НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О. О. Богомольця
ЛЕВАШОВ ОЛЕГ МИХАЙЛОВИЧ
УДК 577.359:591.044-612.275
ВПЛИВ ГіПОКіНЕЗії НА БІОЕЛЕКТРИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ КІСТКИ
14.03.04 - патологічна фізіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ –2008
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі клінічної патофізіології
Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України
Науковий керівник: заслужений діяч науки та техніки України,
доктор медичних наук, професор
Березовський Вадим Якимович,
Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,
завідувач відділу клінічної патофізіології
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор
Гуляр Сергій Олександрович,
Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України,
провідний науковий співробітник відділу загальної
та молекулярної патофізіології
доктор медичних наук, професор
Бруско Антон Тимофійович,
завідувач відділу патоморфології з експериментально -
біологічним відділенням Інституту травматології та
ортопедії АМН України
Захист відбудеться “08 квітня” 2008 р. в 14.00 годин на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології
ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою:
01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології
ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою:
01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
Автореферат розісланий “05” березня 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Зменшення фізичного навантаження на скелет людини внаслідок зниження частки фізичної праці в матеріальному виробництві, поширення гіпокінетичних станів, збільшення середньої тривалості життя є головними причинами широкого розповсюдження захворювань кісткової системи серед мешканців промислово розвинених країн (Рожинская Л.Я., 2000; Корж Н.А. и соавт., 2002; Оганов В.С., 2003; Поворознюк В.В., 2004-2006; Geusens P.P., 2006; Johnell O., 2006). У зв'язку з цим дослідження патофізіологічних механізмів порушень, які виникають у кістковій тканині при низькому функціональному навантаженні, з метою розробки нових методів їхньої ранньої діагностики, профілактики та корекції є одним із актуальних завдань сучасної медицини.
Специфічним фактором регуляції фізіологічної перебудови кісткової тканини є механічні деформації та напруження, що виникають у кістці під впливом функціонального навантаження. Відповідно до біоелектричної теорії, одним із месенжерів у процесі взаємодії фізичного навантаження з остеогенними клітинами можуть бути електричні струми, що виникають у кістці у відповідь на її деформацію. Механізми генерації електричних потенціалів (потенціалів навантаження - ПН) пов'язують із п'єзоелектричними та електрокінетичними явищами, що виникають у кістковій тканині при механічному навантаженні (Hastings G.W., 1998). Однак дотепер питання про роль біоелектричних явищ у фізіології та патології кісткової системи залишається невирішеним (WilliamsP.A.,1996, Бруско А.Т., Гайко Г.В, 2005). Не існує чітких уявлень про закономірності виникнення, поширення, а також про механізми передачі електричного сигналу до клітин, що беруть участь у процесах перебудови кістки. Немає обґрунтованої відповіді на питання, чому відновлення фізіологічного рівня функціонального навантаження після тривалої гіпокінезії не достатньо для повного відновлення структури та складу кістки. Відповісти на ці та багато інших питань неможливо без комплексних досліджень біоелектричних властивостей кісткової тканини. Підтвердженням тому є результати робіт сучасних дослідників (Oostendorp T.F. et al., 2000; El-Lakkani A., 2001; Gabriel C., 2005), в яких показано, що процеси генерації та передачі електричних сигналів у кістковій тканині значною мірою залежать від її пасивних електричних властивостей (ПЕВ) - поляризаційної здатності, електропровідності тощо. Вважають, що показники, які характеризують ПЕВ кістки, можуть істотно змінюватися вже на початкових, доклінічних стадіях розвитку патології кісткової системи, що має важливе значення для практичної медицини (Gu W.Y., 1999; LegareA., 2002; Sierpowska J., 2005-2006). Необхідність більш глибокого розуміння ролі біоелектричних механізмів у розвитку патологічних процесів у кістці при низькому функціональному навантаженні стала підставою для проведення цього дослідження.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана згідно з планами наукових досліджень відділу клінічної патофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за темою “Дослідити механізми адаптації організму до гіпокінезії та можливі шляхи попередження її негативних наслідків” (Номер державної реєстрації 0101U002635), і проекту NN-26 (R) НТЦ України “Дослідити вплив мікрогравітації на кісткову тканину та профілактичну дію газових сумішей зі зниженим вмістом кисню на розвиток остеопенії”, який виконувався на замовлення Національного космічного агентства України.
Мета та завдання дослідження. Мета роботи - встановити патофізіологічні закономірності змін біоелектричних властивостей кістки в умовах низького функціонального навантаження.
