ДЕРЖАВНА УСТАНОВА «ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І.МЕЧНИКОВА АМН УКРАЇНИ»

КУЗЬМЕНКО Андрій Євгенович

УДК 616.6-022-07:612.017.1

МІКРОБІОЛОГІЧНІ, ІМУНОЛОГІЧНІ ТА ЦИТОМОРФОЛОГІЧНІ ПАРАЛЕЛІ ПРИ ІНФЕКЦІЙНО-ЗАПАЛЬНИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ СЕЧОСТАТЕВИХ ОРГАНІВ

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ХАРКІВ-200 8

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в ДУ «Інститут урології АМН України».

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Руденко Адель Вікторівна , ДУ «Інститут урології АМН України», завідуюча лабораторії мікробіології, вірусології та мікології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Дикий Ігор Леонідович , Національний фармацевтичний університет МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології,

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Лазаренко Людмила Миколаївна , Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник

Захист відбудеться « 26 » червня 2008 р. о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 при ДУ « Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України» (61057, м.Харків, вул. Пушкінська, 14-16)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України», м.Харків, вул. Пушкінська, 14-16

Автореферат розісланий « 23 » травня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук С.В.Бруснік

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Незважаючи на досягнення у вивченні етіології і патогенезу урогенітальних інфекцій, в розробці нових методів їх діагностики та терапії, частота даних захворювань залишається високою і не має чіткої тенденції до зниження (Руденко А.В. и соавт., 2002; Гутнєв О.Л., 2002; BearingerL.H. etal., 2007). У значній мірі це пов’язано як із суттєвою трансформацією мікробного спектру статевих шляхів, що має місце з різних причин, так і з станом локального імунітету у цього контингенту хворих. Найбільша питома вага серед збудників інфекційно-запальних захворювань сечостатевої системи у жінок та чоловіків належить умовно-патогенним мікроорганізмам (JonesR., BoagF., 2007).

У повсякденній діяльності лікаря гінеколога та уролога часто постає питання інтерпретації даних лабораторних досліджень. В першу чергу це стосується досліджень мікробіологічних. У кожному окремому випадку мова може йти як про колонізацію слизових оболонок за типом дисбіозу, так і про ускладнення первинного етіологічного діагнозу нашаруванням іншої умовно-патогенної мікрофлори. У значної частини хворих ці захворювання не мають вираженої клінічної симптоматики або супроводжуються незначними скаргами. Ще одну категорію складають особи, що взагалі не мають клінічних проявів захворювання, але при комплексному мікробіологічному дослідженні у них виявляють як класичні умовно-патогенні мікроорганізми, так і молікути, хламідії, віруси, гриби. Ці люди, що вважають себе здоровими, звертаються до лікарів з приводу планування сім’ї або через захворювання статевого партнера. Подібні випадки можуть розглядатися лікарем як носійство, однак, часто проводиться лікування цього контингенту хворих з використанням антибіотиків. При дисбіотичному характері захворювання використання антибіотиків може спровокувати прогресування дисбіозу, особливо у випадку виділення таких мікроорганізмів як уреаплазми, мікоплазми та гарднерели (Готовский Ю.В., Кобаидзе В.В., 1999).

Отже, постає питання - як вірно оцінити стан таких хворихта призначити адекватну терапію? Зважаючи на те, що взаємодія збудника з організмом відбувається на рівні епітеліальних клітин слизової оболонки, тому спільним знаменником різних форм перебігу є стан її протективних механізмів. Система імунного захисту слизових оболонок має певні структурно-функціональні особливості. Слизові оболонки організму можна розглядати як автономний, у певних межах, орган імунної системи із складною, ешелонованою структурою (Шварцман Я.С., Хазенсон Л.Б., 1979). Слід підкреслити, що будь-яка клітина слизової оболонки є імунокомпетентною, бере участь у формуванні та модуляції локальних імунних реакцій (KagnoffM.F, EckmannL., 1997). До адаптаційно-захисних реакцій можна віднести й зміни функціонального та пластичного статусу епітеліальних клітин – дегенеративно-дистрофічні зміни та пов’язану з ними десквамацію й проліферативно-репаративні реакції, які на сьогодні мало вивчені у цьому контексті.

