В дослідах використовували N-стеароїлетаноламін або суміш N-ацилетаноламінів, в якій більше 60 % складають залишки ненасичених жирних кислот: 6,3 % арахідонової, 1,8 % лінолевої, 7,6 % гондової, 18,4 % олеїнової, 6,4 % пальмітоолеїнової, 16,7 % ейкозапентаенової, 2,7 % докозагексаенової; близько 30 % – ацили насичених жирних кислот: 6,4 % міристинової, 22,4 % пальмітинової, 3,0 % стеаринової, 1,0 % арахінової, 1,4 % бегенової.
Додавання до середовища інкубації N-стеароїлетаноламіну у концентраціях 10-7 -10-6 М не викликало суттєвих змін щодо включення мітки в альдостерон та кортикостерон. Однак у присутності N-стеароїлетаноламіну в концентрації 10-5 М мічення гормонів підвищувалось.
Вплив дофаміну на включення мітки холестерину в альдостерон і кортикостерон залежав від його концентрації (рис. 8). В концентрації 10-7 – 10-6 М дофамін не впливав на включення холестеринової мітки в кортикостерон. Мічення альдостерону мало тенденцію до зростання при концентрації дофаміну 10-6 М. Вірогідним пригнічення мічення кортикостерону і альдостерону ставало при концентрації дофаміну 10-5 М. Потрібно зазначити, що це гальмування відбувається лише при досить високій концентрації дофаміну.
Аналіз особливостей сумісної дії дофаміну та NAE проведено з використанням таких концентрацій сполук, котрі самі по собі не змінювали включення мітки в альдостерон і кортикостерон – 10-6 М (рис. 9). Дофамін у використаній концентрації дещо збільшував включення мітки в альдостерон, але не в кортикостерон.
Встановлено, що кожен з препаратів NAE потенціював включення 3 Н-холестерину в кортикостероїди за дії дофаміну. При цьому радіоактивність альдостерону та кортикостерону зростала в порівнянні з контролем на 60-80 %. Для альдостерону суттєве підвищення включення 3 Н-холестерину досягалось тільки при додаванні суміші ненасичених NAE.
За контроль (100 %) слугували проби, що не містили NAE і дофаміну. Порівняння з контролем: * – р < 0,05, критерій Стьюдента, + – р < 0,05, непараметричний U-критерій Вілкоксона-Манна-Уїтні; n=3.
Не існує чітких односпрямованих результатів, які б характеризували вплив NAE на процеси стероїдогенезу в корі надниркових залоз людини і експериментальних тварин. Проте не викликає сумнівів той факт, що NAE мають адреномодуляторні властивості. Ми показали, що N-ацильовані етаноламіни in vitro суттєво збільшували секрецію 11-ОКС в адренокортикальній тканині самок щурів, проте утворення 11-ОКС зрізами надниркових залоз людини та самців щурів в присутності NAE пригнічувалось (дані не наведені). Питання залежності відповіді на NAE від статі тварин обговорювати вкрай важко, тому що характер впливу статевих гомонів на синтез кортикостероїдів в корі надниркових залоз не досліджено ґрунтовно. Статеві відмінності щільності місць зв’язування каннабіноїдів та зміни їх рецепції під впливом статевих гормонів було знайдено в деяких структурах мозку, але фізіологічна роль цих відмінностей залишається нез’ясованою [De Fonseca et al., 2005].
Слід відзначити, що вплив суміші NAE, яка містила похідні етаноламіну з насиченими і з ненасиченими залишками жирних кислот, на мічення альдостерону був виразнішим, ніж у випадку використання N-стеароїлетаноламіну (рис. 9). Очевидно, властивості залишків жирної кислоти, що входять у склад NAE, мають значення у визначенні реакції адренокортикоцитів. Це, в свою чергу, може свідчити про те, що дія NAE не обмежується впливом на мембрани, а й може впливати на месенджерні механізми або на стероїдогенез безпосередньо. Зростання включення мітки 3 H-холестерину до кортикостероїдів під впливом NAE може пояснюватись збільшенням проникнення вільного міченого холестерину до зрізів.
