шорсткуватій" та "гладенькій" ділянках аорти при АА1.
Таблиця 1. Вміст оксипроліну, тирозину, гексозамінів, гексуронових кислот у тканині аорти у хворих на АА1 у порівнянні з іншими клінічними групами й контролем (М±SD)
Показник (г на 100 г тканини) |
Клінічна група | ||||
АА1 "шорст-та" ділянка n = 9 |
АА1 "гладенька" ділянка n = 9 |
СЛ n = 9 |
АС n = 9 |
Контроль n = 9 |
|
| Оксипролін | 4,21±0,04 * | 5,67±0,19 * ** *** |
5,74±0,09 * ** *** |
4,06±0,08 * ** *** /* |
4,62±0,17 |
| Тирозин | 0,60±0,01 * ** |
0,63±0,03 ** | 0,60±0,04 ** |
0,79±0,02 * *** |
0,66±0,02 |
| Гексозаміни | 1,49±0,02 | 1,48±0,06 | 1,39±0,03 *** |
1,41±0,02 | 1,47±0,17 |
| Гексуронові кислоти | 0,37±0,02 | 0,32±0,03 ** |
не визначали | 0,41±0,02 | не визначали |
Примітки: * - вірогідно порівняно з контролем - (p ≤ 0,05);
** - вірогідно порівняно з АС - (p ≤ 0,05);
*** - вірогідно порівняно з АА1 "шорсткувата ділянка" - (p ≤ 0,05);
/* - вірогідно порівняно з АА1 "гладенька ділянка" - (p ≤ 0,05);
При СЛ вміст ОПР був вище ніж у контрольній групі, а рівні ТИР й ГА вирогідно не відрізнялися від контрольних значень (р>0,05), що зпівпадало з величинами названих показників на "гладенькій" ділянці аорти у хворих з АА1, але відрізнялося від змін у тканині аорти хворих з АС.
Результати визначення сумарного вмісту тканинних ГАГ та їх фракцій (гіалуронова кислота, хондроїтинсульфати, гепарансульфат) у стінці аорти свідчать, що при загрозі розриву аорти спостерігається вірогідне зниження вмісту хондроїтинсульфатів у порівнянні з даними контрольної групи (таблиця 2). Це узгоджується з наявними в літературі результатами визначення ГАГ у сироватці крові хворих з АА (Бабаева О.И. та ін., 2001-2003 р., Theoсharis et al., 2002), а саме з фактом збільшення в сироватці крові хворих з АА1 сумарного вмісту хондроїтинсульфатів з перевагою в них хондроїтин-6-сульфату, джерелом якого ймовірно є протеоглікани тканини аорти.
Спираючись на ці дані, ми розробили спосіб прогнозування розриву аневризми аорти на підставі визначення співвідношення сумарних ГАГ і хондроїтин-6-сульфату, що дозволило уточнити показання до загрози розриву аорти (Патент України № 52386А від 16.12. 2002). Те, що підвищення кількості тканинних ГАГ відбувається саме за рахунок руйнування хондроїтинсульфатів, підтверджує встановлене нами вірогідне підвищення гепарансульфату в тканині аорти в порівнянні з контролем.
Таблиця 2.
