Вміст загального ХС і тригліцеридів в сироватці крові визначали ферментним методом за допомогою комбінованих діагностичних наборів фірми „Human” (Німеччина).
Вміст ХС ЛПВЩ у сироватці крові визначали так, як і загальний ХС у супернатанті після осадження із сироватки апоВ-вміщуючих атерогенних ліпопротеїнів (ЛПНЩ і ЛПДНЩ) сумішшю 12 mM фосфовольфрамату натрію і 0,5 mMMgCl2 (1,1 mM фосфовольфрамату натрію і mMMgCl2 кінцевої концентрації).
Рівень ХС ЛПНЩ у сироватці крові обчислювали за формулою Friedwald еt.al: (1991) ХС ЛПНЩ = ХС – (ТГ: 5 + ХС ЛПВЩ). Дослідження ліпідного спектру сироватки крові проводили сумісно з лікарями-лаборантами Центральної науково-дослідної лабораторії Дніпропетровської державної медичної академії (завідувач – д.мед.н., професор О.Л.Дроздов).
Концентрацію глюкози в сироватці крові натщесерце і через 120 хвилин після прийому пробного сніданку (енергетичного еквіваленту 75г глюкози) визначали глюкозооксидазним методом по кінцевій точці на автоаналізаторі „Humma-Laser-2000” (Німеччина), за допомогою діагностичних наборів Діаком Глюкоза ГО 200 (ЗАО „Диаком ВНЦМДЛ”, Москва, Росія) (Дедов И.И., Фадеев В.В., 1998).
Рівень імунореактивного інсуліну в сироватці крові визначали натщесерце і через 120 хвилин після прийому пробного сніданку за допомогою стандартних радіо- імунологічних наборів (Інститут біохімії АН Білорусі „Рио-Инс-ПГ-125”).
Визначення концентрації глікозованого гемоглобіну проводилось методом афінної хроматографії високого тиску на автоматичному аналізаторі для визначення глікозованого гемоглобіну за допомогою наборів фірми „Human” (Німеччина).
Показники кальцій-фосфатного обміну оцінювали за концентрацією кальцію і неорганічного фосфору в сироватці ясенної крові, а також за рівнем їх екскреції в ранковій порції сечі, натщесерце, по відношенню до екскреції креатинину в цій же порції сечі.
Стан формування кісткової тканини оцінювали за активністю лужної фосфатази і за вмістом остеокальцина в сироватці капілярної крові. Визначення перелічених показників (крім остеокальцину), проводилось фотометричним методом наборами фірми „HoospitenDiagnostics” (Швейцарія) на біохімічному аналізаторі „Humma-Laser-2000” (Німеччина). Остеокальцин визначався радіоімунологічним методом з використанням наборів фірми „CisInternational” (Франція). Висновки щодо рівня резорбції кісткової тканини ми робили за вмістом оксипроліну в сечі і його екскреції по відношенню екскреції креатинину. Оксипролін визначався за реакцією з парадіметиламінобензальдегідом (Криль А.А., Фурцева Л.Н., 1968).
Результати дослідження підлягали статистичній обробці на Р-IVвMSExcel для операційної системи „Windows2000” з використанням критеріюt Стьюдента.
Результати власних досліджень та їх обговорення . Клінічні аспекти вивчення генералізованого пародонтиту у хворих на цукровий діабет 2 типу, залишаються актуальними. Перш за все, це відноситься до розробки питань оцінки перебігу захворювання, а також з’ясуванню етіологічних факторів і механізмів формування різного клінічного прояву запально-деструктивного процесу в пародонті.
За результатами нашого дослідження, генералізований пародонтит у хворих на цукровий діабет 2 типу проявляється двома варіантами: латентним перебігом та прогресуючим.
Отримані клінічні дані свідчили про те, що особливості генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті 2 типу не мають прямої залежності від тривалості перебігу основного захворювання, а визначаються, багато в чому, його тяжкістю. Так, за клінічними і параклінічними показниками латентний перебіг генералізованого пародонтиту діагностувався у більшості пацієнтів з компенсованою формою цукрового діабету 2 типу (96,2% випадків). Напроти, при декомпенсованому перебігу цукрового діабету 2 типу превалювала частота виявлення прогресуючого генералізованого пародонтиту (80,8% випадків). З приблизно однаковою частотою зустрічались обидва типи перебігу захворювання при субкомпенсованій формі основного захворювання (відповідно у 43,8% і у 56,2% випадках).