Одним із можливих механізмів впливу NAE може бути зміна транспорту електронів від NADPH на цитохром Р450, який забезпечує реакції гідроксилювання стероїдів. У дослідах in vitro виявлено зниження синтезу 11-ОКС зрізами надниркових залоз самців щурів при додаванні NAE [Гула та ін., 2000]. Перенесення електронів на штучні акцептори, цитохром С та дихлорфеноліндофенол в цих же умовах не змінюється. Це дозволяє вважати, що процес перенесення електронів від NADPH на цитохром Р450 під впливом NAE не змінюється, а гальмування стероїдогенезу у присутності NAE може обумовлюватись зниженням активності аденілатциклази. Пригнічення аденілатциклазної активності і зниження рівня cAMP є найбільш вивченим механізмом переносу сигналів від канабіноїдних рецепторів СВ1 [Felder et al., 1995; Maccarrone et al., 2001]. Встановлено, що активація канабіноїдних рецепторів, сполучених з G(i/0) -cубодиницею GTP-зв’язуючого білка, призводить до інгібування аденілатциклази і пригнічення ефектів, залежних від cAMP-залежної протеїнкінази А.
Роль циклічних нуклеотидів, протеїнкіназ А і С в реалізації ефектів N-ацилетаноламінів в адренокортикоцитах. Дослідження впливу етаноламінів, N-ацильованих сумішшю жирних кислот, на продукцію cAMP корою надниркових залоз людини дозволило показати, що помітне зниження вмісту cAMP в адренокортикальній тканині спостерігається вже при концентрації NAE 0,3 мкг/мл, при збільшенні концентрації NAE вміст cAMP продовжує зменшуватись і становить 0,083 ± 0,005 пмоль/мг тканини при концентрації NAE 33 мкг/мл. В контрольних пробах вміст cAMP становить 0,200 ± 0,012 пмоль/мг тканини. Рівень cGMP за цих умов залишається незмінним.
Для з’ясування можливості модуляції стероїдогенезу за рахунок змін активності ПКА і ПКС ми провели пряме визначення впливу NAE на активність ферментів в субклітинних фракціях. Суміш N-ацильованих похідних етаноламіну змінює активність ПКA у субклітинних фракціях кори надниркових залоз людини, як це видно з табл. 6.
Таблиця 6
Вплив NAE на активність ПКА і ПКС (нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка) у субклітинних фракціях зрізів умовно нормальної тканини кори надниркових залоз людини
| Фермент | Цитозольна фракція | Мікросомна фракція | |||||
| NAE, мкг/мл | NAE, мкг/мл | ||||||
| Контроль | 3,3 | 33 | Контроль | 3,3 | 33 | ||
| ПКА | 12,18 ± 1,30 | 8,50 ± 0,28* | 8,03 ± 0,89* | 8,68±1,12 | 8,95 ± 1,13 | 7,35 ± 0,56 | |
| ПКС | 9,08 ± 1,28 | 8,33 ± 0,65 | 8,95 ± 1,08 | 7,50 ± 0,43 | 11,13 ± 1,66* | 8,55 ± 1,23 | |
Примітка. * –вірогідно по відношенню до контролю, p < 0,05; критерій Стьдента; n=4.
У цитозольній фракції клітин спостерігається вірогідне зниження активності ферменту, починаючи з концентрації NAE3,3 мкг/мл. При збільшенні концентрації NAE до 33 мкг/мл протеїнкіназна активність знижується на 34 % у порівнянні з контрольними пробами. У досліджених концентраціях NAE in vitro не впливає на активність ПКА у мембранній фракції адренокортикоцитів.
Внесення суміші NAE до середовища інкубації в жодній з досліджуваних концентрацій не впливає на активність ПКС в цитозольній фракції клітин кори надниркових залоз (табл. 6). У мембранній фракції зростання протеїнкіназної активності спостерігається тільки при одній концентрації NAE -3,3 мкг/мл.
Виходячи з отриманих даних, виявлені прямі стимулювальні ефекти N-ацилетаноламінів на стероїдогенез в корі надниркових залоз можуть пояснюватись залученням ПКС до перенесення регуляторних сигналів NAE в адренокортикоцитах. Привертає увагу той факт, що для суміші NAE концентрація 3,3 мкг/мл виявилася найбільш біологічно активною в дослідах in vitro як в корі надниркових залоз людини, так і самок щурів. Можливо, ПКС не є єдиною протеїнкіназою, що активується NAE в адренокортикоцитах. Для деяких типів клітин існують дані щодо активації анандамідом, 2-арахідоноїлгіцеролом та D9-тетрагідроканабінолом протеїнкіназ, що активуються мітогенами, а також кінази фокальних контактів [Lepicieretal., 2003].
