УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР
«ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ»
МАЛАКЄЄВА-ЧЕБАНЮК ІРИНА ВЛАДИСЛАВІВНА
УДК 619:616.98:578.833.3:615.371
Розробка живої культуральної вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби
16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія
ABTOPEФЕР AT
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата ветеринарних наук
Харків – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини».
Наукові керівники: доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Фукс Поліна Павлівна , Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН;
кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник Стеценко Володимир Іванович , Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», завідувач відділу вірусології.
Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор Білокінь Віктор Степанович, Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», завідувач відділу біотехнології та біохімії;
кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник Кучерявенко Олександр Олександрович , Інститут ветеринарної медицини УААН, провідний науковий співробітник лабораторії з вивчення лептоспірозу сільськогосподарських тварин.
Захист відбудеться « 29 » квітня 2008р. о « 9. 30 » годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.
Автореферат розісланий « 26 » березня 2008 р.
Учений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор ветеринарних наук, професор А.Ф. Бабкін
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Вірусна діарея (ВД) має значне поширення серед великої рогатої худоби майже в усіх країнах світу. Вона характеризується високою контагіозністю, розвитком ерозивно-виразкового запалення слизових оболонок травного тракту, ураженням респіраторних і статевих органів, а також суглобів (Білокінь В.С., 1971; Жидков С.А., 1994; Сюрин В. Н., 1998; Стеценко В. І., 1999; Greiser-Wilke K., 2002; Годовський О.В., 2007). У більшості випадків вірусна діарея перебігає в латентній формі, у тільних корів спричиняє інфікування плодів, аборти, мертвонародження або народження слаборозвинених телят з вираженою імунологічною толерантністю (Гуненков В.В. та ін., 1982; Цибанов С.Ж. та ін., 1995; Molnar E. et al., 2002; Кучерявенко В.В., 2005).
Різноманітність клінічних проявів хвороби та особливості біологічних властивостей збудника ускладнюють діагностику та заходи щодо профілактики вірусної діареї.
Збудник вірусної діареї належитьдо родини пестивірусів, має антигенну спорідненість із вірусом класичної чуми свиней та пограничної хвороби овець (Darbyshire F.H., 1960; Крюков Н. Н. и др., 1978; Чермашинцев В. И. и др., 1996; Бабкін М. В., Стеценко В.І., 1997), досить стійкий в умовах довкілля. Його інфекційність за температури мінус 20 єС зберігається впродовж 30 діб, а за мінус 40 єС – протягом декількох років. Він добре розмножується як у культурах первинно трипсинізованих, так і перещеплюваних клітин (Гизитдинов Н.Н. и др., 1977; Файзулина С.И. и др., 1977; Куликова И.Л. и др., 1992; Закутский И. И. и др., 1995; Ким Т. Г. и др., 1995; Білокінь В.С. та ін., 1997; 2000; Шульгин М. И. и др., 2003; Baker F. C., 1990; Becher P. et al., 2001; Bruschke C.F. et al., 1998; Glandaspero M. et al., 1998; Campen H. et al., 2001, Kelling C.L. et al., 2002).
Важливим фактором, який сприяє поширенню збудника, є особливість вірусної діареї перебігати в прихованій формі. Вірус може тривалий час персистувати в організмі клінічно здорових дорослих тварин, виділятися в зовнішнє середовище та заражати молодняк.
Наявність латентної форми й різноманітність прояву клінічних ознак у тварин різного віку потребують особливої стратегії щодо профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби в неблагополучних господарствах, в яких хвороба перебігає в найбільш тяжкій формі серед телят, спричиняючи їх загибель.
На сьогодні немає сумніву, що в патології молодняка великої рогатої худоби вірусна діарея є однією з провідних інфекцій. В Україні, на жаль, вірусній діареї приділяється недостатньо уваги, що створює передумови її значного поширення в різних регіонах нашої країни.
Значні економічні збитки, яких завдає вірусна діарея, зумовлені вищезазначеними особливостями її збудника та різноманітними формами перебігу.