Дані обставини потребували проведення багатопланових клініко-лабораторних досліджень, направлених на з’ясування того, які етіологічні фактори і конкретні патогенетичні механізми у хворих на цукровий діабет 2 типу визначають формування різних варіантів клінічного прояву генералізованого пародонтиту.
Враховуючи вищезазначене, нами був проведений мікробіологічний моніторинг пародонтальної еконіші у 178 хворих на генералізований пародонтит, із них у 152 пацієнтів із цукровим діабетом 2 типу і 26 хворих без супутніх захворювань.
Встановлено, що у хворих з латентним перебігом генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті 2 типу і у пацієнтів групи порівняння домінуюче значення мають мікроаерофільні бактерії на фоні зниження кількості лакто- і біфідобактерій. При цьому ідентифіковані наступні аеробні мікроорганізми: Peptostreptococcus (у 89,4%), Streptococcushaemoliticus (у 77,6%), Streptococcussangvius (у 53,9%), Staphylococcusaureus (у 38,2%), гриби роду Candida (у 29,8%), Streptococcusintermedia (у 28,9%), Fusobacteriumnecroform (у 11,8%).
Важливо відмітити, що частота зустрічаємості A. actinomicetemcommitans, Prevotellaintermedia, Bacteroidesforsithus у хворих на цукровий діабет 2 типу з латентним перебігом генералізованого пародонтиту не мала достовірної різниці в порівнянні з такою у пацієнтів без цукрового діабету і відповідно склала: 26,3%; 18,4% і 36,8% випадків. З усіх пародонтопатогенів у названих хворих найбільш частіше зустрічався Porhyromonasgingivalis – у 40,7% випадках.
В той же час, відмінною особливістю мікробного спектру тканин пародонту у хворих на прогресуючий генералізований пародонтит було домінуюче знаходження в тканинах пародонту аеро-анаеробних асоціацій мікроорганізмів, більшість із яких були 3-4 компонентними. Такий біоценоз у пародонтальних тканинах реєструвався у хворих даної групи в 4 рази частіше, ніж у хворих з латентним перебігом на фоні зникнення індигенної флори. Крім цього, аеробні і анаеробні мікроорганізми пародонтальної еконіші у хворих з прогресуючим генералізованим пародонтитом при цукровому діабеті 2 типу володіли високою здатністю до обсіменіння, мали не нижче 106 і 107 КОЕ од/мл.
У хворих з прогресуючим перебігом захворювання нами знайдена висока частота виявлення умовно-патогенних мікроорганізмів із пародонтальної кишені: Streptococcussangvius - у 71,1% випадках, Peptostreptococcusmicros - у 64,5% випадках, Enterobacterspp. – у 55,3% випадках, Streptococcusintermedia - у 44,7% випадках. Більш ніж у 25% випадках, у пацієнтів, які страждають на цукровий діабет 2 типу з прогресуючим типом перебігу генералізованого пародонтиту, виявлені клебсієли.
Виявлені у великій кількості (у 51,3% випадках) Candidaalbicans є показником вираженого дисбіотичного стану пародонту.
В процесі мікробіологічних досліджень виявлена закономірність – масивне заселення умовно-патогенними і патогенними мікроорганізмами тканин пародонту у хворих на цукровий діабет 2 типу із прогресуючим типом перебігу генералізованого пародонтиту відбувається на фоні зниження частоти зустрічаємості представників індигентної флори (Lactobacillusspp. – до 28,9%; Bafidobacteriumspp. – до 23,7%; Str. viridans – до 11,8%) і одночасного зменшення щільності колонізації ними пародонтальної еконіші – до 102 КОЕ од/мл. З цим, вочевидь, і пов’язаний у хворих з прогресуючим перебігом генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті 2 типу ріст частоти зустрічаємості в пародонтальній еконіші і інтенсивніть обсіменіння її основними пародонтопатогенами: Porhyromonasgingivalis – у 80,3% випадках; A. actinomicetemcommitans – у 77,6% випадках; Bacteroidesforsithus – у 47,4% випадках; Prevotellaintermedia – у 40,7% випадках. Щільність обсіменіння пародонтальної кишені названими вище мікроорганізмами коливалась у межах 107 – 108 КОЕ од/мл.
