Наприклад, при виключенні деяких факторів росту (вітамінів групи В і амінокислот), необхідних для двох штамів, обидва організма могли рости в симбіозі, так як кожний з них продукував біологічно активні речовини, потрібні один одному. Так, L.arabinosus 17-5 (потребує фенілаланін) і Str.faecalis R (потребує фолієву кислоту, треонін, серин, гистидин або гліцин) ростуть в симбіозі, коли фенілаланін, треонін і фолієва кислота не внесені в середовище.
Тривалість життя молочнокислих бактерій без пересівів багаторазово підвищується у присутності дріжджів. Розвиваючись спільно, вони утворюють “захисне суспільство”, не допускаючи до нього сторонніх мікроорганізмів [28,36,37]. Відомо, що лактобацили більш стійкі до антагоністичного впливу патогенних мікроорганізмів, ніж інші бактерії [36]. Лактобацили виділені із кишечника людей, що мали тривалий контакт з антибіотиками, характеризуються значною перехресною лікарською стійкістю, але їх антибіотикорезистентність – не є стабільною.
За сучасним уявленням позитивна дія є багатокомпонентною і включає: пригнічення потенціальних патогенних мікроорганізмів за рахунок продукції антибактеріальних речовин, конкуренції за лімітуючі харчові сполуки; вплив пробіотиків на ферментну активність шкідливих кишкових мікроорганізмів; стимуляцію імунної системи макроорганізму; здатність лактобактерій асимілювати холестерол і таким чином знижувати вміст цього ліпіду в сироватці периферичної крові.
Крім значної антагоністичної активності лактобацил важливу роль відіграє їх висока адгезивність [7,38], з чим пов’язана здатність молочнокислих бактерій приживлятись на слизових оболонках різних порожнин макроорганізму. Такі властивості є як у нормальної так і патогенної мікрофлори ШКТ. Мікроорганізми з високими адгезивними властивостями отримують селективну перевагу в конкуренції з менш пристосованими бактеріями. Кишкові молочнокислі бактерії є мукозасоційованими мікроорганізмами і саме це в значній мірі вносять вклад в феномен колонізаційної резистентності кишечника. Звідси слідує, що одним із основних критеріїв пошуку перспективних штамів лакто- та біфідобактерій є їх високі адгезивні властивості. Слід зазначити, що більшість бактерій не можуть приживлятися у кишечнику хворого на довгий час, тому лікувальна дія цих пробіотиків буде транзиторною. Взаємодія патогенних мікроорганізмів з епітелієм слизової оболонки травного тракту може бути обмежена завдяки присутності на ній популяцій сапрофітних чи молочнокислих бактерій, при руйнуванні якої можливий розвиток патологічних змін в організмі. У більшості видів лактобацил адгезивні властивості корелюють із високою антимікробною дією та лізоцимною активністю [28]. Необхідно зауважити, що отримати антибіотики із молочнокислих бактерій у чистому вигляді до цього часу не вдалося, так як вони під час виділення втрачають свою активність.
Мікрофлора кишечника (в основному анаеробні бактерії) за допомогою адгезинів прикріплюється до епітелію слизової оболонки. Адгезини (ліганди) бактерій – це біополімери, які складаються з унікальних для кожного виду субодиниць білкової, гліколіпідної або глікопротеїнової природи. Вони можуть бути лектинами, і у такому випадку вибірково зв'язуються з вуглеводневими детермінантами глікопротеїнів і гліколіпідів, при цьому кожному лектину відповідає певний вуглеводний залишок. Це приблизно можна порівняти з взаємодією антиген –антитіло.
Біологічна плівка, яка утворюється виконує бар`єрну роль, вона затуляє рецептори слизової та підслизової оболонок від патогенних мікроорганізмів. Вона має негативний заряд і служить бар`єром на шляху проникнення катіонів деяких антибіотиків, патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів. Вона захищає на тільки слизову оболонку, а і самі автохтонні бактерії від дії антибіотиків і антитіл. Лактобактерії володіють більшою адгезивністю, завдяки наявності у глікокаліксі відносно великої кількості моносахаридів на відміну від бацил [39,40].