Найбільш ефективним засобом боротьби з вірусною діареєю великої рогатої худоби є вакцинація сприйнятливого поголів’я тварин. Проте до 2005 року в Україні не було розроблено і впроваджено для застосування засобів специфічної профілактики вірусної діареї.
Аналіз фактичного матеріалу, накопиченого вітчизняними й закордонними дослідниками, свідчить про складність отримання та застосування вакцини проти вірусної діареї. Відносно невисока ефективність інактивованих вакцин (Neaton H.J. et al., 1986; Sweat R.L., 1986; Сергеев В.А., 1993; Vogel F.S.F., 2001) визначила напрямок експериментальних досліджень щодо отримання атенуйованих штамів вірусу діареї з метою використання їх як вірус-вакцини. Живі вакцини забезпечують швидке формування локального та системного імунітетів і запобігають інфікуванню тварин епізоотичним вірусом діареї.
Актуальність цього напрямку досліджень ґрунтується також на тому, що в телят у перші доби життя імунна система ще недосконала і в разі застосування інактивованих вакцин не відбувається негайна повноцінна імунна відповідь, а колостральний імунітет короткочасний і залежить від рівня материнського імунітету.
На підставі вищезазначеного було заплановано здійснити дослідження з розробки технології виготовлення живої вакцини проти діареї великої рогатої худоби та відпрацювати схему її застосування в неблагополучних господарствах.
Зв’язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Дисертаційна робота є складовою частиною наукових досліджень, виконаних згідно з державними програмами і тематичними планами ННЦ «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», зокрема, завдання 05 «Розробити ефективну систему діагностики, терапії та профілактики хвороб великої рогатої худоби» (№ державної реєстрації 01974000758, 2000 р.); 05 «Розробити та впровадити комплексну систему діагностики, терапії та профілактики інфекційних і незаразних хвороб жуйних тварин» (№ державної реєстрації 0101U001610, 2001–2005 рр.); завдання 37.02-003 «Вивчити біологію герпес- і пестивірусів – збудників інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби, розробити сучасні засоби їх діагностики й специфічної профілактики» (№ державної реєстрації 0106U000340, 2006–2010 рр.).
Мета і завдання дослідження. Основна мета роботи – розробити засоби специфічної профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби в неблагополучних господарствах.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:
- підібрати клітинну систему для культивування й накопичення виробничого штаму вірусу діареї;
- вивчити інфекційну активність та антигенні властивості виробничого штаму вірусу діареї;
- визначити щепну дозу вакцини за показниками інфекційності виробничого штаму ВД та скомпонувати її склад;
- випробувати й дати оцінку властивостей вакцини за такими показниками якості: стерильністю, реактогенністю, нешкідливістю, антигенними властивостями та імуногенністю;
- вивчити імуномодулюючу дію бактеріального ліпополісахариду на розвиток імунітету під час застосування живої вакцини проти вірусної діареї.
Об’єкт дослідження: вірусна діарея великої рогатої худоби та специфічні засоби її профілактики.
Предмет дослідження: клітинні культури, виробничий штам вірусу діареї, бактеріальний ліпополісахарид, імунобіологічні властивості вакцини, післявакцинальний імунітет.
Методи дослідження. Робота виконана з використанням вірусологічних, бактеріологічних, серологічних, імунологічних, біохімічних, гематологічних та статистичних методів досліджень.
Наукова новизна одержаних результатів. На підставі здійснених уперше в Україні досліджень розроблено живу культуральну вакцину проти вірусної діареї великої рогатої худоби, для виготовлення якої використано модифікований виробничий штам ВК–1М, репродукований у моношаровій культурі перещеплюваних клітин КСТ; створено препаративну форму сухого біопрепарату. Розроблена вакцина забезпечує високий рівень індукції вірусонейтралізуючих антитіл в організмі щеплених телят і запобігає клінічному прояву захворювання.
З метою корекції післявакцинального імунітету визначено доцільність застосування ліпополісахариду, виготовленого з культури Bacillus аlvei, одночасно з щепленням живої вакцини проти вірусної діареї.