Вплив NAE на апоптичні процеси в умовно нормальній та пухлинній тканинах надниркових залоз людини. Вважається, що при пошкодженні багатьох тканин і, в першу чергу, нервової тканини та серцевого м’язу утворюються NAE, які виконують захисну функцію щодо пошкодженої тканини. Стабілізаційні ефекти NAE щодо травмованих тканин можуть бути пов’язані з їх протекторним впливом на клітинні мембрани. Нашу увагу NAE привернули такими ефектами, як здатність викликати і посилювати апоптоз та пригнічувати проліферацію у різних типах тканин [Гула та ін., 2006; Maccarrone et al., 2002], в тому числі і в пухлинній тканині надниркових залоз людини [Kostyuchenkoetal., 2005]. Проте, незважаючи на проведені дослідження, антипроліферативний та проапоптичний ефекти NAE в різноманітних пухлинах кори надниркових залоз вивчені ще дуже недостатньо.
Тому метою наступного етапу досліджень було визначення залежності ступеня фрагментації ДНК в деяких пухлинних тканинах надниркових залоз людини від вмісту NAE (N-стеароїлетаноламіну та суміші ненасичених NAE) в інкубаційному середовищі (табл. 7). In vitro суміш NAE, що містила похідні етаноламіну здебільшого з ненасиченими залишками жирних кислот, не змінює фрагментацію ДНК в умовно нормальній тканині у випадках альдостером та андростером. Водночас в умовно нормальній тканині у випадку феохромоцитом сумарний об’єм фрагментів ДНК зростає майже в два рази (табл. 7).
Очевидно, реакція тканини надниркових залоз у значній мірі визначається її генетичними особливостями і, відповідно, біохімічними змінами, що відбуваються в тканині внаслідок патологічного перетворення. Слід відзначити, що ступені фрагментації ДНК у пухлинних і умовно нормальних ділянках у межах однієї залози тканин кори надниркових залоз, одержаних від хворих альдостеромою, феохромоцитомою, андростеромою в значній мірі різняться між собою (табл. 7). Різна інтенсивність апоптичних явищ у клітині може пояснюватися перебудовою генетично детермінованих процесів у патологічно змінених клітинах у порівнянні з нормальною тканиною [Berninietal., 2002].
Таблиця 7
Порівняльна характеристика інтенсивності апоптичних процесів (%) у пухлинних і умовно нормальних ділянках в межах однієї залози під впливом суміші NAE
| Джерело тканини | Суміш NAE (3,3 мкг/мл) | |
| пухлина | умовно нормальна | |
| Альдостерома | 143,6 ± 8,6 ** | 109,8 ± 7,7 |
| Андростерома | 102,4 ± 13,7 | 106,4 ± 9,1 |
| Феохромоцитома | - | 198,0 ± 42,2 ** |
Примітка. За 100 % прийнята фрагментація ДНК за умов інкубації без NAE, ** – вірогідна різниця з контролем без NAE, р < 0,01, критерій Стьюдента; n = 4.
Найбільш чутливими до дії NAE пухлинами виявилися альдостероми, фрагментація ДНК в них збільшується більш ніж на 30 % порівняно з умовно нормальною тканиною. У випадку андростером фрагментація ДНК залишається без змін, у випадку феохромоцитом чутливою до дії NAE є умовно нормальна тканина надниркових залоз. Відомо, що при феохромоцитомі істотно посилюється кортикостероїдогенез в прилеглій адренокортикальній тканин [Wolfetal., 2005]. Цей факт може бути поясненням встановленого нами збільшення фрагментації ДНК під впливом NAE майже на 100 % саме у випадку феохромоцитоми (табл. 7).
Той факт, що N-ацильовані похідні етаноламіну здатні вибірково вражати пухлинну тканину альдостером, помітно не впливаючи і не завдаючи шкоди нормальній, може бути підґрунтям для розробки нових підходів оптимізації хіміотерапії пухлин надниркових залоз.
