Через 24 години після введення клітин, що містять Y-хромосому, визначаються тільки у судинній і сітчастій оболонках експериментального ока, а також зберігаються в структурах головного, довгастого мозку, мозочку і кістковому мозку, тоді як у контрольному оці клітки утримуючі Y-хромосому відсутні. Через 72 години спостереження картина залишається без змін.
У результаті проведених досліджень встановлено, що введені нервові клітини володіють високою тропністью до патологічного осередку і вірогідно визначаються в травмованому оці протягом 3-х діб. Отримані нами дані свідчать про розподіл нервових клітин протягом 72 годин після введення. Однак, важливо встановити, чи зберігають вони свою функціональну активність і як розподіляються в організмі КФНК у більш тривалий період спостереження. Для цього ми провели експериментальні дослідження з використанням флюоресцентного зонда DDC.
В проміжки спостереження від 3 до 21-ї доби відзначалося скупчення мічених клітин, що мають інтенсивне зелене світіння, це свідчить про проникнення нервових клітин через гематоофтальмічний бар'єр та про їх спрямованість до осередку поразки і проникнення в сітчасту оболонку реципієнта. Найбільш інтенсивне зелене світіння сітчастої оболонки спостерігалось у препаратах з 3-ї до 7-ї доби, тоді як до 21-ї доби відзначалася тенденція до зниження його інтенсивності.
Даний метод дозволяє реєструвати високий рівень флюоресценції у осередку поразки, що може свідчити про наявність в ньому нервових клітин протягом тривалого часу.
Безумовним об'єктивним доказом ефективності проведеної терапії є патоморфологічне дослідження органів, клітин і тканин. Гістологічне дослідження показало, що після лазерного впливу в 1-шу добу відновного періоду відзначаються альтеративні зміни в шарі пігментного епітелію і мембрані Бруха. Гранули пігменту виходять у шар фоторецепторів і судинну оболонку і щільність зерен пігменту стає неоднорідною.
Між паличками і колбочками розташовуються еритроцити, що вийшли із судин, визначається набряклість міжуточної речовини, яка має вигляд порожніх щілин.
Також у цьому періоді відзначаються тромбоз судин хоріоідеї, часткове руйнування пігментного епітелію і шарів сітківки.
Доведено, що утворення істинного хоріоретинального зрощення пов'язано з утворенням фіброзних волокон у зоні ушкодження.
Через 3-и доби після введення КФНК спостерігаються розсмоктування крововиливів, зменшення набряку міжуточної речовини сітківки.
Зміни, характерні для часткового відновлення сітківки, спостерігаються вже через тиждень. Так, пігментний епітелій проліферує в один чи декілька шарів сітківки; пігментні клітини розташовуються навколо ретинальних судин або мігрують у внутрішні шари сітківки, де утворюють скупчення.
У тварин основної групи на 7-му добу після введення КФНК у сітчастій оболонці відзначаються зменшення набряку міжуточної речовини, перерозподіл гранул пігменту з тенденцією до нормалізації анатомічної структури, тоді як у контрольній групі в цей термін спостереження зберігаються альтеративні зміни з набряком межуточної речовини сітківки, крововиливами, аномальним перерозподілом пігменту.
До 14-ї доби після введення КФНК у тварин дослідної групи зберігається тенденція до нормалізації морфологічної структури сітчастої оболонки. Визначаються мінімальні альтеративні зміни.
Результатом фотокоагуляції сітківки є проліферація пігментного епітелію й утворення хоріоретинального зрощення, що на очному дні при лазерній скануючій томографії має вигляд дистрофічних осередків блідо-жовтого чи білого кольору.
У тварин контрольної групи у відповідний термін спостережень у зоні ушкодження зберігався набряк і перерозподіл пігменту.
Застосування КФНК стимулює репаративні процеси при лазерному ушкодженні сітківки ока в кролів і є високоефективним методом структурного відновлення сітківки.