Отже, антагоністичні властивості лактобацил та їх здатність колонізувати епітелій КШТ, закріпляючись на його ворсинках, є основою для застосування цих мікроорганізмів у лікуванні дисбактеріозів, гастритів, язв КШТ. Такого стану можна досягти шляхом штучної колонізації кишечника бактеріями, які можуть впливати на мікроекологічну систему кишечника та організму хазяїна в цілому.
Ще однією з найважливіших функцій молочнокислих бактерій є їх участь у формуванні імунологічного статусу та функціонуванні імунної системи організму[41].
Дані щодо різнобічного впливу молочнокислих бактерій на імунну систему організму є найбільш новітніми. Встановлено, що лактобактерії можуть діяти як адюванти гуморальної імунної відповіді у людей та експериментальних тварин [42,43]. Показана безпосередня активізуюча дія пробіотиків на Т-кілери та В-лімфоцити [13]. Живі, вбиті нагріванням та компоненти клітинних стінок лактобактерій, а також препарати з бацил виявились добрими активаторами печінкових і перитонеальних макрофагів і мононуклеарних фагоцитів.
Пробіотикам притаманна функція індукторів α- і β– інтерферону, що встановлено в дослідах in vitro і в експерименті на тваринах.
Одним із механізмів дії пробіотичних препаратів, який тісно пов`язаний з їх імуномодулюючим впливом на макрооргaнізм, є явище транслокації бактерій з перорально введених препаратів в кров`яне русло. Це явище було встановлено і всебічно вивчено вітчизняними дослідниками під керівництвом академіка В.В.Смірнова [26,45,46]. Автори встановили, що вже через дві хвилини після введеня мишам пробіотичних препаратів або культур мікроорганізмів з їх складу, частину бактерій виявляли в крові, легенях та печінці, а трохи згодом – і в інших паренхіматозних органах з наступним поступовим зниженням числа життєздатних клітин. Явище транслокації спостерігали постійно при введені дози, яка пребільшувала 1*10
живих МК, при цьому в кров надходила лише незначна чиатина – близько 0,01% введених бактерій.
Відомо, що хімічний склад клітинної стінки багатьох молочнокислих бактерій досить постійний, на нього не впливає зміна складу середовища чи умов, у яких мікроорганізми вирощуються. Найважливіші клітинні агенти бактерій зосереджені саме в їх стінках. Методом хроматографії гідролізатів клітинних стінок ряду молочнокислих бактерій, показано, що амінокислотний склад їх більш за все характеризує рід, а якісний склад та кількість сахарів гексозамінів відбивають різницю між видами всередині самого роду.
Наприклад, встановлено, що стінки L.plantarum утримують аспарагінову кислоту, аланін, глутамінову кислоту, лізин, глюкозаміни та гексозаміни. L.delbrueckii, L.casei мають більш складний, ніж інші види роду хімічний склад клітинних стінок. Імуностимулюючу дію виявляють препарати із різних живих. Висушених, заморожених або убитих шляхом нагрівання. Ці властивості є й у дезінтегрованної біомаси бактерій. В експерименті на лабораторних тваринах встановлено, що молочнокислі бактерії, такі як L.delbrueckii, L.casei, L.acidophilus та Str.thermophilus стимулюють лімфоїдний апарат, синтез імуноглобулінів та активність інтерферону, посилюють мононуклеарну та фагоцитарну активність, активність натуральних кілерів, підвищують лізоцимальну та протимікробну дію, стимулюють реакції Т-клітинного імунітету [47]. Внутрішньочеревні ін'єкції живих бактерій L.delbrueckii, subsp.bulgaricus мишам стимулювали утворення інтерферону вже через 6 годин після їх введення.
1.2 Антагоністичні властивості пробіотичних препаратів
Поряд із підсиленням протиінфекційного імунітету молочнокислі бактерії виявляють також і протипухлинну активність. Протипухлинна активність пробіотиків та їх вплив на кишкову моторику є результатом непрямої дії. Одним із напрямків є руйнування ферментів, таких як азотредуктаза, нітроредуктаза, які переводять проканцерогени в канцерогени [48]. Інша точка зору полягає в тому, що живі або вбиті нагріванням лактобактерії індукують в організмі зростання активності макрофагів, лімфоцитів, виключаючи синтез ендогенних цитотоксинів та пухлино-некротизуючого фактору (TNF). Таким чином, дія на пухлину може здійснюватись як за рахунок прямої цитотоксичної діїї, так і щляхом стимуляції імунних механізмів. Нарешті, пробіотичні штами знижують рівень мутагенів у фекаліях, можливо шляхом зв`язування або сорбції мутагенів на бактеріальних клітинах [49].