Дослідження участі протеїнкіназ у перенесенні регуляторного сигналу іонів калію в адренокортикальних клітинах
Іони калію відіграють значну роль в регуляції адренокортикальної функції. Відомо, що К+ здатний активувати гормонопоез при підвищенні його вмісту в крові або інкубаційному середовищі. Крім того, він є тлом, що модулює ефекти інших регуляторів, в першу чергу ангіотензину II та кортикотропіну [Chenetal., 1999; Prattetal., 1989]. Проте регуляція синтезу мінералокортикоїдів іонами калію є дослідженою значно гірше порівняно з іншими агоністами. Вважається, що основною ланкою в опосередкуванні ефектів калію в клітинах клубочкової зони надниркових залоз є Са2+ /кальмодулін-залежна протеїнкіназа [Condonetal., 2002; Gangulyetal., 1992]. В той же час в регуляції найважливіших метаболічних функцій клітини, зокрема в регуляції стероїдогенезу, значну роль відіграють циклічні нуклеотиди. Ми провели дослідження на умовно нормальних та гіперплазованих тканинах кори надниркових залоз людини, які свідчать про участь в трансдукції регуляторних сигналів іонів К+ cAMP, ПКА та ПКС. Для того щоб прослідкувати можливу участь ПКС в опосередкуванні регуляторних сигналів іонів калію в адренокортикоцитах людини, ми вивчали розподіл основної ізоформи ПКС у корі надниркових залоз, ПКС-α, в субклітинних фракціях після інкубації зрізів в середовищі з різним вмістом К+ . Встановлено, що кількість ферменту за присутності іонів калію в інкубаційному середовищі є більшою в мікросомах. Таке накопичення ПКС-α в мембранній фракції (її транслокація) свідчить про активацію ферменту. В цитозольній фракції адренокортикоцитів вміст α-ізоформи ПКС залишається без змін.
Ми також вивчали зміни активності ПКС у субклітинних фракціях зрізів адренокортикальної тканини людини під впливом змін концентрації іонів калію. Суттєва активація ПКС спостерігалась в мікросомній фракції: при концентрації калію 8,5 мМ активність ПКС визначалась у мікросомах на рівні 11,09 ± 2,33 нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка. Цікаво відмітити, що після інкубації зрізів у середовищі без калію активність ПКС в мікросомах дещо знижується, порівняно з кіназною активністю при фізіологічній (3,5 мМ) концентрації К+ . Визначення активності ПКС в ізольованих ядрах адренокортикоцитів морських свинок показало значне посилення її активності внаслідок дії К+ [Пушкарьов, 2005]. Натомість, інші протеїнкінази в ядрах не активувались, або їх активність навіть мала тенденцію до зменшення.
Активація ПКС в ядрах, можливо, пов’язана з фосфорилюванням деяких транскрипційних чинників, а через них посиленням експресії генів, продукти яких кодують ферменти стероїдогенезу та білки-регулятори стероїдогенезу (StAR). Таким чином, активація ПКС зі збільшенням концентрації К+ спостерігається в надниркових залозах людини та морських свинок [Пушкарьов, 2005], які є близькими за спектром кортикостероїдних гормонів, що секретуються адренокортикоцитами. Така активація залежить від обміну фосфоінозитидів та мобілізації кальцію з внутрішньоклітинних кальцієвих депо і значною мірою визначає рівень синтезу альдостерону в клубочковій зоні залози. Щоб оцінити можливу роль cAMP-залежної ПКА в опосередкуванні стероїдогенного ефекту К+ в корі надниркових залоз людини, визначали вміст нуклеотиду в залежності від концентрації калію в інкубаційному середовищі.
Аналіз залежності продукції cAMP корою надниркових залоз людини від концентрації іонів калію дозволив продемонструвати, що при збільшенні концентрації іонів калію до 8,5 мМ продукція cAMP зростає в 4 рази і становить 0,62 ± 0,15 пмоль/мг тканини. В умовах відсутності калію вміст cAMP становить 0,14 ± 0,02 пмоль/мг тканини. Зростання кількості cAMP також спостерігалось за умов стимуляції тканини калієм в клітинах кори надниркових залоз морських свинок [Pushkarev, Mikosha, 1991].