Нормальна мікрофлора сама по собі також є одним з факторів, що модулює стан місцевого імунітету. Водночас, вона є бар’єром колонізації та природним імуномодулятором постійної дії. Відповідно, колонізація слизової оболонки такими умовно-патогенними мікроорганізмами як гриби роду Candida , молікути, ентеробактерії, стрептококи та стафілококи є маркером порушення захисних функцій слизових оболонок (Готовский Ю.В., Кобаидзе В.В., 1999; Сергеев А.Ю., 1999). Стає зрозумілим, що симптоматична та антибіотикотерапія у випадку такого захворювання призведуть, в кращому випадку, до тимчасового ефекту, згодом до хронізації процесу та поглиблення імунопатологічних зрушень у слизовій оболонці. Для цілеспрямованого відновлення протективного потенціалу слизової оболонки потрібні дані не тільки щодо природи етіологічних чинників запального процесу, але й спектру імунних порушень. Тому загальноімунологічні дослідження, які відображають відповідь імунної системи на будь-яке порушення в організмі в цілому у таких випадках будуть малоінформативними. Дані щодо ролі протективних факторів слизових оболонок у розвитку інфекційно-запального захворювання мають фрагментарний характер та потребують подальших досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Тема дисертації затверджена на засіданні Вченої Ради ДУ «Інститут урології АМН України» (протокол №2 від 25.02.2003) та пов’язана з планом науково-дослідних робіт Інституту урології АМН України у 2003-2005 рр. за темою «Визначити стан місцевого імунітету сечовивідних та статевих шляхів хворих за наявності запального процесу, обумовленого збудниками різного таксономічного походження» (шифр ВК-42, № держреєстрації 0104U02472). В ході НДР автором виконано аналіз мікробіологічних, імунологічних та цитоморфологічних паралелей при інфекційно-запальних захворюваннях сечостатевих органів.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно виконано аналіз архіву мікропрепаратів ексфоліативної цитології та архівів мікробіологічних, мікологічних, мікоплазмологічних, серологічних та ПЛР-досліджень за 2001-2005 рр.; проведено відбір та розподіл архівного матеріалу на групи. Автором власноруч виконаний ряд імунологічних, серологічних та цитологічних досліджень.

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження - підвищити ефективність лікування хворих на інфекційно-запальні захворювання сечовивідних та статевих шляхів за рахунок вдосконалення етіологічної діагностики та виявлення основних ланок порушень стану місцевого імунітету.

Для досягнення мети сформульовано і розв’язано такі основні задачі:

· Дослідити мікробний спектр біотопу сечовивідних та статевих шляхів у жінок та чоловіків з інфекційно-запальними захворюваннями даної локалізації при різних формах перебігу.

· Вивчити стан показників, що характеризують активність місцевого імунітету у хворих на інфекційно-запальні захворювання сечовивідних та статевих шляхів в залежності від видового спектру збудників.

· На підставі імунологічних показників розробити прогностичні критерії оцінки ефективності етіотропної терапії інфекційно-запальних захворювань сечовивідних та статевих шляхів.

· Визначити закономірності цитоморфологічних змін епітеліальних клітин слизових оболонок сечовивідних та статевих шляхів у перебігу інфекційно-запального процесу із визначеною етіологією.

Об’єкт дослідження: Інфекційно-запальний процес слизових оболонок сечовивідних та статевих шляхів у жінок та чоловіків, спричинений збудниками різного таксономічного походження (хламідії, молікути, бактерії, гриби).

Предмет дослідження :

- частота виявлення визначених видів мікроорганізмів у біологічних зразках;

- показники, що характеризують стан протективних властивостей слизових оболонок;

- показники, що характеризують стан епітеліальних клітин слизових оболонок.

Методи дослідження: мікробіологічні, серологічні, молекулярно-біологічні, цитологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що U.urealyticum одночасно вражає як статеві органи, так і сечовивідні шляхи. Доведено, що уреаплазми займають провідне місце (37,9%) в якості етіологічних чинників при інфекційно-запальних захворюваннях сечовивідних та статевих шляхів у жінок (44%) та чоловіків (17%). Відмічено збільшення частоти виділення з різних типів біозразків асоціацій уреаплазм (31,7%), бактерій (32,2%) та грибів (14,6%).

