У разі щеплення вакцини в комплексі з ЛПС-1 у сироватці крові телят збільшувався вміст загального білка, імуноглобулінів класів М і G, циркулюючих імунних комплексів, що свідчить про посилення показників неспецифічної резистентності.
Важливим моментом у виборі щепної дози вакцини було дослідження концентрації серомукоїдів, підвищення рівня яких було виявлено вже на 3 добу в телят, яким щепили препарат у дозі 5Ч105,45 ТЦД50 /гол., і майже в 3,5 рази на 14 добу після першого щеплення.
Підвищення рівня серомукоїдів свідчить про виражену імуносупресивну дію вакцини живої в дозі 5 см3 (5Ч105,45 ТЦД50 /гол.) на клітинну ланку імунітету, що збігається з даними F. A. Roth et al. (1983, 1986) і вказує на недоцільність застосування живої вакцини в такій дозі.
Отже, за результатами цього досліду встановлено, що випробувана вакцина проти вірусної діареї у разі введення телятам як окремо в дозах 2Ч105,45 ТЦД50 /гол. і 5Ч105,45 ТЦД50 /гол., так і в меншій дозі одночасно з ЛПС‑1 виявляє виражені імуногенні властивості. Вакцина, введена в дозі 2Ч105,45 ТЦД50 /гол. (2 см3 ) у комплексі з ЛПС‑1, викликає індукцію вірусонейтралізуючих антитіл у середньому на 2,0 log2 вище порівняно з їх титрами, які виявляються під час застосування однієї вакцини в такій же дозі. Щеплення вакцини в комплексі з ЛПС‑1 позитивно впливає на всі ланки імунітету, в тому числі й неспецифічного. У той же час у разі застосування вакцини в дозі 5Ч105,45 ТЦД50 /гол. виявляється імуносупресивний ефект, що свідчить про недоцільність її введення телятам у цій дозі. Одночасне щеплення ЛПС‑1 з вакциною в дозі 2Ч105,45 ТЦД50 /гол. стимулює біосинтез факторів специфічної й неспецифічної резистентності, що свідчить про імуномодулюючу дію застосовуваного ліпополісахариду.
Вивчення профілактичної ефективності вакцини живої культуральної проти вірусної діареї у виробничих умовах. Виробниче комісійне випробування профілактичної ефективності вакцини здійснено в неблагополучному щодо вірусної діареї господарстві на 72 телятах 21–28-добового та 3–4-місячного віку, з яких були сформовані по 3 групи по 12 тварин у кожній. У досліді використали експериментальну серію вакцини живої культуральної проти вірусної діареї та імуномодулятор ЛПС-1, виготовлений з культури Bacіllus alvei , що були заздалегідь перевірені на стерильність та нешкідливість для тварин. Ліофілізований зразок вакцини мав інфекційність на рівні 5,45 lg ТЦД50 /см3 .
У процесі вивчення динаміки імунітету встановлено, що в телят як перших (21–28-добового і 3–4-місячного віку), так і других груп, котрим щепили відповідно одну вакцину в дозі 2Ч105,45 ТЦД50 /гол. і вакцину в цій дозі в комплексі з ЛПС‑1 із розрахунку 7 мкг/кг маси тіла тварин, вже на 7 добу було виявлено зростання титру вірусонейтралізуючих антитіл до 3,2 і 4,3 log2 . Причому, титр вірусонейтралізуючих антитіл у телят 21–28-добового віку, котрим вакцину щепили в комплексі з ЛПС‑1, був вищим на 0,9 log2 порівняно з введенням однієї вакцини. Після другого введення цих препаратів титр антитіл стабілізувався на рівні 6,4–8,0 log2 і утримувався до 60 доби, після чого дещо знижувався до 5,3–7,1 log2 на 180 добу.
