На 30-ту добу експерименту видимі при біомікроскопічному дослідженні зміни стану печінки тварин різних груп нівелювалися.
У тварин 2 групи кількість функціонуючих мікросудин помітно збільшилась, ніж у тварин 1 групи, при цьому діаметр синусоїдів і кількість мікросудин менші, ніж у тварин 3 і 4 груп. Жовчні канальці починали формувати правильну мережу, хоча зустрічались ділянки з випрямленими жовчними канальцями. У тварин 3 і 4 груп ділянки без судин були практично відсутні, жовчні канальці формували мережу, близьку до нормальної.
Деструктивно-дистрофічні і репаративні процеси в циротично зміненій печінці при введенні ксеноекстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки і селезінки після локальної кріогепатодеструкції. До початку експерименту у тварин спостерігалася картина вираженого цирозу печінки. Часточкова структура печінкової тканини була порушена, балочна будова нерегулярна. Паренхіма печінки фрагментована сполучнотканинними тяжами, в окремих ділянках з утворенням хибних часточок. Гепатоцити мали різний розмір і форму. Нерідко зустрічалися некротизовані клітини, переважно в центральних відділах печінкових часточок, а також осередки некрозу у середині хибних часточок. Відношення строми до паренхіми складало 7,41±1,15 (в нормі 0,98±0,09).
На 7-му добу експерименту значних відмінностей у гістологічній будові печінки тварин досліджуваних груп не спостерігалося.
На 14-ту добу експерименту в печінці тварин 1 групи (контроль) при мікроскопічному вивченні виявлялася жирова і балонна дистрофія. Балочна будова часточок не визначалася. Фіброзна тканина, що оточувала вузли-регенерати і створювала хибні часточки, була розвиненою, в ній спостерігалися фіброцити і фібробласти, що свідчило про подальше фіброзоутворення. Ознаки портальної гіпертензії відзначалися венозним застоєм, розширенням центральних вен, гемосидерозом, розширенням артерій портальних трактів.
У тварин 2 групи у цей же строк мікроскопічно визначалися вузли-регенерати, при цьому дистрофія гепатоцитів мала, в основному, гідропічний і балонний характер і лише подекуди виявлялася жирова дистрофія. Фіброзна тканина, яка оточувала хибні часточки, була розвинена, в ній поряд з одиничними фібробластами були наявні, в основному, фіброцити, що може свідчити про закінчення фіброзоутворення. Синусоїди були помірно розширені, ліпоцити (клітини Іто), які здатні синтезувати колаген, в перисинусоїдальному просторі не спостерігалися. Ознаки портальної гіпертензії виявлялися помірною дилатацією центральних вен і артерій портальних трактів. Трабекулярна будова в часточках печінки, що збереглися, починала відновлюватися.
Мікроскопічне дослідження гістологічних препаратів печінки тварин
3 групи на 14-ту добу показало, що в печінці формувався дрібновузловий цироз. Вузли-регенерати паренхіми не мали нормальної часточкової структури і були оточені фіброзною тканиною. Артерії в портальних трактах печінки були розширені, навколо центральних вен визначався застій крові з ознаками гемосидерозу. В окремих випадках виявлялося переповнення жовчних капілярів. У гепатоцитах спостерігалась переважно гідропічна та жирова дистрофія, трабекулярна будова паренхіми визначалася лише в 1/3 часточок.
При мікроскопічному дослідженні препаратів печінки тварин
4 експериментальної групи на 14-ту добу виявлено, що вузли-регенерати паренхіми печінки були майже одного розміру. При цьому дистрофія окремих гепатоцитів, в основному, визначалась як гідропічна. Паренхіма печінки нормалізувалася – навколо центральних вен формувались радіально розташовані печінкові балки (трабекули) і синусоїди. У синусоїдах реактивність печінкових макрофагів знижувалась. Виявлялася помірна дилатація вен. Сполучна тканина, яка оточувала тріади, була слабо інфільтрована, складалась переважно з фіброцитів – зрілих клітин сполучної тканини, що свідчило про закінчення фіброзоутворення. Сполучнотканинних тяжів, що йшли углиб паренхіми і створювали хибні часточки, виявлялось значно менше, ніж у контролі (рис. 2).
На 30 та 60-ту добу відбувалась подальша нормалізація будови печінки тварин, яка була найбільше виражена в 4 групі.
Для виявлення ступеня фіброзу в печінці тварин контрольної і 3-х експериментальних груп було проведено морфометричне дослідження показника співвідношення площі строми і паренхіми на гістологічних препаратах печінки в динаміці.