Проведений мікробіологічний моніторинг спектру бактерій у пародонтальній еконіші хворих на генералізований пародонтит при цукровому діабеті 2 типу, дозволив виявити, що аеробна флора сприяє розвитку і піддержанню латентного перебігу клінічного типу захворювання, змішана аеробно-анаеробна – прогресуючого патологічного процесу в пародонті.
Відомо, що персистенція умовно-патогенними мікроорганізмами розвивається на фоні імунодефіцитних станів і підсилює їх прояв (Чекнев С.Б., 1994). Для виявлення патогенетичного значення змін стану імунітету і елімінаційних механізмів імунологічні дослідження проведені у 178 хворих на генералізований пародонтит, з них у 152 пацієнтів, які страждають на цукровий діабет 2 типу. В якості контролю використовували дані, одержані у 24 умовно здорових осіб.
В залежності від типу перебігу захворювання була виявлена статистично достовірна різниця як кількісних, так і функціональних показників імунітету. Аналіз одержаних результатів показав, що при обох типах перебігу генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті 2 типу, у порівнянні з контрольною групою, достовірно знижена кількість лімфоцитів за абсолютними показниками. При порівнянні численності субпопуляцій лімфоцитів у залежності від типу перебігу захворювання виявлено, що при прогресуючому перебігу кількість Т-лімфоцитів СД3 + , СД4 + , СД8 + , NK (СД16 + ) була достовірно нижча, ніж у групі осіб з латентним перебігом патологічного процесу в пародонті і контрольній групі, що свідчить про більш глибокий імунодефіцитний стан (табл.1).
Таблиця 1. Показники клітинного імунітету в залежності від типу перебігу генералізованого пародонтиту (M±m)
Імунологічні показники |
Тип перебігу генералізованого пародонтиту | Контрольна група (n=24) |
||
латентний перебіг (n=76) |
прогресуючий перебіг (n=76) |
|||
| Лімфоцити | мм3 | 1795,2±33,8* | 1651±26,7* ** | 2097±54,8 |
| % | 31,4±0,6* | 28,1±0,6* ** | 33,9±1,2 | |
Т-лімфоцити (СД3 + ) |
мм3 | 965,8±22,4* | 804±25,5* ** | 1346,2±34,6 |
| % | 53,8±0,9* | 48,7±1,1* ** | 64,2±1,2 | |
Т-хелпери (СД4 + ) |
мм3 | 581,6±15,3* | 458,3±16,9* ** | 752,8±21,4 |
| % | 32,4±0,8* | 27,7±0,6* ** | 35,9±0,8 | |
Цитотоксичні Т-лімфоцити (СД8 + ) |
мм3 | 317,8±12,7* | 231,6±13,9* ** | 457,1±22,7 |
| % | 17,7±0,4* | 14,2±0,4* ** | 21,8±0,6 | |
ІРІ (СД4 + / СД8 + ) |
% |
1,83±0,02* |
1,98±0,03* ** |
1,64±0,02 |
NK-клітини (СД16 + ) |
мм3 | 312,4±10,7* | 176,1±12,5* ** | 224,4±17,4 |
| % | 16,1±0,4* | 9,7±0,4* ** | 10,7±0,6 | |
В-лімфоцити (СД20 + ) |
мм3 | 409,3±12,5* | 265,8±9,3* ** | 400,8±19,2 |
| % | 22,8±0,4* | 16,1±0,4* ** | 19,6±0,5 | |
Апоптоз (СД95 + ) |
% | 15,4±2,3 | 20,3±2,08* ** | 13,6±1,2 |
| (СД54 + ) | % | 17,9±1,4 | 12,9±1,7* ** | 18,8±2,2 |
Примітки:
1 - * р<0,05 по відношенню до даних контрольної групи;
2 - ** р<0,05 по відношенню до групи з латентним перебігом захворювання;
3 - n – кількість пацієнтів у групі.