І.Г. Богдановим одним із перших in vivo на мишах з саркомою 180, карциномою Ерліха, меланомою В-16 та аденокарциномою АСОТОЛ установленні протипухлинні властивості L.delbrueckii, коли введення культурального фільтрату призводило до повного зникнення пухлин майже у 50% лабораторних тварин [49,50]. Ним було запропоновано декілька лікарських засобів із L.bulgaricus. Із клітинної фракції лактобацил було виділено три глікопептиди: 1,2 та 10кД. Один з найбільш активних препаратів отримав назву бластолізин.
Протипухлинну дію встановлено також і при використанні інших видів лактобактерій, наприклад, L.casei. Субстанцією цих бактерій особливо успішно лікували мишей за введенням її підшкірно в область лімфатичних вузлів, які дренували пухлину.
При лікуванні хворих з різними локалізаціями злоякісних пухлин хіміо- чи променевою терапією рекомендується використовувати молочнокислі бактерії, які значно покращують загальний стан хворих та знижують побічні дії лікарських засобів.
Епідеміологічні дослідження багатьох країн світу показали, що виникнення раку товстого кишечника спостерігається більше в популяції людей, які споживають західні рафіновані дієти, порівняно з тим, що вживають вегетаріанські та молочнокислі продукти. Було відмічено, що у пацієнтів з раком товстої кишки в фекаліях знаходиться в середньому на порядок менше молочнокислих бактерій. У людей з високим ризиком рака товстої кишки переважали Bifidumbacterium, Peptococcus, Clostridium, а в людей з малим ризиком виникнення раку товстої кишки домінували Bac.pneumoniae, Lactobacilus[51].
На значній виробці хворих виявлено, що ризик виникнення раку молочної залози позитивно корелював з частотою вживання жирних сирів та молока корів і негативно – з частотою вживання йогуртів з живими лактобацилами.
В останні роки спороутворюючі бактерії роду Bacillus як найбільш відомі представники екзогенної мікрофлори привертають увагу дослідників. Досить великий арсенал видів цього роду використовувався в якості терапевтичних речовин при лікуванні гострих і хронічних інфекцій: B.cereus, B.polymyxa, B.brevis, B.megaterium, B.pumilus, B.coagulans та ін. Однак найбільш розповсюдженні і вивчені види B.subtilis i B.licheniformis [52].
Ці мікроорганізми завдяки високим адаптивним властивостям широко розповсюдженні в природі і зокрема в тих об`єктах, з якими людина контактує найбільш близько. Завдяки цьому бацили постійно і в значній мірі кількості потрапляють в організм людини і, оскільки є стійкими до літичних і травних ферментів, зберігають життєдіяльність напротязі всього ШКТ.
Серед різних представників екзогенної мікрофлори бацили характеризуються рядом переваг, які дозволяють вважати їх найбільш ефективними в якості нових біопрепаратів:
ці бактерії (окрім B.anthracis і B.cereus), як правило, є нешкідливими для макроорганізму навіть у концентраціях, які значно перевищують рекомендовані для вживання;
при пероральному вживанні ці мікроорганізми істотно підвищують неспецифічну резистентність макроорганізм;
антагоністична активність їх більш виражена і проявляється до більш широкого спектру патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, ніж у інших представників екзогенної і ендогенної мікрофлори.
бацили характеризуються високою ферментативною активністю, яка дозволяє їм регулювати і стимулювати травлення, виявляти протиалергійну і антитоксичну дію;
ці мікроорганізми стабільні при зберіганні;
вони екологічно безпечні [53, 54, 55].
Бацили не формують біоплівок, оскільки їх адгезивні властивості слабо виражені. Їх активність проявляється в кишечнику і пов'язана перед усім не з конкурентними взаєминами за місця прикріплення до слизової, а з високою антагоністичною активністю у відношенні до багатьох патогенних бактерій. В той самий час бактерії роду Bacillus не виявляють антагоністичної дії на представників нормальної мікрофлори, що створює умови для безконкурентного відновлення мікрофлори [55].