При морфометричному дослідженні препаратів, забарвлених по ван Гізон, було встановлено, що протягом 2-х місяців в циротично зміненій печінці показник співвідношення площі строми і паренхіми практично не змінювався. Це свідчить про необоротний характер фіброзу.
При всіх видах впливу на циротично змінену печінку показник співвідношення площі строми і паренхіми зменшувався. Проте при кріодеструкції печінки і, особливо, при поєднаній дії кріодеструкції та ЕПС цей показник інтенсивно знижувався і вже на 14-ту добу став вищим за норму лише в 1,9 рази, а на 30-ту добу відповідав нормі.
Вплив кріогепатодеструкції і введення ксеноекстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки та селезінки на функціональну активність печінки щурів з експериментальним цирозом.Зміни концентрації альбуміну в сироватці крові щурів з цирозом печінки в залежності від умов експерименту представлені в табл. 2.
Таблиця 2
Вплив кріодеструкції і ЕПС на концентрацію альбуміну (мг/мл і % від норми) в сироватці крові щурів з експериментальним цирозом печінки
| Термін спостереження | Групи тварин | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 1-а доба | 24,1±1,01 58,12% |
25,2±1,71 60,7% |
25,5±1,21 61,4% |
25,3±0,91 61,0% |
| 3-я доба | 25,6±2,01 61,7% |
24,8±1,11 59,8% |
26,1±1,11 62,9% |
25,9±2,01 62,5% |
| 7-а доба | 25,6±1,51 61,8% |
26,1±1,11 62,9% |
28,3±1,21 68,2% |
27,3±1,91 65,83% |
| 14-а доба | 25,9±1,31 62,55% |
27,0±1,21 65,1% |
27,8±1,11 67,0% |
31,6±1,21,2,3,4 76,2% |
| 30-а доба | 27,2±1,61 65,5% |
30,1±1,31 72,43% |
35,6±1,41,2,3 85,8% |
38,4±1,12,3 92,6% |
Примітки: концентрація альбуміну в нормі ‑ 41,5±1,7 мг/мл; відмінності статистично вірогідні (р < 0,05) в порівнянні з показниками тварин: 1 ‑ інтактних; 2 ‑ з цирозом печінки; 3 ‑ з цирозом і кріодеструкцією печінки; 4 ‑ з цирозом печінки і введенням ЕПС.
Одержані дані свідчать, що застосування комплексного методу кріодеструкції печінки спільно з введенням ЕПС дозволяє через місяць досягти практично повного відновлення білоксинтетичної функції печінки у щурів з експериментальним цирозом.
Дані табл. 3 свідчать, що активність АлАТ у тварин всіх груп була вища за норму в 4 рази протягом перших 3-х діб спостереження. На 7-му добу експерименту підвищення активності АлАТ зберігалось на цьому ж рівні у тварин 1 і 2 груп, а у тварин, що одержували екстракти (групи 3 і 4), намічалася тенденція до її зниження. Так, у тварин групи 3 первинний 4-кратний підйом активності АлАТ до кінця 1-го тижня спостереження помірно знижувався і перевищував норму в 3,5 рази. У тварин 4 групи (введення ЕПС та кріодеструкція) цей показник перевищував норму в 3,3 рази. Більш значні відмінності динаміки активності АлАТ в групах дослідних тварин спостерігалися на 14-ту добу спостереження. В цей час у тварин 1 та 2 груп цей показник був в 3,6 та 2,6 рази вищий за норму, а у тварин, що одержували тільки ЕПС, ‑ в 2 рази. Рівень активності АлАТ у тварин 4 групи (кріодеструкція + ЕПС) перевищував норму всього в 1,5 рази і був вірогідно нижчим за аналогічні показники у решті груп.
На 30-ту добу спостереження тільки у тварин з цирозом печінки, який не лікували, зберігалося підвищене значення активності АлАТ (у 1,5 рази вище за норму). У решті груп рівень активності ферменту знижувався до норми. Динаміка активності АсАТ принципово не відрізнялася від динаміки активності АлАТ.