У процесі щоденного клінічного нагляду та термометрії телят протягом перших 14 діб не було виявлено погіршення загального стану тварин, а також підвищення температури тіла. У подальшому не встановлено хворих тварин серед щеплених як однією вакциною, так і вакциною в комплексі з ЛПС-1, у той час як у контрольних групах телята перехворіли з ознаками ураження очей (гіперемія кон’юнктиви, сльозотеча) та слизової оболонки верхніх дихальних шляхів (слизовитікання з носа, кашель), а також підвищенням на 1,0–1,5 °С температури тіла, що спостерігались упродовж 2–3 тижнів, після чого клінічні ознаки поступово згасали. Температурна реакція була нестабільною, частіше реєструвалася надвечір протягом 7–12 діб. Клінічні ознаки були більш вираженими в телят молодшого віку.
Отже, результати комісійного випробування вакцини живої культуральної проти вірусної діареї великої рогатої худоби на телятах у виробничих умовах надали підставу вважати, що вона відповідає вимогам ТУУ за відсутністю контамінації сторонніми мікроорганізмами, високою антигенною активністю та здатністю індукувати імунітет в організмі щеплених нею телят, захищає їх від проявів клінічних ознак хвороби.
За результатами комісійного виробничого випробування вакцина жива культуральна проти вірусної діареї була рекомендована для впровадження в біофабричне виробництво та застосування для профілактики вірусної діареї у неблагополучних щодо цієї хвороби господарствах.
На підставі отриманих даних ми пропонуємо спосіб профілактики вірусної діареї ВРХ у неблагополучних господарствах шляхом застосування живої вакцини з атенуйованого вірусу штаму ВК–1М і ліпополісахариду з Bacillus alvei (ЛПС–1).
За результатами здійснених досліджень розроблено нормативну документацію на вакцину живу культуральну проти вірусної діареї великої рогатої худоби (інструкція з виготовлення й контролю якості, ТУУ та настанова із застосування), в подальшому розглянуту і схвалену методичною комісією ІЕКВМ УААН (протокол № 16 від 8 грудня 2004 р.) і подану на експертизу до ДНКІБШМ та узгодження до Державного департаменту ветеринарної медицини України.
ВИСНОВКИ
1. У дисертації подано експериментальне й практичне вирішення проблеми специфічної профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби, а саме: створено живу культуральну вакцину та розроблено технологію її виготовлення. За результатами досліджень щодо вивчення тест-об’єкту для культивування вірусу діареї, його інфекційності, антигенних та імуногенних властивостей обрано клітинну систему і виробничий штам вірусу для напрацювання вихідної сировини з метою виготовлення вакцини. Створено препаративну форму вакцини живої культуральної проти вірусної діареї, обґрунтовано формування й корекцію післявакцинального імунітету, запропоновано комплексне застосування вакцини та імуномодулятора з бактеріального ліпополісахариду.
2. Розроблено живу культуральну вакцину проти вірусної діареї великої рогатої худоби з модифікованого штаму ВК-1М вірусу діареї, репродукованого в ролерній моношаровій культурі перещеплюваних клітин КСТ, з інфекційністю 5,45 lg ТЦД50 /см3 , яку стабілізовано в процесі ліофілізації за допомогою 5,6 %‑ї сахарози і 2,8 %-го желатину (кінцеві концентрації). Вакцина не контамінована сторонніми мікроорганізмами, нешкідлива для тварин, слабореактогенна, призначена для щеплення великої рогатої худоби в неблагополучних господарствах.
3. Перещеплювані культури клітин ТрТ, ВНК-21/13 та КСТ мають високу проліферативну активність у процесі вирощування в суміші з рівних об’ємів поживних середовищ 199 та Ігла і 10 % нормальної сироватки крові великої рогатої худоби. Посівна концентрація з розрахунку 300 тисяч клітин/см3 поживного середовища забезпечує відповідно в 2,6; 4,8 і 4,9 рази вищий їх приріст за ролерного способу культивування, який скорочує на 20–48 годин термін накопичення біомаси клітин для напрацювання вихідної для виготовлення вакцини вірусної сировини порівняно зі стаціонарним у матрасах.
