Значение белков теплового шока при вич-инфекции

иммуноблота усилением интенсивности зоны, соответствующей hsp70. Антитела N7 распознавали и hsp70. и р75, тогда как антитела N10 главным образом связывались только с р75. a Nil - с hsp70. Та­кие же примеры распознавания белков семейства БТШ-70 на иммуноблотах наблюдались, когда вместо клеток HeLa для анализа использовали мононуклеары периферической крови человека.

Для того, чтобы определить компоненты семейства БТШ-70, кото­рые реагируют в неденатурированном состоянии с представленной па­нелью антител, выполнено исследование иммунопреципитации. И одно-, и двумерные электрофоретические анализы иммунных комплексов не по­казывали различий между антигенами, преципитированными с тестируе­мыми антителами: иммунные комплексы содержали только одну зону. соответствующую индуцибельной форме hsp70. Иммобилизованные на твердой фазе антитела N5 и N7 также избирательно реагировали с ан­тигеном hsp70 из белкового экстракта клеток HeLa.

В итоге, по причине особых свойств полученных антител к БТШ-70. которые, как оказало-сь, распознают только один или нес­колько смежных сайтов на нативных молекулах БТШ-70. а также по причине свойств белков семейства БТШ-70 легко образовывать прочные соединения е другими белками клетки в обычных условиях, не предс­тавилось возможным использовать полученные поликлональные антитела

для создания иммуноферментной тест-системы, предназначенной для количественного определения БТШ-70 в белковых экстрактах мононуклеаров периферической крови. Поэтому пришлось использовать указан­ные антитела в конструкции другого метода для определения БТШ-70 в белковых экстрактах - метода иммуноблотинга с -последующей денситометрией проявленных зон белков.

Изменения состояния семейства БТШ-70 мононуклеаров периферической крови на различных стадиях ВИЧ-инфекции

Семейство БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови всех групп обследованных представлено полностью тремя изоформами: инду­цибельной (hsp-70), конститутивной (hsc-70) и белком р75. Не обна­ружено достоверных различий в соотношении изоформ БТШ-70 между до­норами и пациентами в бессимптомной фазе ВИЧ-инфекции. Напротив, у больных в более поздних стадиях заболевания выявлено достоверное изменение анализируемых параметров по сравнению с контрольной группой. Наблюдается прогрессивное уменьшение средних значений со­держания изоформ hsp-70 и р75, увеличение hsc-70 по мере развития клинической картины заболевания. Однако достоверное различие изо­форм семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови между группами больных ВИЧ-инфекцией наблюдали только по отношению к конститутивной изоформе (hsc-70). содержание которой увеличивается при переходе заболевания из бессимптомной фазы (ПБ) к фазе ПГЛ (IIB) от 59,3±2,5 до 66.2±2,7 у.д.е. (р<0,05) и от фазы ПГЛ (IIB) к стадии вторичных заболеваний (IIIA) от 66,2±2.7 до 7l,l±3,0 у.д.е. (р<0,05).

Исследование влияния теплового воздействия на мононуклеары периферической крови обследованных лиц позволило выявить прогрес­сивное достоверное уменьшение содержания индуцибельной изоформы hsp-70 при переходах ПБ к IIB от 38,9±4,3 до 30.4±3.1 у.д.е.' и IIB к IIIA от 30,4±3,1 до 22.1±3.7 у.д.е. (р<0,05).

Нами предложен индекс hsp-70 Tlll/hsp-70 N. представляющий со­бой отношение содержания индуцибельной изоформы семейства БТШ-70 в клетке, подвергнутой тепловому шоку in vitro, к содержанию этого белка в клетке, находящейся при t=37⁰ С. Индекс hsp-70 TШ/hsp-70 N характеризует реакцию клетки на экстремальное воздействие синтезом и накоплением индуцибельной изоформы. по которому косвенно можно судить об адаптивной состоятельности исследованных клеток. Досто­верное уменьшение индекса hsp-70 TlB/hsp-70 N наблюдается в обоих переходах клинических стадий: ПБ - IIB от 4,23 до 3.42 (р<0,05) и IIB - IIIA от 3,42 до 2.99 (р<0.05). что свидетельствует о прог­рессивном ослаблении адаптивной функции мононуклеаров периферичес­кой крови. Воздействие ультрафиолетового облучения на нононуклеары периферической крови вызывало аналогичные сдвиги в системе белков теплового шока во всех группах больных.