Вперше встановлені особливості стану місцевого імунітету слизових оболонок сечостатевої системи в залежності від біологічних особливостей збудників інфекційно-запального процесу. Доведено, що мікроорганізми з відсутньою клітинною стінкою (молікути) та внутрішньоклітинною локалізацією (хламідії) чинили виражену імуносупресивну дію на такі фактори місцевого імунітету якбактерицидна активність фагоцитуючих клітин, гемолітична активність комплементу, продукція лізоциму таsIgA, що суттєво порушувало каскадний процес протективної імунної відповіді слизової оболонки. Показано, що зниження показників активності фагоцитозу (ФАФК, БАФК), активності комплементу, рівня лізоциму, лактоферину та секреторного IgA впливають на ефективність лікування.

Вперше з’ясовані відмінності клітинної реакції слизових оболонок сечовивідних та статевих шляхів при урогенітальних інфекціях, що полягали у порушенні проліферативно-репаративної реакції на запалення з явищами клітинного поліморфізму та розвитком плоскоклітинної метаплазії циліндричного епітелію при хламідіозі; посиленому розвитку дегенеративно-дистрофічних змін епітеліальних клітин слизових оболонок сечовивідних та статевих шляхів при уреаплазмозі. Вперше встановлені особливості клітинної реакції слизових оболонок в залежності від локалізації інфекційно-запального процесу. Доведено, що клітини слизової оболонки уретри жінок виявилися найбільш чутливими до дії збудників – зокрема, їх реакція характеризувалася втратою специфічних рис - циліндричні клітини шляхом метаплазії перетворювались в плоскоклітинні елементи.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлені особливості мікробного спектру, імунологічних та цитоморфологічних порушень дозволяють підвищити ефективність лікування хворих з інфекційно-запальними захворюваннями сечовивідних та статевих шляхів за рахунок призначення клініцистом адекватної етіотропної та імунотропної терапії.

Доведена доцільність виконання цитологічного методу у комплексі діагностичних заходів урогенітальних інфекцій при одночасному дослідженні етіологічного чинника та цитоморфологічних змін епітеліоцитів вогнища ураження.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень було представлено на міжнародній науковій конференції «Актуальные вопросы борьбы с инфекционными болезнями» (2003, Харків); ІІ Всеросійському конгресі з медичної мікології (2004, Москва – Російська Федерація); 6-й міжнародній конференції «NewDevelopmentsinProstateCancerandProstateDiseases» (2005, Paris – France); ІІ З’їзді нефрологів України (2005, Харків); VІІ Українській науковій конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації (2005, Київ); нефрологічному семінарі (2005, Санкт-Петербург – Російська Федерація); VIIІ Українській науковій конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації (2006, Київ).

Публікації. Основні результати досліджень по темі дисертації викладено у 14 публікаціях: 7 статтях у фахових журналах та 7 тезах доповідей на вітчизняних і міжнародних конференціях та з’їздах.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 167 сторінках друкованого тексту та складається зі вступу, огляду літератури, трьох розділів власних досліджень з викладеними результатами, аналізом та узагальненням досліджень, висновків, списку використаних джерел. Робота ілюстрована 18 таблицями та 29 рисунками. Список використаної літератури включає 202 джерела, з них 70 – англомовних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В огляді літератури , що складається з трьох підрозділів, узагальнено та проаналізовано сучасні дані щодо особливостей організації епітеліального покриву, системи місцевого імунітету слизових оболонок сечовивідних та статевих шляхів у жінок та чоловіків в нормі та за наявності патології. Розглянуто біологічні властивості найбільш значущих збудників інфекційно-запальних захворювань сечостатевої системи - хламідій та уреаплазм.

Згідно до мети і завдань роботи було досліджено біологічні зразки, отримані з слизових оболонок сечовивідних та статевих шляхів, сеча та кров 270 чоловіків та 630 жінок (900 обстежених хворих).

Для мікробіологічних досліджень використовували сечу, мазки із піхви, зскребки із слизових оболонок уретри та цервікального каналу, секрет передміхурової залози та еякулят. Мікробіологічні дослідження зразків патологічного матеріалу включали виділення на поживних середовищах та ідентифікацію культур бактерій, молікутів (M . hominis , U . u realyticum ), грибів роду Candida (Руденко, 1980; Меншиков, 1987; Лисин та інші., 1988).