Вміст глікозаміногліканів та їх фракцій у тканині аорти у хворих на АА1 у порівнянні з іншими клінічними групами й контролем (М±SD)
Показник (г на 100 г тканини) |
Клінічна група | |||
АА1 "шорст-та" ділянка n = 9 |
СЛ n = 9 |
АС n = 9 |
Контроль n = 9 |
|
Гіалуронова кислота |
0,21±0,01 | 0,210±0,008 | 0, 19±0,01 | 0,18±0,05 |
| Хондроїтин-сульфати | 0,040±0,006 * | 0,060±0,008 | 0,070±0,009 | 0,060±0,006 |
| Гепарансульфат | 0,060±0,005 * | 0,05±0,01 | 0,050±0,008 | 0,040±0,003 |
| Сума ГАГ | 0,31±0,01 | 0,32±0,02 | 0,31±0,01 | 0,29±0,02 |
Примітки: * - вірогідно порівняно з контролем - (p ≤ 0,05);
** - вірогідно порівняно з АС - (p ≤ 0,05);
*** - вірогідно порівняно з АА1 "шорсткувата ділянка" - (p ≤ 0,05);
/* - вірогідно порівняно з АА1 "гладенька ділянка" - (p ≤ 0,05);
Ці кількісні зміни біохімічних компонентів у "шорсткуватій" ділянці аорти корелюють з даними морфологічних досліджень про наявність дегенеративних порушень у стінці аорти при АА1, які варіюють від слабовираженої фрагментації еластичних волокон до великих ділянок розриву й розщеплення мембран, фіброзно-м'язових елементів, що поєднується з атрофією гладком’язових клітин (мал.1)
Мал.1. Еластичні волокна на "шорсткуватій" ділянці аорти при аневризмі аорти з ділянками розривів і розщепленням еластичних мембран. Забарвлювання за Малорі.
У такий спосіб зміни складу сполучної тканини на "шорсткуватій" ділянці аорти (зниження рівня оксипроліну, тирозину, хондроїтинсульфатів і підвищення вмісту гепарансульфату) можуть слугувати показниками стану тканин аорти в період загрози її розриву. Очевидно, виявлені порушення провокують компенсаторні зміни складу сполучної тканини на "гладенькій" ділянці – вірогідне підвищення вмісту оксипроліну в порівнянні з контролем, що можна розглядати як прояв адаптивної реакції "гладенької" ділянки аорти на загрозу розриву.
Слід звернути увагу на те, що у композиційному складі сполучної тканини аорти у хворих із захворюваннями, близькими за своїм походженням (АС, АА1 і СЛ), відбуваються різні кількісні зміни. Зокрема, при СЛ вони подібні змінам на "гладенькій" ділянці аорти при АА1, а при АС спостерігається найбільше зниження вмісту оксипроліну на фоні найбільш високого вмісту тирозину, тоді як рівень гексозамінів при АС вірогідно не відрізняється від величин аналогічних показників на "шорсткуватій" ділянці аорти при АА1. Аналіз вмісту фракцій ГАГ при АС показав, що у хворих з цим захворюванням найбільш високий рівень фракції хондроїтинсульфатів у порівнянні з хворими на АА1.
Отримані дані свідчать, що кожне з даних захворювань характеризується різним ступенем змін складу сполучної тканини аорти, що необхідно враховувати при проведенні лікувальних і діагностичних заходів.
Характеристика деяких біохімічних показників запалення та системи ПОЛ й АОС у крові хворих з АА в динаміці її розвитку порівняно зі змінами в інших клінічних групах
Проведено дослідження концентрації сіалових кислот, церулоплазміну, гексоз, фібриногену, загального білка, вмісту продуктів ПОЛ, цитокінів – ІЛ-1-РА, ІЛ-4, ІЛ-6, фактора некрозу пухлини альфа – ФНП-α, вмісту серомукоїдів, глікопротеїнів, молекул середньої маси (СМ) і середньомолекулярних пептидів (СМП), а також сумарної антиоксидантної активності (АОА) і ШОЄ у хворих з АА, АА1, АА2, АС, СЛ.
Мал.2. Значення показників ШОЕ, фібриногену та загального білку в сироватці крові хворих на АА в динаміці її розвитку в порівнянні з групою контролю
На мал.2 видно, що значення ШОЄ значно підвищені в порівнянні з контрольними в усіх клінічних групах. Максимальне значення ШОЄ (64,0±2,8 мм/год) спостерігалося при аневризмі аорти із загрозою розриву (АА1), що свідчило про розвиток в організмі хворих цієї групи найбільш інтенсивного, ніж в інших групах, запального процесу. При зіставленні величини даного показника в клінічних групах у послідовності АС (230% від контрольного рівня), АА (300%), АА1 (587%) виявлено його збільшення, зокрема, дуже високий рівень (57,1±3,4 мм/год) при розриві аневризми аорти на операційному столі (АА2).