Таблиця 3
Активність АлАТ (ммоль/мл/год, % від норми) в сироватці крові щурів з експериментальним цирозом печінки
| Термін спосте-реження | Групи тварин | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 1-а доба | 1,75±0,211 473% |
1,68±0,181 454% |
1,45±0,121 392% |
1,48±0,091 400% |
| 3-я доба | 1,65±0,311 446% |
1,67±0,281 451% |
1,63±0,131 440.5% |
1,59±0,111 430% |
| 7-а доба | 1,53±0,221 413% |
1,46±0,131 394% |
1,32±0,181 357% |
1,24±0,091 335% |
| 14-а доба | 1,33±0,111 359% |
0,97±0,141 262% |
0,74±0,071 200% |
0,52±0,072,3,4 140% |
| 30-а доба | 0,58±0,081 157% |
0,41±0,03 111% |
0,39±0,042 105% |
0,32±0,022,3 86.5% |
Примітки: активність АлАТ в нормі ‑ 0,37±0,04 ммоль/мл/год; відмінності статистично вірогідні (р < 0,05) в порівнянні з показниками тварин: 1 ‑ інтактних; 2 ‑ з цирозом печінки; 3 ‑ з цирозом і кріодеструкцією печінки; 4 ‑ з цирозом печінки і введенням ЕПС.
Нормалізація рівня печінкових амінотрансфераз через 14-30 діб у тварин з цирозом, що одержували ЕПС, свідчить про їхній позитивний вплив на внутрішньоклітинні репаративні процеси в гепатоцитах. Застосування екстрактів особливо ефективне в поєднанні з методом кріодеструкції частини печінки.
Загальновизнано, що будь-які деструктивні процеси в організмі супроводжуються розвитком синдрому пероксидації, тобто підвищенням рівня вільно-радикальних процесів у тканинах і викидом продуктів ПОЛ у кров.
Представлені в табл. 4 дані показують, що в перші три доби рівень ТБКАП в сироватці крові був істотно підвищений у всіх групах дослідних тварин.
Проте вже на 7-му добу спостереження можна було відзначити, що швидкість зниження інтенсивності ПОЛ, виходячи з рівня ТБКАП в сироватці крові, була різною. У групах тварин з цирозом, який не лікували, і кріодеструкцією циротично зміненої печінки зберігався високий рівень ПОЛ – в 2,4-2,2 рази, в той же час у тварин, що одержували ЕПС, перевищення норми становило 1,9-1,8 рази, причому у тварин 4 групи рівень ТБКАП був вірогідно нижчий за аналогічний показник у тварин з цирозом, який не лікували, (р<0,05). Ще більш виражені відмінності були зафіксовані на 14-ту добу спостереження.
Таблиця 4
Рівень ТБКАП (нмоль/мл, % від норми) у сироватці крові щурів з експериментальним цирозом печінки
| Термін спостереження | Групи тварин | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 1-а доба | 9,83±1,121 277% |
9,54±0,971 269% |
9,27±1,061 261% |
9,12±0,881 257% |
| 3-я доба | 8,86±1,011 250% |
8,71±0,751 245% |
8,69±1,081 245% |
8,73±0,911 246% |
| 7-а доба | 8,52±0,851 240% |
7,74±0,671 218% |
6,87±0,741 193% |
6,31±0,531,2 177% |
| 14-а доба | 7,75±0,651 218% |
6,18±0,591 174% |
5,34±0,441,2 150% |
3,91±0,322,4 110% |
| 30-а доба | 5,43±0,411 153% |
4,21±0,332 119% |
4,15±0,282 117% |
3,75±0,442 105,6% |
Примітки: рівень ТБКАП у нормі 3,55±0,17 нмоль/мл; відмінності статистично вірогідні (р < 0,05) в порівнянні з показниками тварин: 1 ‑ інтактних; 2 ‑ з цирозом печінки; 3 ‑ з цирозом і кріодеструкцією печінки; 4 ‑ з цирозом печінки і введенням ЕПС.
В той час, як у тварин 1 та 2 груп ще зберігався досить високий рівень продуктів ПОЛ в сироватці (перевищення норми в 2,2 і 1,7 рази відповідно), у тварин 3 групи (введення ЕПС) рівень ТБКАП перевищував норму лише в 1,5 рази, а в 4 групі (кріодеструкція + ЕПС) в цей період зафіксована нормалізація даного показника. На 30-ту добу спостереження підвищений рівень ТБКАП в сироватці крові був тільки у тварин з цирозом печінки.
Загальноприйнятим показником стану екскреторної функції печінки є рівень білірубіну в сироватці крові. Білірубін ‑ основний жовчний пігмент, який утворюється в результаті розпаду гемоглобіну та інших хромопротеїдів.
Динаміка загального білірубіну в сироватці крові щурів з експериментальним цирозом печінки наведена в табл. 5.