Зскребки клітин з слизових оболонок уретри та цервікального каналу отримували ложкою Фолькмана, вносили в транспортне середовище для дослідження методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), одночасно виготовляли мазки на знежирених предметних скельцях, висушували їх на повітрі, фіксували 96% етанолом або сумішшю Нікіфорова з подальшим цитологічним дослідженням.

Специфічні нуклеотидні послідовності ДНК C . trachomatis , M . hominis , M . genitalium , U . u realyticum , G . vaginalis , N . gonorrhoeae таT . vaginalis визначали в ПЛР з використанням праймерів та обладнання виробництва фірм “ДНК-технологія”, “Биоком” та “Амплісенс” (РФ).

Цитоморфологічні дослідження виконували методом світлової мікроскопії. Препарати забарвлювали за Романовським-Гімза (Меньшиков, 1987; Базарнова, 1994; Хмельницкий, 1999). У препаратах досліджували ознаки, що характеризують перебіг запального процесу: тип та кількість клітинних елементів запалення; тип та характер розташування епітеліальних клітин, стан цитоплазми та ядер епітеліоцитів. Оцінювали кількість слизу, клітинного детриту та наявність фібринозних мас (Белянин, 1998). У зскребках визначали клітини з цитоплазматичними включеннями, що характерні для хламідій, «ключові» клітини, характерні для гарднерел, трихомонади, гонококи ті іншу мікрофлору.

Сироватки крові всіх хворих тестували у ІФА на присутність специфічних антитіл (IgG) до антигенів C . trachomatis , U . urealyticum , M . hominis таC . albicans . В роботі використовували тест-системи для ІФА виробництва “Orgenics” (Ізраїль), “Вектор-Бест” (Росія) та ТОВ “Укрмедсервіс” (Україна). Для обліку результатів використовували планшеточний рідер Labsystems “Multiscan”, (Фінляндія).

Для аналізу показників місцевого імунітету було розроблено спеціальну методику виконання змивів з цервікального каналу та шийки матки у жінок та з уретри у чоловіків. Змиви виконували 0,9% стерильним розчином NaCl до отримання зскребків з метою уникнення можливої контамінації зразків кров’ю. Після ретельного перемішування змиви центрифугували при 1,5 тис. об/хв протягом 20 хв та відбирали надосадкову рідину для дослідження гуморальних показників місцевого імунітету. У надосадковій рідині визначали такі показники гуморальної ланки місцевого імунітету:

- рівень секреторного IgA та загальних імуноглобулінів M та G класів;

- рівень лактоферину;

- рівень лізоциму;

- гемолітичну активність комплементу.

Рівень s-IgA та загальних імуноглобулінів класу A, M та G виконувли у ІФА та методом радіальної імунодифузії (РІД) в гелі за Mancini (Mancinietal., 1970). Рівень лізоциму (мурамідази) визначали біологічним методом. Тест виконували з використанням препарату добової культури M . lysodeicticus (Меньшиков, 1987). Активність комплементу визначали гемолітичним методом (Меньшиков, 1987).Рівень лактоферину визначали у ІФА з використанням комерційної дослідницької тест-системи виробництва НВО “Вектор-Бест” (Росія). Осад використовували для дослідження клітинної ланки місцевого імунітету. Фагоцитуючі клітини отримували зі змивів на градієнті щільності фікол-верографін 15-хвилинним центрифугуванням зразків при 1500 об/хв.Функціональну активність фагоцитуючих клітин визначали культуральним методом (Пастер, 1989). Бактерицидну активність фагоцитів визначали мікрометодом у НСТ-тесті (Меньшиков, 1987; Пастер, 1989). Статистичну обробку отриманих данихвиконували за стандартними методами варіаційної статистики з використанням програмиMSExcel.

У розділі 3 проаналізовано частоту виявлення мікроорганізмів різного таксономічного походження у жінок та чоловіків з різними нозологічними формами захворювань сечостатевих органів у відповідному біологічному матеріалі (табл. 1).