Крім того, у присутності інгібітору ПКА фосфорилювання білків при 5,5 мМ К+ в надниркових залозах морських свинок вірогідно зменшувалося [Пушкарьов, 2005]. Ці дані свідчать про можливу участь ПКА у посиленні регуляторного сигналу К+ в адренокортикоцитах морських свинок, як це спостерігається при дії АКТГ. Пряме визначення активності ПКА в мікросомній фракції за інтенсивністю фосфорилювання специфічного субстрату – кемптиду показало, що калій активує цю кіназу, хоча амплітуда активації виявилась нижчою порівняно з ПКС. Як і у випадку ПКС, при концентрації калію в середовищі, нижчій від фізіологічної (3,5 мМ), активність ПКА в мікросомній фракції знижується, при збільшенні концентрації калію до 8,5 мМ активність ПКА також зростає до рівня 4,16 ± 0,83 нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка. Активність ПКА в цитозольній фракції зростає при збільшенні концентрації калію. У фізіологічних умовах активність ПКА в цитозольній фракції визначалася на рівні 2,11 ± 0,14 нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка, при збільшенні концентрації калію до 8,5 мМ вона сягала 3,04 ± 0,38 нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка.
На відміну від цитозолю та мікросом, активність ПКА в ядрах, при визначенні фосфорилювання білків в безклітинній системі, практично не змінюється [Пушкарьов, 2005]. Останній факт може свідчити про те, що основні субстрати цієї кінази знаходяться в цитоплазмі адренокортикоцитів.
Таким чином, базуючись на одержаних нами даних та даних літератури можна стверджувати, що перенесення регуляторних сигналів іонів калію в адренокортикоцитах є значно складнішим процесом, ніж вважалось до цього часу. Ефект підвищених концентрацій іонів калію в адренокортикоцитах реалізується за участю різних месенджерних систем. У перенесенні активуючого сигналу іонів калію в адренокортикальних клітинах можуть брати участь cAMP-залежна протеїнкіназа [Pushkarev, Mikosha, 1991], кальмодулін-залежна протеїнкіназа [Condonetal., 2002], протеїнкіназа С [Betancourt-Calle etal., 2001; Pushkarevetal., 1994]. В результаті активації протеїнкіназ та фосфатаз відбувається фосфорилювання та дефосфорилювання клітинних білків, що обумовлює фізіологічну відповідь клітини.
Отже, можна вважати, що отримані результати обґрунтовують нову концепцію щодо участі регуляторів адренокортикальної функції у формуванні адаптаційних реакцій, які здійснюються безпосередньо наднирковими залозами. Аналіз механізмів взаємодії на молекулярному рівні агоністів, причетних до регуляції адренокортикальної функції і проліферації клітин кори надниркових залоз, переконливо доводить, що ця взаємодія реалізується шляхом низки трансрегуляторних впливів систем внутрішньоклітинних месенджерів, починаючи з першої ланки їхньої дії – рецепції на плазматичній мембрані.
ВИСНОВКИ
1. Обґрунтовано концепцію мультифакторного контролю регуляції гормонопоезу в корі надниркових залоз, взаємодії між різними системами вторинних месенджерів, які опосередковують внутрішньоклітинне перенесення сигналів агоністів, та їх трансрегуляторні впливи. Універсальність мережі месенджерних систем, які запускаються в адренокортикоцитах різними регуляторами – кортикотропіном, естрогенами, пролактином, іонами калію, дофаміном, N-ацильованими похідними етаноламіну, забезпечують реалізацію специфічної функції клітин кори надниркових залоз – синтез кортикостероїдних гормонів.
2. Збільшення активності cAMP-залежної протеїнкінази А, а також протеїнкінази С та її α-ізоформи в клітинах кори надниркових залоз та субклітинних фракціях під впливом АКТГ, естрадіолу, іонів калію свідчить про залучення до забезпечення їхньої регуляторної дії обох кіназних систем.
3. До подальшого перенесення сигналу АКТГ залучено сигнальний каскад протеїнкіназ, що активуються мітогенами, а також ядерні транскрипційні фактори. Серед них найбільш вагома роль у трансдукції сигналу АКТГ в адренокортикоцитах належить МАР-кіназі JNK та ядерному фактору транскрипції с-jun.
4. Виявлені під впливом АКТГ антиапоптичні зміни в клітинах надниркових залоз, оцінювані за зниженням вмісту каспази-3 і ступеня фрагментації ДНК, значною мірою визначаються активацією протеїнкінази С.
5. Встановлено дозозалежність зниження специфічного зв’язування тропних гормонів (АКТГ та пролактину) мембранами адренокортикоцитів за дії адренокортиколітичного препарату хлодитану.
6. В корі надниркових залоз людини основною ізоформою протеїнкінази С є Са2+
/фосфоліпід-залежна α-ізоформа. Її експресія в
8-09-2015, 19:29