Таким чином, аналіз динаміки ШОЄ свідчить про те, що зі збільшенням загрози розриву АА в організмі хворого підсилюється вже існуючий запальний процес. Слід зазначити, що виявлена при аналізі ШОЄ закономірність – інтенсифікація запального процесу –простежується і за змінами вмісту фібриногену (104%, 148%, 151%, 131%, 180% відповідно), сіалових кислот (130%, 121%, 146%, 251%, 165% відповідно), гексоз (97%, 121%, 147%, 186%, 128% відповідно), глікопротеїнів (103%, 170%, 163%, 186%, 227% відповідно) від контрольного значення при АС, АА, АА1, АА2, СЛ (мал.3).
Мал.3. Величина показників запалення в сироватці крові хворих з варіантами АА, СЛ, АС, КА, ГІМ в порівнянні з групою контролю
З використанням проаналізованих вище параметрів був розроблений спосіб діагностики можливості розриву аневризми аорти (Патент № 26987 від 10.10. 2007 р).
Дослідження вмісту цитокінів – інтерлейкіну-6 (ІЛ-6), фактора некрозу пухлин (ФНПα), інтерлейкіну-4 (ІЛ-4), рецепторного антагоніста інтерлейкіну-1 (ІЛ-1-РА)
показало, що вміст ІЛ-6 збільшується при АС, СЛ, АА1 від 5,3±0,37 пг/мл при АС і 8,0±0,57 при СЛ до 17,25±0,55 пг/мл при АА1 відповідно на фоні значення 3,95±0,10 пг/мл при стенозі аорти (КА); вміст ФНПα вірогідно не відрізнявся в обраних групах. Зміни концентрації прозапального ІЛ-6 збігалися за спрямованістю зі змінами ШОЄ й інших показників запалення. Оскільки серед усіх обраних для дослідження клінічних групах вміст ІЛ-6 був найвищим в групі з АА1, у порівнянні з контролем, цей показник також можна розглядати як критерій загрози розриву стінки аорти (17,25±0,55 та 3,95±0,10 пг/мл відповідно). Вміст концентрації ІЛ-4 при АА1 також був істотно підвищений (18,45±0,85 пг/мл) у порівнянні із показником у групі хворих з АС (1,21±0,16 пг/мл) і СЛ (1,35±0,10 пг/мл), тобто в 15,2 та 13,7 разів відповідно.
Таким чином, підвищення рівня вмісту ІЛ-4 та ІЛ-6 при АА1 також можна віднести до індикаторів загрози розриву АА.
Результати аналізу змін концентрації СМП (табл.3) свідчать про збільшення її при АА1 і при всіх досліджуваних захворюваннях в 3,1, 3,3 рази від рівня показника в контролі.