Таблиця 1

Розподіл чоловіків за нозологічними формами запальних захворювань сечостатевої системи та частота інфікованості різними збудниками, n=270

Примітка: * - мається на увазі сумарна кількість виділених мікроорганізмів групи кишкової палички, стрептококів та стафілококів;

** - інший привід звернення до лікаря: захворювання статевого партнера, обстеження з приводу супутнього захворювання

У табл. 1 представлена частота інфікування бактеріями, уреаплазмами та хламідіями різного біологічного матеріалу у чоловіків з різними нозологічними формами запальних захворювань сечостатевих органів. Вибір збудників був обумовлений тим, що частота виділення бактерій та уреаплазм була найвищою серед інших збудників у всіх групах обстежених жінок та чоловіків, а етіологічна роль хламідій є приоритетною у контексті сучасної епідеміології урогенітальних інфекцій. Як видно з табл. 1, найбільшу групу складали особи з простатитами та уретропростатитами. У цій групі хворих зафіксована найбільша частота виділення бактерій - переважно з секрету передміхурової залози. У чоловіків з діагнозом неплідність частота виявлення мікроорганізмів у секреті передміхурової залози та еякуляті була найвищою у порівнянні з іншими групами. Особливо це стосується уреаплазм, які виявляли у 75±13% осіб. Частота виявлення хламідій сукупністю методів у даній групі становила 25±13%, але найчастіше специфічні нуклеотидні послідовності хламідій визначали методом ПЛР у чоловіків з діагнозом уретрит у зскребках з слизової оболонки уретри – у 47±13% хворих. Однак, при тестуванні сироваток крові цих хворих у ІФА специфічні IgG до антигенів C.trachomatis у діагностичних титрах було виявлено лише у 15% обстежених, що свідчить про локальний перебіг захворювання. З вищою частотою діагностичні титри протихламідійних антитіл визначалися у чоловіків з уретропростатитами – у 32% обстежених. Загалом, діагностично значущі титри протихламідійних антитіл (IgG) було виявлено у сироватках крові 24% чоловіків. T.vaginalisдіагностували на підставі цитологічних та молекулярно-генетичних досліджень у 8±0,3% чоловіків, у 4±0,2% - у вигляді моноінфекції.

У табл. 2 представлена частота інфікування бактеріями, уреаплазмами та хламідіями відповідного патологічного матеріалу від жінок з різними нозологічними формами запальних захворювань сечовивідних шляхів та статевих органів. Частота виділення бактерій в різних зразках біологічного матеріалу при різних нозологічних формах перебігу запального процесу була високою й перевищувала 50%. Найвищі показники інфікованості бактеріями було відмічено за наявності запального процесу вульви та слизової оболонки піхви. Частота виділення U.urealyticum була найвищою у жінок з кольпітами (табл.2).

Таблиця 2

Розподіл жінок за нозологічними формами запальних захворювань сечовивідних шляхів та статевої системи й частота інфікованості різними збудниками, n =630

Примітка: * - мається на увазі сумарна кількість виділених мікроорганізмів групи кишкової палички, стрептококів та стафілококів;

** - інший привід звернення до лікаря: захворювання статевого партнера, обстеження з приводу супутнього захворювання

Нуклеїнові кислоти C.trachomatis найчастіше виділяли у дослідженому матеріалі жінок з цервіцитами (33±5%), однак, при тестуванні сироваток крові цих хворих у ІФА на присутність специфічних імуноглобулінів діагностичні титри IgG до C.trachomatis виявлялися тільки у 12±3%. В той же час, у переважної більшості жінок із неплідністю та хронічними запальними процесами органів малого тазу (сальпінгіт, сальпінгоофорит, аднексіт) та підтвердженою у ПЛР та РІФ хламідійною інфекцією IgG були виявлені у високих діагностичних титрах (у 78%). Загалом, діагностично значущі титри протихламідійних антитіл було виявлено у сироватках крові 38,1% жінок з встановленою хламідійною інфекцією. Слід зауважити, що у третини пацієнток з діагностичними титрами специфічних імуноглобулінів нуклеінові кислоти C.trachomatis не були визначені у зскребках методом ПЛР, що свідчить про давній хронічний перебіг хламідійної інфекції, дисемінацію збудника з ураженням органів малого тазу, що в кінцевому результаті призводить до серйозної патології вагітності (завмирання, невиношування) або неплідності. T.vaginalis діагностували у 16,0±0,4% жінок, у 5,0±0,2% - у вигляді моноінфекції.

Сумарно, як у жінок, так і у чоловіків серед мікроорганізмів, виявлених за допомогою


8-09-2015, 19:28