Ми вивчили вміст окремих нейротрофічних факторів (GNF, TGF β-1), що беруть безпосередню участь у репарації сітківки (рис. 1 та 2).
З отриманих даних видно, що на 3-тю добу після лазерного опіку сітківки у всіх групах піддослідних тварин відзначалося різке підвищення рівня вмісту TGF β-1 у плазмі крові. При цьому мали місце виразні і достовірні розходження в ступені підвищення вмісту даного фактора між групами тварин, що не одержували клітинну терапію (мимовільне загоєння опіку сітківки і лікування за стандартною схемою), і тварин, яким вводили КФНК (внутрішньовенно і парабульбарно).
У контрольній групі відзначено підвищення показника тільки в 2 – 2,5 рази, що склало при спонтанному загоєнні після лазерного опіку сітківки 255%, а за стандартною схемою лікування 239% (p<0,01), відповідно до норми (інтактні кролі -100%). У тварин дослідних груп, із застосуванням КФНК рівень вмісту TGF β-1 підвищувався відповідно норми в 4-5 разів, при внутрішньовенному введенні складав 562%, при парабульбарном введенні 436% (p<0,001) і був у середньому в 2 рази вище показників у контрольній групі.
На 3-ю добу після опіку були зафіксовані розходження рівня вмісту TGF β-1 у залежності від шляху введення КФНК. У групі тварин, яким КФНК вводили внутрішньовенно, вміст ростового фактора TGF β-1 в плазмі крові був достовірно вище у 1,3 рази (p<0,05), ніж у кроликів з парабульбарным введенням (рис. 1.).
Отримані дані свідчать, що травматичне ушкодження сітківки ока викликало різкий викид ростового фактора репарації TGF β-1.
На 3-ю добу після травми в плазмі крові тварин, що одержували клітинну терапію, відзначається більш високий рівень TGF β-1, тому можна припустити, що введені фетальні нервові клітини стимулюють продукцію біологічно активних речовин, необхідних для репаративних процесів у сітчастій оболонці. Більш високий вміст досліджуваного TGF β-1 у плазмі крові тварин, якім внутрішньовенно вводили клітинний препарат, може вказувати на те, що частина клітин залишається в загальному циркуляторному руслі і не відразу досягає осередку поразки.
На 7-му добу після ушкодження вміст TGF β-1 значно знижувався у всіх групах. У кролів з мимовільним загоєнням опіку сітківки визначався дефіцит TGF β-1 і складав 78,3%, тобто досліджуваний показник був нижче на 22% (p <0,05), ніж у інтактних кролів. У кролів, яких лікували за стандартною методикою, вміст TGF β-1 значно перевищував нормальні показники в 1,7 рази (Р<0,05) і складав 172%.
На 7-му добу спостережень найбільш високі показники TGF β-1 були у кролів, що одержували клітинну терапію. Вміст TGF β-1 перевищував нормальне значення в 3,6-3,8 рази і складав при внутрішньовенному введенні КФНК – 381%, при парабульбарному – 363% (p<0,001), а також перевищував вміст TGF β-1 у контрольній групі кролів в цей термін спостереження.
При цьому до 7-ї доби спостереження достовірних розходжень між показниками вмісту TGF β-1 у групах тварин, яким вводили КФНК різними шляхами, не спостерігалося.
На 14-ту добу спостережень вміст ростового фактора TGF β-1 у нелікованих кролів був на 20% нижче норми і складав – 79,5%. В групі кролів зі стандартним лікуванням TGF β-1 складав – 104,5%. У групах кролів, що одержували КФНК, вміст TGF β-1 перевищував нормальний у 2,5-2,7 рази (p<0,01) і складав при внутрішньовенному введенні КФНК 247%, а при парабульбарному 270%.
На 21-шу добу спостережень у тварин із спонтанним загоєнням опіку сітківки і яких лікували за стандартною схемою, рівень вмісту досліджуваного показника нормалізувався.