Заслуговувало на увагу те, що при прогресуючому типі перебігу генералізованого пародонтиту кількість СД95 + - клітин достовірно нижча, ніж при латентному. Це відображає порушення захисного механізму, як апоптозу по відношенню до цитотоксичних лімфоцитів і характеризує зрив компенсаторних реакцій імунної системи, що приводить до глибокого імунодефіцитного стану.
Напроти, латентний перебіг патологічного процесу в пародонті супроводжується значним і достовірним збільшенням експресії СД95 + - клітин, що направлено на переривання імунологічних реакцій. Цілком імовірно, що посилення апоптозу у хворих з латентним перебігом генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті 2 типу не приводить до розриву патологічного кола імунологічних порушень, а лише сприяє певній тимчасовій стабілізації процесу.
Зміна гуморального імунітету є невід’ємною частиною імунологічних реакцій, що розвиваються при генералізованому пародонтиті. Нами виявлено зниження числа В-лімфоцитів за кількісними і абсолютними параметрами порівняно з контролем тільки у хворих з прогресуючим генералізованим пародонтитом. Слід відмітити, що кількість В-клітин не відображає точно їх функціональний стан у хворих на генералізований пародонтит при цукровому діабеті 2 типу. Так, у хворих з прогресуючим клінічним типом захворювання є всі ознаки дисфункції гуморального імунітету (підвищення рівнів IgG, IgM) та ознаки його зниження (зменшення рівнів SIgA, IgA в змішаній слині). Направленість порушень гуморальної ланки імунітету у пацієнтів, незалежно від типу перебігу генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті 2 типу, була однаковою, але при прогресуванні захворювання ці зміни були достовірно більш значимими (р<0,05). Імовірно, що наглядний у цьому випадку дисбаланс у рівнях SIgA, IgA, IgG, IgM у змішаній слині пов’язаний з дефектом місцевого синтезу або з порушенням транспорту імуноглобулінів з кровотоку.
Елімінація бактеріальних агентів здійснюється з участю фагоцитуючих клітин, до яких відносяться моноцити, макрофаги і нейтрофіли. Дослідження фагоцитарної активності нейтрофілів дозволило встановити, що зниження фагоцитарної активності спостерігається у всіх хворих на генералізований пародонтит при цукровому діабеті 2 типу, що проявлялось достовірним зменшенням числа фагоцитуючих клітин і нейтрофілів, здатних до фагоцитозу порівняно із здоровими особами. Слід відмітити, що у хворих з прогресуючим типом генералізованого пародонтиту показники фагоцитарної активності (ФА і ФЧ) були достовірно нижчими, ніж у пацієнтів з латентним перебігом захворювання.
Суттєва роль у прогресуванні генералізованого пародонтиту у хворих на цукровий діабет 2 типу, як показали наші дослідження, належить прозапальним цитокінам. Виявлено, що при прогресуванні запально-деструктивного процесу в пародонті на фоні цукрового діабету 2 типу, відбувається значиме і достовірне (р<0,05) збільшення експресії прозапальних цитокінів (ІЛ-1в, ІЛ-2, ІЛ-8, ФНП-б), зниження протизапальних цитокінів (ІЛ-4, ІЛ-10). Напроти, у хворих на цукровий діабет 2 типу з відносно сприятливим перебігом патологічного процесу в пародонті (латентний перебіг) виявлена більш низька продукція ІЛ-1в, ІЛ-2, ІЛ-8, ФНП-б і більш висока експресія інтерлейкінів ІЛ-4 і ІЛ-10, ніж у хворих на генералізований пародонтит з прогресуючим патологічним процесом у пародонті (табл.2).