Таблиця 3. Вміст продуктів ПОЛ, СМ, СМП та активності АОС у сироватці крові хворих з АА1, СЛ й АС у порівнянні з контролем (М±m)
Клінічна група |
ДК од/мл |
МДА мкмоль/л |
АОС % |
СМ від 500 Дт ум. од. |
СМП 500-5000 Дт ум. од. |
СМ / СМП |
1. АА1 n = 9 |
0,37±0,02* |
42,80±4,80 |
98,0±3,2 * |
0,15±0,02 |
0,098±0,010* |
1,53 |
2. СЛ n = 19 |
0,32±0,01* |
50,36±5,30 |
77,8±4,3 |
0,12±0,03 |
0,106±0,020 * |
1,13 |
3. АС n = 19 |
0,29±0,01 |
45,30±3,60 |
58,2±3,8 |
0,13±0,02 |
0,104±0,010 * |
1,13 |
4. Контроль n = 19 |
0,24±0,01 |
36,15±5,10 |
61,5±4,6 |
0,12±0,04 |
0,032±0,005 |
3,75 |
Примітка: * - зміни, вірогідні в порівнянні з контролем (p ≤ 0,05)
Визначення рівня ПОЛ у сироватці крові хворих показало відсутність змін вірогідних концентрації МДА між окремими групами (р>0,05) й вірогідне підвищення концентрації ДК у хворих з АА1 і СЛ у порівнянні з АС та контрольною групою на фоні підвищення активності АОС при АА1. Це свідчить про компенсаторне напруження системи антиоксидантного захисту в умовах загрози розриву аорти і найбільш вираженої запальної реакції. Виявлену в сироватці крові хворих на АА1 активацію АОС можна розглядати як результат посилення функції цієї системи, внаслідок чого потік суперактивних перекисів, активних форм кисню повинен зменшуватися за її участю. З іншого боку, частина перекисів не може нейтралізуватися за рахунок системи АОС у тканині аорти, що активує запалення, деструкцію екстрацелюлярного матрикса, провокує дисфункцію ендотелія. Факт збільшення вмісту СМП у сироватці крові узгоджується із припущенням про те, що частина перекисів сприяє посиленню процесів руйнування в тканині аорти чужорідних агентів, ендотоксинів (це можуть бути і власні макромолекули, що змінилися впродовж перебігу захворювання) при АА1 з подальшим їх виведенням.
Таким чином, дослідження вмісту в сироватці крові біохімічних показників запалення при АА у порівнянні із групами хворих на АС і СЛ підтвердило присутність запального компонента в патогенезі цих захворювань. Факт підвищення інтенсивності запального процесу зі збільшенням загрози розриву АА (за результатами змін ШОЕ, вмісту глікопротеїнів, сіалових кислот, фібриногену, цитокінів ІЛ-6, ІЛ-4, показників системи ПОЛ та АОС, СМП) дозволяє припустити провідну роль цього процесу в механізмі розриву аорти, що можна використати з діагностичною метою.
Для більш поглибленого розуміння механізмів розвитку даного процесу були вивчені біохімічні характеристики функціонального стану клітин крові, які також беруть участь у розвитку запалення.
Нижче представлені результати дослідження процесів ПОЛ за даними визначення вмісту дієнових кон’югатів (ДК), малонового діальдегіду (МДА) і шифових основ (ШО) у нейтрофілах, лімфоцитах й еритроцитах, виділених із крові хворих на АА із загрозою розриву (АА1), АС і СЛ. Було встановлено за допомогою коефіцієнта кореляції, що при АА1 найбільш тісний позитивний кореляційний зв'язок (r=0.9983) існує між накопиченням ДК у сироватці крові й лімфоцитах. Відносно еритроцитів і нейтрофілів встановлений негативний зв'язок (r=-0,9885 й r=-0,993). Очевидно, при АА1 основним джерелом підвищення рівня ДК у сироватці крові із трьох розглянутих нами типів клітин є лімфоцити. При АА1 при визначенні рівня МДА в еритроцитах також установлений тісний негативний зв'язок (r=-0,9992) з його рівнем у сироватці крові. Очевидно, накопичення всіх видів перекисів – ДК, МДА, ШО в еритроцитах активує АОС у сироватці, що узгоджується з підвищенням її активності. Та ж залежність спостерігається при АА1 між нейтрофілами й сироваткою крові. При АС аналіз величин коефіцієнтів кореляції при порівнянні даних у сироватці й клітинах крові показав наявність єдиного істотного позитивного зв'язку – між вмістом МДА в сироватці й еритроцитах (r=0,9999). При СЛ значущий зв'язок існує між рівнем досліджуваних показників у всіх клітинах і сироваткою крові. Так, наприклад, між накопиченням ДК і МДА в нейтрофілах і сироватці крові існує прямий позитивний зв'язок (r=0,9986 й r=0,9992), як і між накопиченням МДА й ШО в клітинах й АОА в сироватці крові.