У тварин після проведення клітинної терапії на 21-шу добу на тлі практично повного загоєння ранового дефекту відзначалося підвищення значення TGF β-1 у 1,7-2 рази (p<0,05), що складало при внутрішньовенному введенні КФНК – 175,6%, при парабульбарному – 196%.
До кінця першого місяця після нанесення лазерного опіку сітківки дослідних тварин усіх груп рівень TGF β-1 у плазмі крові цілком нормалізувався і залишався таким до шести місяців спостереження.
В якості специфічного ростового фактора для клітин нервової тканини ми вивчали рівень вмісту GNF (рис. 2.).
Представлені дані свідчать про те, що на 3-тю добу після нанесення лазерного опіку сітківки підвищення вмісту GNF у плазмі крові (у 3-4 рази відповідно до норми – 100%) відзначалося тільки у тварин, які одержували КФНК, що складало при внутрішньовенному введенні КФНК – 461%, а при парабульбарному – 351%.
Відзначено, що вміст GNF у плазмі крові при внутрішньовенному введенні КФНК у 1,3 рази вище (p<0,05), ніж при парабульбарному. Ці факти можуть свідчити про те, що препарат КФНК стимулює вироблення GNF і що частина клітин протягом 3-х діб залишається в загальному кровоносному руслі.
Відсутність підвищеного рівня GNF на 3-тю добу в крові тварин, які не одержували клітинну терапію, може свідчити про слабкі синтетичні можливості власних клітин, які продукують даний ростовий фактор.
На користь останнього припущення свідчить підвищення рівня продукції GNF у тварин дослідних груп на 7-му добу після травми сітківки. У тварин контрольної групи зі спонтанним загоєнням опіку відзначено підвищення показника в 1,56 рази (p<0,05), що складало – 156,8%. При стандартній схемі лікування рівень показника підвищувався в 1,84 рази (p<0,01) в порівнянні з нормою і складав – 183%.
У кролів, що одержували КФНК, на 7-му добу відзначалося найвище за весь період спостереження значення GNF, яке перевищує норму в 4,6-5 рази (p<0,001) та складало при внутрішньовенному введенні КФНК 518,1%, а при парабульбарному – 463,4%.
На 14-ту добу спостереження в контрольній групі тварин із спонтанним загоєнням опіку сітківки вміст GNF у плазмі крові перевищував нормальні значення в 1,4 рази (p <0,05) і складав – 138%.
При стандартному лікуванні в цей період спостереження зберігалося помірне підвищення показника GNF в 1,5 рази (p<0,05) у порівнянні з нормальним значенням, що склало 148,5%. У групі тварин, які одержували КФНК, вміст GNF зберігався на більш високому рівні, перевищував норму в три рази (p<0,001) і складав при внутрішньовенному введенні КФНК 452%, при парабульбарному – 434,4%.
На 21-шу добу спостереження в контрольних групах вміст GNF цілком нормалізувався. У тварин дослідної групи після лікування КФНК ще зберігалися підвищені значення GNF у сироватці крові відносно контрольних значень в 3 рази (p<0,001), що склало при внутрішньовенному введенні КФНК 333,5%, при парабульбарному – 316,3%.
Через місяць після нанесення лазерного опіку вміст GNF у плазмі крові всіх дослідних тварин цілком відповідав нормальним значенням і зберігався на цьому рівні до шести місяців спостереження.
Таким чином, репарація сітківки після лазерного опіку супроводжується підвищенням вмісту GNF у плазмі крові, можливо, у фазі активного відновлення іннервації в зоні ранового дефекту. Активація системного кровообігу і локальної мікроциркуляції в зоні травми при традиційному лікуванні приводила до деякого підвищення вмісту GNF у плазмі крові за рахунок активації пластичних потенцій усього клітинного пула, що стимулює продукцію GNF. Введення КФНК приводило до різкого підвищення рівня GNF у плазмі крові дослідних тварин. Можливо це свідчить про те, що КФНК активно стимулюють продукцію даного ростового фактора, необхідного для репаративних процесів сітківки у відновний період після ушкодження протягом трьох тижнів спостережень.