Наукова новизна розробок підтверджена деклараційним патентом на корисну модель України № 5153 «Спосіб профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби», (заявл. 12.07.2004 р., опубл. 15.02.2005 р.).
Практичне значення одержаних результатів полягає в тому, що для використання пропонуються жива культуральна вакцина проти вірусної діареї та імуностимулятор – ліпополісахарид з культури Bacillus аlvei, а також спосіб їх одночасного застосування з метою специфічної профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби в неблагополучних господарствах.
За результатами здійснених досліджень розроблено й подано на експертизу в Державний науково-контрольний інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів та узгодження в Державному комітеті ветеринарної медицини України нормативну документацію (інструкція з виготовлення та контролю за показниками якості вакцини живої культуральної проти вірусної діареї великої рогатої худоби, ТУУ на вакцину та листівка-вкладка щодо застосування цього біопрепарату), яку розглянуто та схвалено на засіданні методичної комісії ІЕКВМ УААН (протокол № 16 від 8 грудня 2004 року).
Особистий внесок здобувача. Авторка особисто здійснила аналіз літературних джерел за темою дисертації, самостійно виконала експериментальну частину роботи, зокрема, з підбору клітинної системи для культивування виробничого штаму вірусу діареї, розробила спосіб накопичення вірусної сировини для виготовлення вакцини, вивчила властивості вакцини за показниками якості, запропонувала корекцію післявакцинального імунітету за допомогою бактеріального ліпополісахариду.
Біохімічні та гематологічні дослідження здійснено спільно із співробітниками лабораторії біохімії ННЦ «ІЕКВМ», кандидатами біологічних наук Л. В. Коваленко та С. А. Михайловою.
Апробація результатів дисертації. Матеріали, подані в дисертації, доповідались і були схвалені на звітних сесіях Вченої ради і засіданнях методичної комісії ННЦ «ІЕКВМ» (2000–2007 рр.) та міжнародних науково-практичних конференціях: «Ветеринарна медицина – 2004. Сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів», (24–31 травня 2004 р., м. Феодосія), «Ветеринарна медицина – 2005. Сучасний стан та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва», (30 травня–4 липня 2005 р., м. Ялта).
Публікації. Основніположення дисертації опубліковано в 5 наукових працях, з них 1 одноосібна, у фахових виданнях, перелік яких затверджений ВАК України, та описі отриманого деклараційного патенту.
Структура дисертації. Дисертація викладена на 110 сторінках комп’ютерного друку і містить такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень, їх узагальнення та аналіз, висновки, пропозиції виробництву, список використаної літератури за темою дисертації, додатки. Робота ілюстрована 7 рисунками і 15 таблицями. У списку літератури наявні 240 джерел, у тому числі 143 – закордонних авторів.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Робота виконана відповідно до державних і відомчих планів наукових досліджень у лабораторіях вивчення хвороб молодняка та вивчення вірусних хвороб рогатої худоби Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», а також у дослідному господарстві «Українка Слобідська» та СВК «Заповіт Леніна» Харківської області впродовж 2000–2007 років. Окремі етапи цих досліджень, зокрема біохімічні, здійснено в лабораторії біохімії ННЦ «ІЕКВМ».
Для розроблення, виробництва та випробування живої вакцини проти вірусної діареї використали такі штами: епізоотичний 25, еталонний Oregon C 24 V і виробничий ВК-1М вірусу діареї з колекції лабораторії вивчення вірусних хвороб рогатої худоби. Виробничий штам ВК-1М вірусу діареї отриманий В.І. Стеценком шляхом адаптації до розмноження епізоотичного ізоляту ВК-1, що був виділений у 1972 році від хворої на вірусну діарею ВРХ, і подальшої його атенуації шляхом серійних пасажів у культурах перещеплюваних клітин. Титр його інфекційності після 20 і 30 послідовних пасажів у культурах перещеплюваних клітин ПТ і ПО становив відповідно 6,5 і 6,8 lgТЦД50 /см3 . Титр інфекційності штамів 25 та Oregon C 24 V під час культивування в цих культурах становив 6,0 і 5,8 lg ТЦД 50 /см3 та 6,2 і 6,0 lg ТЦД50 /см3 , відповідно.