Представленный анализ полученных результатов выявляет значи­мость динамики показателей семейства белков теплового шока БТШ-70 мононуклеаров периферической крови для прогноза перехода клиничес­кого развития ВИЧ-инфекции от бессимптомной фазы к генерализованной лимфаденопатии и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний.

Патогенетическая связь исследованных биохимических показателей и белков теплового шока БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови при ВИЧ-инфекции

Выявленная динамика показателей нестабильности генома моно­нуклеаров периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией сопровожда­лась существенным увеличением концентрации соединений, связывающих тиобарбитуровую кислоту, (продуктов свободнорадикального окисле­ния) в клетках и их ядрах, что свидетельствует о повреждении ДНК мононуклеаров свободными радикалами. Ведущим генератором активных форм кислорода при этом. судя по полученным результатам, служит 0-форма ксантиноксидазы, образующаяся из D-формы фермента в ре­зультате ее ограниченного протеолиза. В свою очередь, протеолитическая трансформация D-формы ксантиноксидазы в 0-форму может быть прооксидантно-индуцированной.

Таким образом можно предположить, что повреждение ДНК моно­нуклеаров вызвано свободными радикалами, генерируемыми ксантинок-сидазой. В результате атаки ДНК свободными радикалами наблюдается образование.апуриновых/апиримидиновых сайтов и однонитевых разры­вов ДНК мононуклеаров периферической крови. Причем степень указан­ных процессов находится в зависимости от клинического течения ВИЧ-инфекции. В свою очередь, образование однонитевых разрывов яв­ляется стимулирующим фактором повышения активности ксантиноксидазы в мононуклеарах, а образующиеся олигонуклеотиды могут служить факторами активации экспрессии провирусного генома ВИЧ. интегрирован­ного в ДНК мононуклеаров периферической крови. В результате форми­руется патологический круг. способствующий репликации ВИЧ (рис.1, в конце).

Описанные процессы, среди которых наиболее значимым является свободнорадикальное окисление, сопровождаются характерными измене­ниями системы белков теплового шока в мононуклеарах периферической крови, происходящими в тесной связи с клиническим течением ВИЧ-инфекции. Указанные изменения БТШ-70 в неинфицированных клетках мо­гут быть опосредованы влиянием вирусного белка gplZO. взаимодейс­твие которого с рецептором CD4 не только вызывает стрессовую реак­цию. проявляющуюся рядом функциональных изменений, в том числе и усилением транскрипции с генов БТШ-70 (G.Furlini at al.. 1994).. но и приводит к программированной клеточной гибели - апоптозу зрелых СD4+-лимфоцитов или СD34+-гематопоэтических клеток-предшественни­ков (Hofman Во, 1991; Montagnier L. et al., 1992). В инфицирован­ных клетках экспрессия генов ВИЧ и генов, кодирующих синтез БТШ-70. осуществляется по общим механизмам с участием ядерного фактора NF-kB (Krumm A. et al.. 1993).

Таким образом, и в неинфицированных, и в инфицированных ВИЧ иммунокомпетентных клетках крови больных показатели семейства БТШ-70 могут обоснованно рассматриваться в качестве индикатора ак­тивности репликативного процесса вируса, формирования вторичного иммунодефицита (вследствие дисфункции и гибели СБ4+-клеток) и раз­вития клинического течения болезни.

ВЫВОДЫ

1. Традиционные для оценки иммунного статуса лабораторные по­казатели (количество CD3+. CD4+. С08+-лимфоцитов. В-лимфоцитов. несущих Ig М, G. А; РТМЛ с КонА; концентрация Ig M, G. А; содержа­ние циркулирующих иммунных комплексов) недостаточно полно отражают динамику перехода ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вто­ричных заболеваний.

2. Повышение активности 0-формы ксантиноксидазы и интенсив­ности процессов свободнорадикального окисления в мононуклеарах пе­риферической крови прогрессируют в динамике заболевания, при этом достоверные различия (р<0,05 и р<0.01 соответственно) наблюдаются только при переходе от бессимптомной фазы к персистирувщей генерализованной лимфаденопатии.