При оцінці прозапального цитокінового профілю у хворих на генералізований пародонтит при цукровому діабеті 2 типу, виявлені наступні особливості: незначне підвищення продукції ІЛ-1в, значиме і достовірне зниження ІЛ-2 у хворих з прогресуючим перебігом генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті 2 типу, що свідчить про виражену імуносупресію і відображає наявність імунодефіцитного стану. ІЛ-1в стимулює Т-лімфоцити до утворення ІЛ-2 і посилює функціональну активність багатьох видів клітин. ІЛ-2, будучи індуктором – „диригентом,” сприяє проліферації тімоцитів, цитотоксичних лімфоцитів, а також антитілоутворення до залежних антигенів.
Таблиця 2. Рівні цитокінів в ясенній крові (пг/мл) у хворих на цукровий діабет 2 типу з різними типами перебігу генералізованого пародонтиту (M±m)
Інтерлейкіни |
Групи досліджуваних | ||
| Хворі на генералізований пародонтит | Здорові (n=24) |
||
з латентним перебігом (n=76) |
з прогресуючим перебігом (n=76) |
||
| ФНП-б | 187,3±4,8* | 511,6±13,8* ** | 41,3±2,4 |
| ІЛ-1в | 916,2±30,8* | 216,4±27,6* ** | 16,9±0,4 |
| ІЛ-2 | 1047,5±59,1* | 508,3±29,1* ** | 1476,3±102,4 |
| ІЛ-4 | 209,1±8,2* | 37,4±3,3* ** | 29,8±2,3 |
| ІЛ-6 | 145,7±27,1* | 88,3±29,2* ** | 46,9±0,2 |
| ІЛ-8 | 82,3±2,8* | 413,1±3,4* ** | 54,2±3,7 |
| ІЛ-10 | 73,8±2,6* | 22,6±0,9* ** | 61,2±1,2 |
Примітки:
1. * р<0,05 по відношенню до групи здорових;
2. ** р<0,05 по відношенню до групи з латентним перебігом захворювання;
3.n – кількість пацієнтів у групі.
У хворих з прогресуючим типом генералізованого пародонтиту, в порівнянні з пацієнтами, які мають латентний перебіг патологічного процесу в пародонті, виявлена тенденція до менш вираженого підвищення ІЛ-1в (216,4±27,6 пг/мл проти 916,2±30,8 пг/мл; р<0,05), що дозволяє стверджувати про більш виражене напруження цитокінової регуляції в них.
Альтернативним субстратом для визначення ІЛ-1в може бути слина. Найбільш високий його рівень у нестимульованій змішаній слині виявлено у хворих з латентним перебігом генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті 2 типу (512,7±31,3 пг/мл), помірний – у хворих з прогресуючим типом захворювання (383,5±42,4 пг/мл, при нормі 299,8±27,1 пг/мл; р<0,05). Вочевидь, з цією закономірністю пов’язаний високий резорбтивний ефект ІЛ-1в, вміст якого в сироватці крові у хворих з активно прогресуючим перебігом значно вищий, ніж у слині.
Підвищена проникність слизової оболонки порожнини рота для ІЛ-1в можливо є компенсаторною реакцією, направленою на його зниження в сироватці крові. Дане судження знайшло підтвердження при аналізі змін коефіцієнту розподілу (співвідношення вмісту ІЛ-1в у крові до його концентрації в нестимульованій слині) у залежності від клінічного прояву генералізованого пародонтиту у хворих на цукровий діабет 2 типу. Максимально високі показники реєструвались у пацієнтів з прогресуючим перебігом захворювання (в середньому: 2,38±0,6, при нормі 0,08±0,001), низькі (в середньому: 0,41±0,04) - у пацієнтів з латентним перебігом захворювання.
Відомо, що ІЛ-1в є ініціатором цитокінового каскаду в тканинах ясен і посилює при цьому як власну продукцію, так і синтез ФНП-б та інших медіаторів. Вміст цього медіатора в сироватці крові хворих з прогресуючим генералізованим пародонтитом при цукровому діабеті 2 типу склав у середньому 511,6±13,8 пг/мл і перевищував його рівень у пацієнтів з латентним перебігом у пародонті в 2,7 рази.
Вочевидь, що зростаюча концентрація ІЛ-1в і ФНП-б є результатом активації в осередку запалення макрофагів – основних продуцентів даних цитокінів.