Антимікробна активність аеробних спороутворюючих бактерій роду Bacillus може бути обумовлена літичними ферментами, які вони синтезують. Так, деякі вчені виділили із B. subtilis еластазу, яка надає літичної дії на грамнегативні та грампозитивні мікроорганізми.
Завдяки високій і різноманітній ферментативній активності бактерій роду Bacillus, які входять до складу біопрепаратів-пробіотиків, можуть відігравати суттєву роль в стимуляції і збагаченні травної системи хазяїна необхідними ферментами [56,57]. Так, наприклад, бацили характеризуються вираженою амілолітичною активністю, причому деякі амілази відрізняються тим, що при гідролізі крохмалю, який каталізують ці ферменти, утворюються сахара α–конфігурації і олігосахара не більше мальтотетрози. Характерною для бацил являється висока протеолітична активність. Із культуральної рідини B.subtilis виділили протеолітичний фермент, який володіє властивістю стимулювати регенераційні процеси. Інший протеолітичний фермент із бацил являється тромболітичним препаратом, який проявляє свою активність навіть при пероральному вживанні. Цікаво, що деякі ферменти бацил зберігають активність навіть в неживих клітинах.
Позитивну роль відіграє здатність бацил продукувати в значних кількостях екзоцелюлярні амінокислоти, в тому числі і незамінні (треонін, аланін, тирозин, гистидин, валін та ін.). Важливою також являється вітамінсинтезуюча активність бактерій роду Bacillus.
Наявність бацил в пробіотичній суміші мікроорганізмів сприяло значно ефективніше зниженню холестерина в крові тварин, чим при їх відсутності. На дослідах також спостерігали більш виражену здатність зв'язувати жирні кислоти і зменшувати утворення холестеринових міцел при наявності бактерії роду Bacillus[58].
Отже, аеробні спороутворюючі бактерії роду Bacillus - перспективна група мікроорганізмів для створення нових високоефективних біопрепаратів. По-перше, вони характеризуються найбільш вираженою антагоністичною активністю по відношенню до патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів. По-друге, відомо, що на основі аеробних спороутворюючих бактерій можна отримувати штами із заданими властивостями, оскільки ці бактерії являються досить гарно вивченою системою для клонування.
Ряд робіт присвячено пробіотикам на основі представників роду Aerococcus [59], а також про використання дріжджів для виробництва пробіотиків. Так, лікування препаратом, до складу якого входили Saccharomyces boulardii, виявилось ефективним при кишкових інфекціях обумовлених Clostridium dificile. Виражений клінічний ефект отримали також при використанні Saccharomyces cerevisiae.
Вище викладене свідчить, що спектр мікроорганізмів складових пробіотичних препаратів досить широкий. Звичайно, найбільш поширеними серед них є молочнокислі бактерії, як одна із широко розповсюджених у біосфері груп мікроорганізмів. Вивчення молочнокислих бактерій як антагоністів патогенної та умовно-патогенної мікрофлори, грибів та вірусів має велике значення для підтримки гомеостазу організму людини, який в значній мірі обумовлений станом мікрофлори, створеної по ходу еволюційного процесу симбіонтного та природного відбору.
Дослідження по визначенню антимікробної активності молочнокислих бактерій дозволяють виявити індивідуальні особливості кожної культури, що представляється значимим для подальшого вивчення природи і механізму дії бактеріоцинів. Знання антагоністичних властивостей кожної культури, оптимальних умов для їхнього максимального прояву необхідне при складанні рецептури лікувально-дієтичних продуктів із заданими властивостями. Участь симбіонтів біопрепаратів у формуванні імунологічного статусу відкриває перспективи застосування їх при хворобах інших систем організму, окрім кишкового тракту.
1.3. Використання пробіотиків для підтримання нормобіоценозу людини
Фундаментальні дослідження сучасної біологічної та медичної наук дозволили розробити і впровадити в практику біопрепарати, домінуюче положення в яких займають препарати з живих непатогенних бактерій – представників нормальної мікрофлори – пробіотики (еубіотики). Піонером цього напрямку був І.І.Мечніков, який обгрунтував споживання ферментованого молока, виділив і застосував для ферментації лактобацилу, яка дійшла до нашого часу як Bulgarian bacillus. Після наукового обгрунтування І.І.Мечніковим позитивного впливу на організм людини ферментованого молока та простеження антагоністичного ефекту між штамами бактерій, в мікробіології розпочався етап використання мікробів для посилення захисту від інфекійних хвороб. Останні десятиріччя, враховуючи зростаючий інтерес в суспільстві до здорового способу життя, повязанні з вивченням ферментованих продуктів як пробіотичних препаратів, а використання живих мікроорганізмів - із створенням стратегії пробіотиків.