Таблиця 5
Рівень загального білірубіну (мкмоль/л і % від інтактного контролю) в сироватці крові щурів з експериментальним цирозом печінки
| Термін спостереження | Групи тварин | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 1-а доба | 16,18±1,121 197% |
15,95±1,031 194% |
16,08±1,151 195% |
16,24±1,081 197% |
| 3-я доба | 16,05±1,351 195% |
15,88±0,771 193% |
15,56±1,031 189% |
15,32±1,331 186% |
| 7-а доба | 15,74±0,781 191% |
13,67±0,651 166% |
12,54±0,871 152% |
11,08±0,661 135% |
| 14-а доба | 13,95±1,11 170% |
11,32±0,711 138% |
10,15±0,762 124% |
8,45±0,722,3 103% |
| 30-а доба | 9,68±0,85 118% |
8,50±0,46 103% |
8,64±0,61 105% |
8,17±0,55 99% |
Примітки: рівень загального білірубіну в нормі 8,21±0,54 мкмоль/л; відмінності статистично вірогідні (р < 0,05) в порівнянні з показниками тварин: 1 ‑ інтактних; 2 ‑ з цирозом печінки; 3 ‑ з цирозом і кріодеструкцією печінки.
Експериментальні результати дослідження свідчать, що найбільш активна стимуляція репаративних процесів в циротично зміненій печінці експериментальних тварин спостерігалася при поєднанні кріодеструкції та введення ЕПС. Це виражалося в тому, що тільки в цій групі протягом місяця відновилися до нормального рівня всі досліджувані функції печінки. Через місяць повністю відновився вміст альбуміну в сироватці крові, ще раніше (через 2 тижні) нормалізувалася активність амінотрансфераз, а також рівень продуктів ПОЛ і білірубіну. Тобто одночасне застосування кріодеструкції та екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки і селезінки при лікуванні експериментального цирозу не тільки сприяло відновленню більшості найважливіших функцій печінки, але й удвічі прискорило їх нормалізацію на відміну від застосування вказаних методів окремо.
Вищевикладене свідчить про те, що поєднане застосування кріодеструкції і екстрактів кріоконсервованих фрагментів паренхіматозних органів забезпечує високу ефективність лікування експериментального цирозу печінки у щурів.
ВИсновки
В роботі подані теоретичне і експериментальне узагальнення, а також нове вирішення наукової проблеми стимуляції процесів відновлення в циротично зміненій печінці шляхом поєднаного застосування кріодеструкції частини печінки та екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки і селезінки.
1. Встановлено, що застосування кріогепатодеструкції та екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки і селезінки у щурів з експериментальним цирозом зупиняє процеси склерозування циротично зміненої печінки, нормалізує судинне русло та сприяє відновленню гістологічної будови і окремих функцій пошкодженого органа.
2. Показано, що дозована кріогепатодеструкція і введення екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки та селезінки щурам з експериментальним цирозом печінки призводять до нормалізації мікроангіоархітектоніки і фукціонування мікроциркуляторного русла в органі-мішені, що характеризується зникненням звивистості синусоїдів, збільшенням кількості мікросудин, що функціонують, збільшенням площі судин з швидким кровострумом та відсутністю агрегації еритроцитів.
3. Виявлено, що дозована кріогепатодеструкція сприяє відновленню часточкової структури пошкодженої при формуванні експериментального цирозу печінки щурів і забезпечує припинення процесу склерозування та його активний зворотний розвиток, що завершується на 30-ту добу після експериментального впливу.
4. Встановлено, що застосування екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки і селезінки стимулює ангіогенез, відновлення гістологічної будови пошкодженого органа і сприяє зменшенню фіброза печінки щурів з експериментальним цирозом.
5. Поєднання кріогепатодеструкції з уведенням екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки і селезінки в лікуванні щурів з експериментальним цирозом печінки призводить до практично повної нормалізації органоспецифічної будови ушкодженої печінки вже через 14 діб після експериментального впливу.
6. Показано, що застосування кріогепатодеструкції та екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки і селезінки у щурів з експериментальним цирозом стимулює відновлення функціональної активності пошкодженої печінки: сприяє підвищенню рівня сироваткового альбуміну, зниженню секреції білірубіну, поступовій нормалізації рівня печінкових амінотрансфераз, зниженню інтенсивності процесів ПОЛ.
7. Поєднане застосування локальної кріогепатодеструкції і екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки і селезінки забезпечує найбільш активну стимуляцію відновних процесів в печінці щурів з експериментальним цирозом , скорочуючи терміни її відновлення в 2 рази порівняно з дією цих методів при окремому вікористанні.
Список робіт, опублікованих за темою дисертації
1. Олефиренко А.А., Гойденко Н.И., Слета И.В., Гальченко С.Е., Тыныныка Л.Н., Сандомирский Б.П. Криохирургия цирротически измененной печени крыс на фоне введения ксеноэкстрактов паренхиматозных органов новорожденных поросят. Морфологический аспект // Междунар. науч.-практич. конф. “Новое в практической медицинской криологии“(18 ноября). ‑ Москва, 2004. ‑ С. 61-62.