Завдання дослідження:
1. Дослідити закономірності виникнення електричного потенціалу навантаження у стегновій кістці молодих, дорослих і старих щурів при різних ступенях механічного впливу й експериментальної гіпокінезії.
2. Визначити характер і спрямованість змін пасивних електричних властивостей стегнової кістки щурів різних вікових груп в умовах стереотипного функціонального навантаження.
3. Дослідити закономірності змін біоелектричних властивостей кістки в умовах дозованої гіпокінезії та роль змін складу й структури кісткової тканини у цих процесах.
4. Дослідити стан кисневого метаболізму м'язової та кісткової тканин задніх кінцівок щурів в умовах гіпокінезії і його зміни під впливом переривчастої нормобаричної гіпоксії (ПНГ).
5. На підставі порівняльного аналізу результатів проведених досліджень оцінити можливість використання біоелектричних показників для оцінки стану кісткової тканини.
Об'єкт дослідження - біоелектричні властивості кісткової тканини.
Предмет дослідження – потенціал навантаження та пасивні електричні властивості стегнової кістки білих щурів в умовах стереотипного й низького функціонального навантаження та парціального тиску кисню.
Методи дослідження . При виконанні роботи використано методи дозованого обмеження рухливості щурів, переривчастої нормобаричної гіпоксичної стимуляції, відведення потенціалу навантаження з поверхні кістки, мультичастотного імпедансометричного тестування, остеометрії, гравіметрії, термічної денатурації, хімічної демінералізації кістки та варіаційної статистики.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено комплексні дослідження біоелектричних властивостей (БВ) стегнової кістки білих щурів в умовах стереотипного та низького функціонального навантаження. Встановлено закономірності змін електричного потенціалу навантаження в залежності від ступеня механічного впливу на кістку та віку тварин. Уперше показано, що характер і виразність змін БВ кістки протягом життя тварини визначаються віковими особливостями складу та морфометричних показників кістки. Встановлено, що жорстка тривала гіпокінезія призводить до істотних змін біоелектричних властивостей кістки. Показано важливу роль мінералорганічної складової кісткового матриксу та води у зміні окремих показників БВ кістки в умовах гіпокінезії. Встановлено, що критичним моментом у розвитку гіпокінетичної остеопенії є підвищення гідратації кісткової тканини, що спричинює різке збільшення її електропровідності. Вперше показано, що ПНГ зменшує прояви гіпокінетичних порушень кисневого метаболізму і БВ стегнової кістки. Встановлено, що у механізмі остеопротекторної дії ПНГ важливу роль відіграє активація анаболічних процесів у кістковій тканині, що супроводжується підвищенням вмісту органічних речовин.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати сприяють більш глибокому розумінню ролі біоелектричних факторів у регуляції фізіологічної перебудови кістки при зміні режимів функціонального навантаження. Результати роботи свідчать про те, що на певному етапі розвитку гіпокінетичної остеопенії зміни ПЕВ можуть сягати такого рівня, коли реалізація біоелектричних механізмів регуляції ремоделювання кістки стає суттєво обмеженою. Виконані дослідження дають змогу говорити про перспективність використання методу мультичастотної імпедансометрії для оцінки якості кісткової тканини в клінічній практиці. Нові дані про закономірності та специфіку змін ПЕВ кістки в умовах гіпокінезії можуть бути використані для розробки діагностичних алгоритмів, а створений пристрій для досліджень електричних характеристик біологічних об'єктів вже використовується у відділі клінічної патофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Результати досліджень можуть бути використані при викладанні курсу патофізіології та фізіології кісткової системи для фахівців медико-біологічного профілю.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведений аналіз літератури, досліджені пасивні електричні властивості, склад і остеометричні показники стегнової кістки щурів, проведені обробка й аналіз отриманих результатів. Частину досліджень з реєстрації потенціалу навантаження та визначенню кисневого метаболізму м'язової та кісткової тканини виконано в співробітництві зі співавторами друкованих праць - провідним інженером Сафоновим С.Л., п.н.с. Левашовым М.І. і м.н.с. Лахіним П.В. Планування досліджень, обговорення результатів і формулювання висновків проводилося разом з науковим керівником - доктором медичних наук, професором Березовським В.Я.