Виражений позитивний ефект КФНК залежить від оптимальної схеми їх введення препарата. Ми вивчили різні способи введення КФНК в експерименті (внутрішньовенний і парабульбарний). При модельній патології лазерного опіку сітківки критерієм ефективності застосованої терапії були показники вмісту нейротрофічних факторів (TGF β-1 і GNF). Найбільш оптимальними виявили парабульбарне введення КФНК з використанням системної лікарської терапії.
Отримані дані свідчать, що лікування ЦХРД повинно бути системним з використанням КФНК і алопатичної терапії. На підставі успішно проведених експериментальних досліджень ми запропонували спосіб лікування ЦХРД із використанням КФНК.
Під нашим спостереженням знаходилися дві групи пацієнтів із ЦХРД: 1) основна – традиційна терапія сумісно з препаратом КФНК; 1) контрольна – звичайне алопатичне лікування.
Ефективність проведеного лікування у всіх групах оцінювалась на протязі шести місяців.
Аналіз динаміки гостроти зору в процесі лікування протягом відновного періоду показує, що в контрольній групі хворих гострота зору підвищилась на 15%, в основній – на 31% відносно норми (рис. 3.).
За результатами двохфакторного дисперсійного аналізу встановлено, що на зміну гостроти зору в пацієнтів з ЦХРД після проведеного лікування найменш за все впливають досліджувані фактори і залежить від методу лікування на 11%, та строку відновного періоду на 6 %.
Поряд з аналізом гостроти зору у хворих були оцінені зміни показників електроокулографії (коефіцієнт Ардена) (рис. 4.).
При аналізі коефіцієнт Ардена електроокулографічного показника – протягом відновного періоду встановлено, що коефіцієнт Ардена до проведення лікування в контрольній групі складав 130%, в основній 132%. Після лікування і відновного періоду (шість місяців) коефіцієнт Ардена підвищився в контрольній групі хворих до 158% (p<0,001) (84% від норми), в основній до 171% (p<0,001) (92% від норми), тобто показник електроокулографії в основній групі вище рівня цього показника в контрольній – на 8%.
Також досліджували межі периферичного поля зору (рис.5.). Отримані результати вказують на те, що до лікування в контрольній і основній групах хворих межі периферичного поля зору складали 392 – 397° (норма – 500°). Після лікування традиційним методом через шість місяців спостереження в контрольній групі встановлено розширення меж поля зору до 448° (90% від норми), а після застосування КФНК до 483° (97% від норми). Наприкінці спостережень даний показник в основній групі був на 8% вищим, ніж в контрольній (рис. 5.).
Була досліджена площа центральних скотом (рис.6.). Після проведеного лікування в більшості хворих основної і контрольної груп відзначено достовірне зменшення площі центральних скотом (p<0,001). Однак в основній групі цей показник був значно вище, ніж у контрольній.
Площа відносних скотом в контрольній групі зменшується з 263 мм² до 125 мм² (в 2,1 рази), а в основній – з 256 мм² до 85 мм² (в 3,0 рази). У підсумку площа скотом в основній групі хворих на 32% менше площі скотом у контрольній (рис. 6.).
Проведений двохфакторний дисперсійний аналіз свідчить, що досліджувані показники ока в більшості пацієнтів основної групи залежать від методу лікування. Доведено, що лікування з застосуванням препаратів КФНК більш ефективне, ніж традиційне.
Двохфакторний дисперсійний аналіз дозволив установити, що успіх проведеної терапії, з одного боку, залежить від методу лікування, а з іншого – від часу його проведення.
Результати кореляційного аналізу свідчать, що між досліджуваними показниками існує взаємозв'язок, який обумовлює кореляційні зміни протягом лікування і відновного періоду.