Окрім того, в роботі використали ліпополісахарид (ЛПС-1), який застосовували як імуностимулятор під час імунізації тварин живою вакциною проти вірусної діареї, виготовлений за методом П.А. Красочко та В.А. Машеро (1998) шляхом лужного гідролізу бактеріальної маси культури Bacillus alvei, (штам 413), з колекції лабораторії вивчення хвороб бджіл ННЦ «ІЕКВМ».
За допомогою тест-культури Staphilococcus aureus (штам 209 Р) визначали фагоцитарну активність та фагоцитарне число нейтрофілів периферійної крові.
Культивування досліджуваних штамів вірусу діареї та накопичення вихідної вірусовміщуючої сировини для виготовлення зразків вакцини здійснювали в моношарових культурах перещеплюваних клітин ТрТ (трахея теляти), ВНК-21/13 (нирки новонародженого хом’ячка) та КСТ (коронарні судини теляти), які вирощували в суміші з рівних об’ємів середовищ Ігла та 199 з 10 % сироватки крові ВРХ виробництва ДП «Ветеринарна медицина» (м. Харків). Концентрацію та життєздатність клітин визначали за фарбуванням трипановим синім і підрахуванням живих клітин у камері Горяєва.
Експериментальні дослідження з вивчення реактогенності, нешкідливості, антигенних та імуногенних властивостей виробничого штаму ВК-1М вірусу діареї та дослідних зразків вакцини виконувались на 300 білих мишах масою 18–20 г, 60 морських свинках масою 300–400 г, 40 кроликах породи Шиншила масою 2,0–2,5 кг та 99 телятах 21–28-добового (n=36) та 3–4-місячного віку (n=63).
Чутливість перещеплюваних клітин до вірусу діареї вивчали в п’яти послідовних пасажах з визначенням його інфекційності шляхом титрування, для чого готували 10‑кратні розведення, якими заражали по 4 тест-об’єкти (пробірочні культури клітин). Результати обраховували за методом Ріда і Менча. За титр інфекційності приймали максимальне розведення вірусу, що спричиняло деструкцію клітин у 50 % флаконів, і виражали в тканинних цитопатогенних дозах (ТЦД 50 /см3 ). Антигенну активність вірусу та імуногенність зразків вакцини досліджували за допомогою реакції нейтралізації ЦПД вірусу специфічними антитілами в сироватках крові тварин, щеплених відповідним штамом вірусу діареї. За титр нейтралізуючої активності сироватки крові приймали ті розведення сироватки, в яких спостерігали пригнічення репродукції вірусу в 50 % культуральних флаконів (пробірок).
Імунний стан тварин оцінювали за показниками рівня вірусонейтралізуючих антитіл, функціональної активності гематогенних попередників макрофагів, зокрема макрофагальної трансформації мононуклеарів, фагоцитарного індексу, фагоцитарного числа за методом В.Н. Чеботкевича і С.И. Лютинского (1998).
Кількість імуноглобулінів визначали за G. Manchini et al. (1965) та Н. В. Кленіною із співавт. (1983), циркулюючих імунних комплексів – за методом Ю. А. Гриневича.
Лейкоцитарну формулу обраховували за кількістю елементів білої крові в мазках, пофарбованих за Романовським-Гімза.
Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали з визначенням критеріїв вірогідності за Ст’юдентом. Облік результатів обраховували за допомогою персонального комп’ютера IBM PC/AT, програми «Excel XP» з програмного пакету MS Office XP.