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені на конференції для молодих учених Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України „Перспективні напрями досліджень сучасної фізіології” (Київ, 2003); школі-семінарі для молодих учених ”Наукові космічні дослідження”, (Жукін, 2003); науково-практичній конференції “Вторинний остеопороз: епідеміологія, клініка, діагностика, профілактика та лікування”, (Київ-Тернопіль, 2003); IV Міжнародному симпозіумі “Актуальні проблеми біофізичної медицини” (Київ, 2004); школі-семінарі для молодих учених ”Наукові космічні дослідження”, (Жукін, 2004); IV Національному конгресі геронтологів і геріатрів України (Київ, 2005); школі-семінарі для молодих учених ”Наукові космічні дослідження”, (Жукін, 2005); V науково-практичної конференції „Морфогенез і патологія кісткової системи в умовах промислового регіону”, (Луганськ, 2005); XVII з'їзді фізіологів України (Чернівці, 2006); VIII World Congress of International society for Adaptive Medicine (Moscow, 2006); V Міжнародному симпозіумі “Актуальні проблеми біофізичної медицини”, (Київ, 2007). Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 статей у наукових журналах, з них 5 – у фахових виданнях, 12 тез доповідей на наукових конференціях, з'їздах, симпозіумах, отримано 1 деклараційний патент України на винахід.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 186 сторінках (обсяг основного тексту -157 стор.) і складається зі вступу, чотирьох розділів, висновків, списку використаних літературних джерел (233 найменування), робота проілюстрована 53 рисунками та 20 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ МАТЕРІАЛИ та МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження виконані на 233 щурах-самцях лінії Вістар віком від 1 до 24 міс. Усі тварини отримані з віварію Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, де вони знаходилися на стандартному раціоні харчування. Доступ тварин до їжі та води не обмежувався. Щурів виводили з експерименту за допомогою декапітації після знерухомлення в умовах ефірного наркозу. Всі маніпуляції з тваринами здійснювали відповідно до вимог біоетики та міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей.
Дозовану гіпокінезію створювали обмеженням рухливості тварин у герметичному контейнері, що складається з блоку комірок. Жорсткому режиму обмеження рухливості відповідало відношення площі проекції тіла тварини до площі обмежувальної комірки - 1:1 (Літовка І.Г.,2006). Конструкція контейнера забезпечувала можливість заміни в ньому атмосферного повітря на нормобаричну гіпоксичну газову суміш (НГГС) із заданим парціальним тиском кисню.
Гіпоксичну газову суміш одержували за допомогою мембранного газорозподільного елемента. Об'ємну швидкість подання повітря та НГГС контролювали ротаметром "РМ-063", вміст кисню - газоаналізатором "МИК-М". Періодичність подання газової суміші й атмосферного повітря в контейнер для щурів забезпечувалася в автоматичному режимі за допомогою програмного блоку керування роботою компресорів. НГГС із парціальним тиском кисню 90-98 мм рт. ст., що еквівалентно об'ємній частці кисню рівній 12-13% кисню, подавали дослідним тваринам щодня протягом 8 год у режимі 20 хв - гіпоксична газова суміш, 20 хв - атмосферне повітря.
|
|
|
Механічне навантаження на кістку здійснювали в аксіальному напрямку. Його значення розраховували виходячи з умов фізіологічного розподілу вагового навантаження між передніми та задніми кінцівками щура, згідно з яким 40% вагового навантаження припадає на передні кінцівки, а 60% - на задні (FukudaS. et al., 2004). Дослідження проводили при 3 ступенях навантажень: І ступінь - 30%, ІІ ступінь - 50% і ІІІ ступінь - 100% від маси тіла тварини. Реєстрацію ПН проводили на двокоординатному самописці XY Recorder (Прага). Вимірювали амплітуду ПН (мкВ) та розраховували його величину, яка припадає на одиницю навантаження (мкВ/г).
|
|
|
Підготовку препаратів і вимір електричних показників проводили за методикою Kosterich J. et al., (1984) з використанням платинових електродів у напрямку перпендикулярному до поздовжньої осі препарату, в умовах його повної імерсії у 0,9%-му розчині NaCl при 370 С. З метою стандартизації результатів досліджень поряд з абсолютними значеннями використовували відносні значення показників ПЕВ, які визначали з урахуванням довжини та площі перетину препарату.
Схема остеометричних досліджень складалася з визначення таких показників: маса та довжина стегнової кістки й препарату, максимальний, мінімальний і середній діаметр діафіза та кістковомозкового каналу, середня товщина стінки діафіза. Розраховували також індекси відношення діаметра кістковомозкового каналу до діаметра діафіза й відношення товщини стінки діафіза до його діаметра й діаметра кістковомозкового каналу (Алексєєв В.П.,1966). Всі остеометричні показники визначали за допомогою мікрометра з оптичною системою, який забезпечує точність вимірів ± 0,01мм і припустиму похибку ±0,004 мм.