Динаміка показників функціонального стану органа зору підтверджується об'єктивними даними офтальмологічної картини очного дна. Початкова картина очного дна в основній і контрольній групах була ідентичною. Однак в основній групі пацієнтів до одного місяця спостереження після операційного періоду картина очного дна значно змінювалася (збільшення кровонаповнення судин, зменшення кількості і площі дистрофічних осередків), у контрольній групі після алопатичного лікування відзначається тенденція до прогресу дистрофічного процесу в макулярній області (набряк сітківки, збільшення площі дистрофічних осередків).
До кінця терміну спостереження (6 місяців) в основній групі пацієнтів після введення КФНК спостерігається зменшення кількості дистрофічних осередків, картина очного дна нормалізується, а у контрольній групі спостерігається тенденція до злиття дистрофічних осередків, що свідчить про прогрес процесу.
Препарат КФНК, крім клінічного ефекту, впливає на загально соматичний статус пацієнтів, покращує їх психоемоційний стан і підвищує якість життя.
ВИСНОВКИ
Актуальною проблемою сучасної кріомедицини є вивчення механізмів дії кріоконсервованих фетальних клітин. Пошук багатофакторних терапевтичних засобів, які впливають на репаративні процеси в нервових клітинах сітківки, є важливою актуальною проблемою в офтальмології. Саме такою дією володіють кріоконсервовані препарати фетального походження, зокрема нервові клітини.
У дисертації досліджені механізми дії кріоконсервованих фетальних нервових клітин, а також теоретично обґрунтована можливість їх використання для лікування центральній хоріоретинальній дистрофії, що є актуальною задачею сучасної офтальмології, а також має важне медичне і соціальне значення.
1. За допомогою генетичної мітки (У-хромосома) встановлена тропність до патологічного осередку кріоконсервованих фетальних нервових клітин, в якому вони реалізують терапевтичний ефект у ранній термін спостереження.
2. При фарбуванні кріоконсервованих фетальних нервових клітин зондом 3,3-DDC встановлено високий рівень флюоресценції при люминісцентній мікроскопії. Високий рівень флюоресценції в патологічно зміненій сітчастій оболонці визначається протягом 21 доби, що також може свідчити про цільову спрямованість міграції кріоконсервованих фетальних нервових клітин до патологічного осередку.
3. Застосування кріоконсервованих фетальних нервових клітин експериментальним тваринам є високоефективним методом структурного відновлення патоморфологічно зміненої будови сітчастої оболонки.
4. Введені кріоконсервовані фетальні нервові клітини впливають на процеси репаративної регенерації в клітинах сітківки через активацію вироблення нейротрофічних факторів: трансформуючий фактор росту (TGF β-1) і фактор росту нервів (GNF), які сприяють значному прискоренню термінів загоєння лазерного опіку сітківки в експерименті.
5. Найбільш ефективним є парабульбарне введення препарату кріоконсервованих фетальних нервових клітин на тлі проведеної консервативної терапії. Доведено, що терапію необхідно починати в більш ранній термін виникнення патологічного процесу, про що свідчить зміна показника нейротрофічних факторів (TGF β-1 і GNF) у плазмі крові кролів при парабульбарному і внутрішньовенному введенні.
6. Після введення кріоконсервованих фетальних нервових клітин підвищуються функціональні показники органа зору, що підтверджує ефективний вплив фетальних препаратів на основні патогенетичні ланки дистрофічної патології. Кореляційний аналіз довів, що підвищення функціональних показників органа зору пов'язано з проведеним лікуванням і часом реабілітації пацієнтів. Установлено, що до 6-ти місяців спостереження гострота зору в основній групі підвищилася на 16% відносно контрольної групи; площа відносних скотом в основній групі хворих на 32% менш площі скотом в контрольній; показник електроокулографії в основній групі вище на 8%, ніж в контрольній; границі периферичного
8-09-2015, 21:55