3. При развитии ВИЧ-инфекции наблюдается увеличение относи­тельной доли продуктов деградации хроматина (уровня полидезоксинуклеопротеидов) и интенсивности образования однонитевых разрывов ДНК в мононуклеарах периферической крови без достоверных различий в динамике болезни (р>0,05).

4. Белки теплового шока семейства БТШ-70 индуцируют образова­ние поликлональных антител высокой специфичности и аффинности, распознающих один или несколько смежных сайтов на нативных молеку­лах белков, что исключает возможность использования полученных иммуноглобулинов в конструкции иммуноферментных тест-систем для ко­личественного определения БТШ-70. но допускает их применение в ме­тоде иммуноблотинга.

5. При переходе клинического течения заболевания от бессимп­томной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний происходит достоверное увеличение содержания конститутивной изоформы семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови, характеризующее пребывание им­мунокомпетентных клеток в состоянии хронического стресса (р<0.05).

6. Функциональное истощение системы БТШ-70 мононуклеаров пе­риферической крови ВИЧ-инфицированных проявляется снижением интен­сивности ответа (синтез индуцибельной изоформы БТШ-70) на стрессорные воздействия в виде гипертермии и ультрафиолетового облуче­ния.

7. Динамика изменений белков теплового шока семейства БТШ-70 в совокупности с показателями свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы мононуклеаров периферической крови соот­ветствует клиническому развитию ВИЧ-инфекции, что позволяет ис­пользовать их для прогнозирования перехода клинического течения заболевания из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерали­зованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболе­ваний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложенный способ оценки функционального состояния системы белков теплового шока мононуклеаров периферической крови с приме­нением стрессорных воздействий - гипертермии и ультрафиолетового излучения - целесообразно использовать в экспериментальных исследованиях, направленных на изучение патогенеза вторичных иммунодефицитных состояниях при ВИЧ-инфекции и других инфекционных заболеваниях.

Комплекс показателей, отражающих состояние семейства белков теплового шока БТШ-70 (повышение содержания конститутивной изофор-мы hsc-70 более 68,9 у.д.е.) и системы ксантиноксидазы (повышение активности 0-формы более 1,03 мкмоль/мг белка-мин) мононуклеаров периферической крови, в совокупности с традиционными показателями иммунного статуса может быть использован для прогнозирования пере­хода клинического течения ВИЧ-инфекции бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии. Для перехода ПГЛ в стадию вторичных заболеваний характерно повышение содержания конс­титутивной изоформы hsc-70 более 74,1 у.д.е. Включение указанных методов в комплексное лабораторно-диагностическое обследование больных ВИЧ-инфекцией позволяет прогнозировать клиническое течение заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Приготовление специфических поликлональных антител к бел­кам теплового шока // Мат. XI науч. конф. молодых ученых и специа­листов академии.- Л.:ВМедА, 1990.- С.18-19.

2. The characterization and use of different antibodies aga­inst the hsp70 major heat shock protein family for the development of an Immunoassay // Electrophoresls.- 1991.-N12.-P.670- 673 (coавт. Б.А.Маргулис и др.).

3. The state of HSP-70 in lymphocytes In transition of HIV Infection to the clinical manifestation stage // Social and medi­cal problem of AIDS.- St.-Petersburg. 1994.- P. 14 (соавт. Л.А.Ко­жемякин и др.).

4. HSP-70 state significance In the diagnosis and prognosis HIV-Infection // AIDS. cancer and related problems.- St.-Peters­burg, 1996.- P. 130-131 (соавт. Е.И.Змушко).

5. Лабораторный контроль донорской крови в целях безопасности по ВИЧ-инфекции // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии.- СПб. 1996.- С. 67 (соавт. Е.И.Змушко и др.).

6. Диагностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-ин­фекции // Новые информационные технологии в медицине и экологии. -Гурзуф. Ялта, 1996.- С. 56 (соавт. Е.И.Змушко).

7. Прогностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-ин­фекции // Инфектология. Достижения и перспективы. -СПб: ВМедА, 1996.-С.99 (соавт. Е.И.Змушко и др.).

8-09-2015, 19:12