Демінералізацію препаратів проводили за допомогою повного занурення в 10%-й розчин динатрієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА), рН 8,0. Розчин міняли щодня. Контрольні дослідження ПЕВ проводили на 14 і 28 добу демінералізації. Препарат витягали з розчину ЕДТА, ретельно промивали у 0,9%-му розчині NaCl та залишали на 24 год у свіжоприготовленому розчині. Через добу препарат ще раз промивали 0,9%-м розчином NaCl та визначали показники ПЕВ відповідно до описаної вище методики. Повноту демінералізації контролювали спалюванням препарату в муфельній печі наприкінці експерименту.
Дозовану термічну денатурацію препаратів проводили за допомогою його повного занурення на 30 с у 0,9%-й розчин NaCl , нагрітого до 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 або 1000 С ±0,50 С. Всі виміри проводили через 25 с після забирання препарату з нагрітого розчину при 370 С.
Напруження кисню в литковому м'язі щурів вимірювали in situ полярографічним методом з використанням відкритого платинового електрода на полярографі LP7 (Прага) (Березовський В.А.,1975). Споживання кисню в окремих фрагментах стегнової кістки визначали за допомогою платинового електрода за методикою Shirrmacher K. et al.,(1997). Спонгіозну частину кісткових фрагментів відмивали у 0,9%-му розчині NaCl при 25-280 С і рН 7,4. Маса кісткових фрагментів становила від 70 до 100 мг, товщина - 130-500 мкм. Фрагменти стегнової кістки поміщали в циліндричну термостатовану комірку об'ємом 2мл3 , яка була заповнена фізіологічним розчином, при 370 С и рН 7,4. Хроноамперограму реєстрували протягом 30 хв при швидкості руху діаграмної стрічки 10 мм/с. Споживання кисню за хвилину розраховували за кривою спаду кисню в часі на 100 г тканини. Коефіцієнт розчинності кисню приймали рівним 0,024 мл·мл-1 ·атм-1 при 370 С.
Дослідження вмісту в кістці мінеральних, органічних речовин і води проводили гравіметричним методом при 20-220 С і відносній вологості 75-80%. На 1-му етапі за допомогою ''ТВ-500'' визначали масу вологого препарату з точністю ±1 мг. На 2-му етапі препарат висушували в сушильній шафі при 1050 С до стабільної маси та визначали його “суху масу”. На 3-му етапі препарат спалювали в муфельній печі при 7000 С не менше ніж 5 год і визначали його “озолену масу”. Кількість води в препараті розраховували як різницю між масою вологого й сухого препарату, органічних речовин - як різницю між масою сухого й озоленого препарату. Кількість мінеральних речовин прирівнювали до вмісту золи. Щільність вологого та сухого препаратів кістки розраховували за допомогою розподілу його маси на об'єм.
Статистичний аналіз результатів проводили з використанням пакета програмного забезпечення “Statistica” 6.0 і Microsoft Exel 2000. Вірогідність різниці середніх величин визначали за t - критерієм Стьюдента і U - критеріємМанна - Уітні. Значення р<0,05 вважали вірогідними.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ та ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Потенціал навантаження стегнової кістки щурів при різних ступенях механічних впливів. При дії на стегнову кістку стандартного навантаження (Н), яке становило 50% від маси тіла щура, реєструвалися характерні двофазні коливання електричного потенціалу, амплітуда (А) яких сягала 1200 мкВ, а тривалість - 0,5 с.
Перша фаза ПН мала позитивне початкове відхилення й виникала у відповідь на додаток механічного навантаження. Друга фаза виникала при усуненні навантаження. Її початкове відхилення мало зворотну спрямованість, а амплітуда дорівнювала або була близька до амплітуди першої фази. Значення електричного потенціалу (мкВ), що доводиться на одиницю навантаження (г) – (А/Н), перебувала в діапазоні від 1 до 3 мкВ/г. При східчастому збільшенні навантаження від 30 до 100% маси тіла щура амплітуда ПН зростала в експонентній залежності.
У щурів, що перебували в умовах 28-добової жорсткої гіпокінезії, амплітуда ПН стегнової кістки при навантаженнях I, II і III ступеня була на 37, 35 і 23% відповідно менше, ніж у тварин контрольної групи.
Середня амплітуда ПН у контрольних щурів становила 720,0±89,5, 1102,6±10,8 і 1537,6±189,6 мкВ, а у дослідних - 456,8±54,5, 812,8±83,6 і 1287,7± 173,1 мкВ відповідно при навантаженнях I, II і III ступеня. При навантаженнях
8-09-2015, 23:24