Таким чином, при СЛ основним джерелом перекисів у сироватковому пулі є нейтрофіли, а джерелом ДК сироватки можуть бути також еритроцити (r=0,9948). У кожній клінічній групі основним джерелом ДК, МДА, ШО, що впливає на вміст цих продуктів ПОЛ в сироватці крові, є різні типи клітин: при АА1 – це нейтрофіли й еритроцити, при АС – це еритроцити, до того ж у відношенні тільки одного показника – МДА, при СЛ – всі типи клітин: нейтрофіли, еритроцити, лімфоцити.
Результати проведеного аналізу дозволяють припустити, що нейтрофіли, лімфоцити, еритроцити розрізняються за своїм "внеском" у механізм, що приводить до розриву аорти при АА1 і що при трьох близьких за походженням патологіях серцево-судинної системи ці клітини перебувають не в однаковому функціональному стані.
Аналіз кореляційних зв'язків між змінами деяких біохімічних показників сироватки крові й сполучної тканини аорти у хворих на АА1, АС і СЛ
Результати аналізу значень коефіцієнта кореляції між вмістом оксипроліну й тирозину в тканинах аорти в трьох клінічних групах (АА, АС, СЛ) дозволили виявити слабку кореляцію між накопиченням колагенових і неколагенових білків, найбільш значну при АС (r=-0,52). Коефіцієнти кореляції між вмістом оксипроліну (ОПР) й хондроїтинсульфатів (Х-S), оксипроліну й гіалуронової кислоти (ГІК), тирозину (ТІР) й гексозамінів (ГК) характеризувалися тією ж закономірністю й становили при АС: 0,56; 0,68; 0,50 відповідно. У той же час між вмістом неколагенових білків (за тирозином) і несульфатованих ГАГ (за гіалуроновою кислотою) існує значуща негативна кореляція (r=-0,67) тільки в групі хворих зі СЛ. При АА1 найбільш значущим виявився взаємозв'язок між зміною вмісту Х-S і ГІК (r=0,94), що в 1,7 разу сильніше, ніж при АС й у 7 раз сильніше, ніж при СЛ.
При загрозі розриву аорти (АА1) встановлено, що в тканині аорти спостерігається значуща негативна кореляція між вмістом двох типів сульфатованих ГАГ – Х-S і гепарансульфату (r=-0,58), тобто, чим менше Х-S, тим більше гепарансульфату – глікозаміноглікану базальних мембран. У тканині аорти хворих з АС і СЛ цей взаємозв'язок слабшає (до r=-0,37; r=-0,28).
Виявлено значущу негативну кореляцію між накопиченням тирозину й гепарансульфату (r=-0,6; r=-0,63). Таким чином, втрата аортою гепарансульфату, очевидно, компенсується накопиченням неколагенових білків, що теж може приводити до зміни механічної міцності стінки аорти. При АА із загрозою розриву була також виявлена негативна кореляція між накопиченням ГІК і ГА (r=-0,52), ОПР та ГА (r=-0,52), що виявилася значно слабше, ніж при АС (r=-0,77; r=-0,66). Ці біохімічні зміни, очевидно, мають відношення до зменшення механічних властивостей аорти перед розривом.
У зв'язку з пошуком біохімічних критеріїв загрози розриву АА, а також установленням факту посилення запального процесу в організмі хворих на АА із посиленням загрози розриву ми розглянули динаміку значень коефіцієнтів кореляції змін біохімічних показників запалення, обраних для дослідження, в сироватці крові хворих всіх трьох клінічних груп і показників вмісту сполучної тканини в стінці аорти.
Було встановлено, що при АА1 спостерігається значущий негативний зв'язок (r=-0,73) між ШОЄ й вмістом гепарансульфату в аорті. Відзначається також значуща негативна кореляція рівня гепарансульфату з вмістом серомукоїдів (r=-0,65) і гексозамінів (r=-0,53). Виявлено значущу негативну кореляцію між вмістом гіалуронової кислоти в тканині й сіалових кислот у сироватці крові
8-09-2015, 22:37