2. Олефиренко А.А., Тыныныка Л.Н., Слета И.В., Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П. Некоторые биохимические показатели при экспериментальном циррозе печени крыс и стимуляции регенерации // Материалы науч.-практич. конф. “Лекарства-человеку” (6 декабря). ‑ Харьков, 2004. ‑ С. 107-108.
3. Олефиренко А.А., Слета И.В., Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П. Мікроциркуляція циротично зміненої печінки після кріодеструкції на фоні введення ксеноекстрактів // Тези доп. Ювілейного VIII з'їзду ВУЛТ (Всеукраїнського лікарського товариства), присвяченого 15-річчю організації (1990-2005). ‑ Івано-Франківськ, 2005. ‑ С. 264-265.
4. Олеф
і
ренко О.О., Луценко Д.Г., Слета I.В., Марченко В.C.
Фрактальна морфометрiя мiкроциркуляторного русла печiнки в нормi та при експериментальних впливах // Проблемы криобиологии. ‑ 2005. ‑ Т.15, №3. ‑
C. 511-512.
5. Олефиренко А.А. Применение экстрактов паренхиматозных ксеноорганов для стимуляции регенераторных процессов в печени // Тезисы VII Международ. конф. молодых онкологов “Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии“. ‑ Киев, 2006. ‑ С.62.
6. Olefirenko A.A., Sleta I.V., Galchenko S.E., Sandomirsky B.P. Cryosurgery and xenoextracts when treating experimental liver cirrhosis: «Cryo-2006». ‑ Hamburg, 2006. ‑ P. 74.
7. Олефіренко О.О., Слета І.В., Гальченко С.Є., Сандомирський Б.П. Кріобіологічні підходи до лікування експериментального цирозу печінки // Тези доповідей XI Конгресу світової федерації українських лікарських товариств. ‑ Полтава, 2006. ‑ С. 510-511.
8. Олефиренко А.А., Луценко Д.Г., Слета И.В. Криохирургия и ксеноэкстракты в лечении экспериментального цирроза печени: Матеріали наук.-практич. конф. “Профілактика, діагностика та лікування – основні складові терапії“, Харків, 2006. ‑ С. 68.
Анотації
Олефіренко О.О. Вплив кріодеструкції, екстрактів печінки і селезінки на відновні процеси в печінці при експериментальному цирозі. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 – кріомедицина. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.
В даній роботі було вивчено в порівняльному аспекті вплив на процеси відновлення в циротично зміненій печінці дозованої кріодеструкції, суміші екстрактів печінки і селезінки, а також досліджено їх спільну дію.
Встановлено, що поєднане застосування тканинних екстрактів і локальної кріогепатодеструкції найбільш активно стимулює відновлення функціональної активності пошкодженої печінки, скорочуючи терміни її відновлення в 2 рази в порівнянні з використанням цих методів окремо, про що свідчила повна нормалізація всіх досліджуваних гепатозалежних метаболічних маркерів, що вивчалися, в більш ранні терміни (на 14-ту добу).
Ключові слова : цироз печінки, кріодеструкція, екстракти, регенерація.
Олефиренко А.А. Влияние криодеструкции, экстрактов печени и селезенки на восстановительные процессы в печени при экспериментальном циррозе. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 – криомедицина. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.
Несмотря на многолетний опыт и успехи консервативного и оперативного лечения хронических диффузных заболеваний печени, на сегодняшний день нельзя говорить о наличии эффективных методов терапии этих заболеваний. Одной из причин этого является отсутствие препаратов, достаточно полно стимулирующих регенерацию печени.
Для стимуляции процессов регенерации печени используют различные хирургические методы, в том числе криодеструкцию соответствующей массы органа.
В последние годы для оптимизации процессов регенерации в органах и тканях стали применять регуляторные пептиды. Под оптимизацией в данном случае имеется в виду не только поддержка целостности органа или ткани в нормальных условиях, но и быстрое и эффективное ее восстановление при остром или хроническом воздействии какого-либо повреждающего фактора, существенное снижение темпа (или возможности) развития патологических форм регенерации: разрастание фиброзной ткани, метапластическое перерождение клеток (как в случае цирроза) и др.
В работе использованы методы моделирования цирроза печени, прижизненной контактной микроскопии, биохимические, гистологические, морфометрические методы и методы статистической обработки результатов.
В диссертационной работе проведено сравнительное изучение влияния на процессы восстановления в циротически измененной печени криодеструкции, введения экстрактов печени и селезенки,
8-09-2015, 21:55