Наші дані свідчать, що вміст у сироватці крові ІЛ-4 хворих на генералізований пародонтит, незалежно від типу перебігу захворювання, був достовірно підвищеним у порівняні з контрольною групою. Більш високі показники ІЛ-4 відмічено у хворих з латентним перебігом генералізованого пародонтиту, порівняно з такими у пацієнтів з прогресуючим проявом патологічного процесу в пародонті (в середньому: 209,1±8,2 пг/мл проти 37,4±3,3 пг/мл). Підвищена продукція ІЛ-4 корелює зі зниженим рівнем СД4 + - клітин (r=0,30) на фоні достовірно зниженого вмісту СД8 + - клітин (r=0,42), що відображає спробу перемикання імунологічної відповіді на Th-2 тип реагування, що сприяє більш сприятливому перебігу захворювання.
На наш погляд, саме Th-2 цитокіни сприяють прояву гіперфункції В-клітин, які локалізовані в хронічно запаленій тканині ясни. Прояв цієї реакції пов’язаний з підвищеною експресією мононуклеарними клітинами запаленої ясни ІЛ-6. Цим, вочевидь, і пояснюється більш значиме і достовірне підвищення ІЛ-6 у хворих з латентним перебігом генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті 2 типу (в середньому: 145,7±27,1 пг/мл), ніж у хворих з прогресуючим проявом патологічного процесу в пародонті (в середньому: 88,3±29,2 пг/мл).
Відомо, що ІЛ-6 здатний викликати диференційовку В-клітин у плазматичні, а також активувати резорбцію кістки. Цим, мабуть, і можна пояснити, чому при відносно сприятливому перебізі захворювання активність резорбтивного процесу в міжзубних альвеолярних структурах висока (FujihashiK., KonoY., KiyonoH., 1992; FujihashiK., BeagleyK.W., KonoYetal., 1993;).
Враховуючи той факт, що ІЛ-6 є антагоністом ІЛ-1в, значиме і достовірне підвищення продукції цих цитокінів можна розглядати як компенсаторну реакцію, направлену на зниження рівня продукції прозапальних цитокінів, спробу збереження балансу в цитокіновій мережі.
Незначне підвищення вмісту ІЛ-4 у хворих з прогресуючим перебігом генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті 2 типу, на фоні різкого зниження СД4 + (до 27,7±0,6% при нормі 35,9±0,8%) і СД8 + (до 14,2±0,4% при нормі 21,8±0,6%) та зниження кількості В-лімфоцитів СД20 + (до 16,1±0,4% при нормі 19,6±0,5%) і рівня SIgA(до 0,37±0,02% при нормі 1,24±0,06%), свідчать про наявність у даних хворих імунодефіцитного стану по Th-1 і Th-2 типу.
При вивченні вмісту прозапальних цитокінів ІЛ-8 у сироватці крові хворих на генералізований пародонтит при цукровому діабеті 2 типу було виявлено значне підвищення його рівня при прогресуючому типі захворювання (більш ніж у 7,7 рази в порівняні з умовною нормою; в середньому вміст ИЛ-8 - 419,1 пг/мл), помірне (в 1,5 рази; в середньому - 82,3 пг/мл) при латентному типу перебігу патологічного процесу в пародонті. Це, можливо, вказує на визначну роль ІЛ-8 у прогресуванні генералізованого пародонтиту, як важливого ангіогенного фактору, сприяючого хемотаксису імунокомпетентних клітин до осередку запалення. До цього ж, ІЛ-8 є важливим ангіогенним фактором, що сприяє підсиленню васкуляризації, з якою пов’язують підвищення резорбтивного процесу в кісткових структурах (BickelM., 1993; GainetJ., Chollet-MartinS., 1998).
При прогресуючому перебізі генералізованого пародонтиту у хворих на ЦД 2 типу зміни продукції ІЛ-10 були нижчими, ніж у пацієнтів з латентним проявом захворювання. Менше зниження продукції протизапального ІЛ-10 у хворих з латентним перебігом генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті і без нього допустимо розцінювати як компенсаторну реакцію у відповідь на підвищену продукцію ІЛ-1в, ІЛ-6, ІЛ-8.
Проведені нами дослідження
8-09-2015, 22:31