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
Вибір клітинної системи для культивування вірусу діареї. Важливим етапом виробництва біологічних препаратів є вибір клітинної системи для репродукції вірусу, яка б забезпечувала максимальне накопичення вірусовміщуючого матеріалу. Із цією метою ми випробували три лінії перещеплюваних клітин, а саме: ТрТ, КСТ і ВНК‑21/13, які підтримуються в колекції ННЦ «ІЕКВМ». У результаті порівняльного вивчення культуральних властивостей клітин цих ліній установлена залежність накопичення їхньої біомаси від посівної концентрації та способу вирощування. Зі збільшенням посівної концентрації від 100 до 400 тисяч клітин в 1 см3 ростового середовища скорочуються терміни формування моношару як за стаціонарного (в матрасах), так і ролерного (у бутлях) способів вирощування. Зокрема, під час культивування в матрасах і бутлях ці показники для культури клітин ТрТ скорочувалися відповідно від 144 до 72 годин і від 120 до 60 годин, для КСТ – від 120 до 70 і від 72 до 40 годин, і для ВНК-21/13–від 80 до 48 і від 72 до 38 годин. За кількістю накопичення клітин у моношарі переваги мала культура КСТ (771,5 і 1449,0 тисяч клітин/см3 середовища відповідно в матрасах і бутлях порівняно з ТрТ (740 і 1400 тис/см3 ) і ВНК-21/13 (767 і 1440,5 тис/см3 ).
На підставі отриманих результатів експериментальних досліджень основних параметрів процесу вирощування клітинної біомаси культура перещеплюваних клітин КСТ визнана нами більш продуктивною як за вирощування в матрасах, так і ролерних бутлях та обрана для використання в подальшому виробництві дослідних зразків вакцини проти вірусної діареї.
Вивчення репродуктивних властивостей виробничого штаму вірусу діареї. Результати вивчення культуральних і репродуктивних властивостей трьох ліній перещеплюваних клітин визначили доцільність з’ясування в порівняльному аспекті їхньої чутливості до вірусу діареї, зокрема до штамів 25, Oregon C 24 V та ВК-1М. Із нарощуванням пасажів вірусу цитопатичні зміни в культурах клітин стабілізувалися за терміном прояву й завершення. Із ростом серійних пересівів вірусу цей термін скорочувався. У 5-му пасажі терміни завершення ЦПД становили в матрасах 48–76, а в бутлях – 42–72 години залежно від випробуваних клітин. Із посиленням адаптації до репродукції в цих клітинних культурах титр інфекційності штамів 25, Oregon C 24 V і ВК-1М ВД підвищувався майже на 1,0 lg ТЦД 50 /см3 . Що стосується штаму ВК-1М, то результати пасажування засвідчили його більш виражену стабільну репродуктивну здатність у досліджуваних культурах клітин. У ролерній культурі перещеплюваних клітин КСТ вона досягала максимального рівня – 7,6 lg ТЦД50 /см3 .
Разом із тим ми встановили пряму залежність термінів репродукції вірусу від заражаючої дози. Оптимальні показники терміну репродукції штаму ВК–1М у перещеплюваній культурі клітин забезпечувала множинність зараження з розрахунку 0,001 ТЦД50 /клітину, що відповідає інфекційності вірусу 100 ТЦД50 /см3 . Із підвищенням множинності зараження до 0,01 ТЦД50 /клітину, що становить 1000 ТЦД50 /см3 у заражаючому об’ємі вірусовміщуючої суспензії, термін репродукції вірусу скорочувався в середньому на 6 годин. Але титр інфекційності кінцевої вірусовміщуючої сировини був однаковим як за множинності зараження 0,001 ТЦД50 /клітину, так і 0,01 ТЦД50 /клітину. У подальшому процесі напрацювання вихідної вірусовміщуючої сировини для виготовлення вакцини здійснювали зараженням культури КСТ із розрахунку 0,01 ТЦД50 вірусу на клітину.
На підставі отриманих результатів досліджень щодо вибору чутливої тест-системи для ролерного культивування та вивчення репродуктивної активності випробуваних штамів вірусу діареї встановлено, що за цими показниками штам ВК‑1М вірусу діареї ВРХ відповідає вимогам до інфекційності виробничого штаму, призначеного для виготовлення вакцини (табл. 1).
Зокрема, оптимальною є доза зараження моношарової культури клітин КСТ як у матрасах, так і в бутлях у співвідношенні 1:20 і 1:30 об’єму вірусу
8-09-2015, 23:45