Термін “пробіотик” був введений в 1965 році Lilley, Stillwell. R.Parker в 1974р. використав цей термін для обозначення живих мікроорганізмів. Пізніше R.Fuller сформулював це поняття як “добавка до корму, що містить живі мікроорганізми, яка позитивно діє на організм тварин, внаслідок чого виздоровлює мікрофлора кишечника”. Це визначення було застосовано й до організму людини і отримало широке розповсюдження в якості збірного поняття, що об`єднує живі мікроорганізми, які поступають в ШКТ та покращують життєдіяльність хазяїна за рахунок нормалізації його мікробної екосистеми [4].
Неперетравленні харчові добавки іншого походження, які мають позитивну дію на організм хазяїна через селективну стимуляцію росту і/або активності представників нормальної мікрофлори кишечника, R.Fuller пропонує називати пребіотиками. В якості пребіотиків розглядаються біфідобактерії, рідше – Lactobacillus, а по даним деяких авторів – і E.faecium [44]. Автор концепції пред`являє до пребіотиків наступну вимогу, вони не повинні гідролізуватись і абсорбуватись у верхніх відділах ШКТ.
Шендеров проаналізувавши речовини, які здатні стимулювати ріст нормальної мікрофлори, і запропонував розділити пребіотики на наступні групи:
моносахариди і спирти (ксилоза, ксилобіоза, рафіноза, сорбіт);
олігосахариди (лактулоза, фруктоолігосахарид, галактоолігосахарид,
ксилоолігосахарид);
полісахариди (пектини, декстрин, інуліні ін.);
ферменти (β-галактозидаза мікробного походження, протеази сахароміцетів і ін.);
пептиди (соєві, молочні);
антиоксиданти (вітаміни групи В, вітамін Е, аскорбінова кислота), а також інші біологічно активні добавки – амінокислоти, рослинні екстракти, органічні кислоти і т. д. [52]
Більшість спеціалістів і дослідників відносять до бактерій-пробіотиків в основному так звані еубіотики (представники нормальної мікрофлори шлунку) і частіше всього біфідобактерії і молочнокислі мікроорганізми роду Lactobacillus, називаючи їх класичними пробіотиками. Це пов’язано з тим, що найбільша кількість позитивно впливаючих на здоров’я людини бактерій, виділено саме із кишечника людини, і саме ці бактерії, заповнюючи КШТ беруть на себе основну захисну функцію, в той час як інші мікроорганізми яляються транзитними. Пробіотичними властивостями володіють молочнокислі палички та коки, яких немає в кишечнику людини, а також інші мікроорганізми – B.subtilis, B.licheniformis, B.cereus, L.acidophilus, L.delbrueckii, L.plantarum, L.fermentum, L.salivarius, L.casei, L.rhamnosus, L.reuteri, B.bifidum, B.longum, B.adolescentis, E.coli, Ent.faecium, Str.saliverius subsp. thermophilus, Saccharomyces boulardii) [52].
Крім того, автори використовують різні сполучення цих мікрорганізмів, а також форми застосування. В нашій країні традиційно склалося ділення препаратів, що містять живі бактерії, на медичні препарати і харчові добавки. При цьому зазначається, що “терапевтичним мінімумом” вважається 10 живих мікробних клітин в 1г продукту. Саме зберігання достатньої кількості життєздатних клітин є однією з найбільш проблематичних сторін використання пробіотиків. Крім того, введені бактерії мають ще прижитись в кишечнику людини і виробляти in situ активні речовини.
Залежно від природи складових компонентів і форми використання, можна виділити такі основні групи пробіотиків:
-препарати, котрі містять живі мікроорганізми (монокультур або їхні комплекси);
-препарати, котрі містять структурні компоненти мікроорганізмів – представників нормальної мікрофлори або їхніх метаболітів;
-препарати мікробного або іншого походження, котрі стимулюють ріст та активність мікроорганізмів - представників нормальної мікрофлори;
-препарати, котрі є комплексами
8-09-2015, 22:02