4. Виробничий штам ВК-1М вірусу діареї, адаптований до розмноження в культурі перещеплюваних клітин у ролерних бутлях, зберігає активну репродуктивну здатність і має високу інфекційність. Оптимальний час репродукції та титр його інфекційності становить у культурі перещеплюваних клітин ТрТ відповідно 46 годин і 7,05 lg ТЦД50 /см3 , ВНК-21/13 – 64 години і 7,0 lg ТЦД50 /см3 . Більш придатною для репродукції та накопичення біомаси штаму ВК-1М є перещеплювана культура КСТ, яка забезпечує його репродукцію впродовж 40 годин з інфекційністю 7,6 lg ТЦД50 /см3 .
5. Щеплення вакцини живої культуральної проти вірусної діареї в об’ємах 2 і 5 см3 , що вміщують відповідно 2Ч105,45 ТЦД50 і 5Ч105,45 ТЦД50 вакцинного вірусу, забезпечує в імунізованих телят індукцію вірусонейтралізуючих антитіл, які виявляються на 7 добу після введення препарату в титрах 5,0 і 6,0 log2 відповідно, рівень яких зростає на 28 добу після повторного введення з інтервалом у 14 діб до 6,0 і 7,7 log2 , відповідно, та утримуються на цьому рівні до 60 доби, після чого на 180 добі дещо знижуються до 5,9 і 6,75 log2 .
6. Обґрунтовано та практично підтверджено в експерименті залежність імуногенності виробничого штаму ВК-1М від його інфекційності в щепному об’ємі та кратності введення. Установлено, що з підвищенням дози вірусу в щепному об’ємі від 0,5Ч105,45 ТЦД50 до 1Ч105,45 ТЦД50 для морських свинок і від 2Ч105,45 ТЦД50 до 5Ч105,45 ТЦД50 для телят за дворазового введення зростає індукція вірусонейтралізуючих антитіл у 1,5 рази в порівнянні з одноразовим і становить 7,3 і 8,0 log2 відповідно.
7. Вакцинний вірус (штам ВК-1М), у дозі 5Ч105,45 ТЦД50 в щепному об’ємі виявляє імуносупресивні властивості, про що свідчить підвищення в 3,5 рази серомукоїдів у організмі щеплених проти вірусної діареї телят. Застосування бактеріального ліпополісахариду ЛПС-1, виготовленого з культури Bacillus alvei (штам 413), із розрахунку 7 мкг/кг маси тіла телят одночасно із щепленням вакцини живої культуральної проти вірусної діареї активізує як специфічні, так і неспецифічні фактори резистентності у тварин, чинить імунореабілітуючу дію на імунну систему, згладжує імуносупресивність і підвищує імунну відповідь на виробничий штам вірусу діареї з продукцією вірусонейтралізуючих антитіл на 2 log2 вище порівняно з щепленням однієї вакцини в дозі 2Ч105,45 ТЦД50 /гол.
8. Запропоновано спосіб імунізації телят проти вірусної діареї в неблагополучних щодо цієї хвороби господарствах із застосуванням дворазового введення з інтервалом 14 діб внутрішньом’язово 2 см3 вакцини живої культуральної, що вміщує 2Ч105,45 ТЦД50 виробничого штаму ВК-1М вірусу діареї, одночасно з ЛПС-1 з розрахунку 7 мкг/кг маси тіла тварини, що забезпечує формування гуморального імунітету, починаючи з 7-ї доби після щеплення, і захищає тварин від захворювання впродовж 180 діб (термін спостереження).
1. Вакцина жива культуральна проти вірусної діареї великої рогатої худоби та нормативна документація (інструкція з виготовлення та контролю за показниками якості вакцини живої культуральної проти вірусної діареї великої рогатої худоби, ТУУ на вакцину живу культуральну проти вірусної діареї великої рогатої худоби та листівка-вкладка із застосування вакцини живої культуральної проти вірусної діареї великої рогатої худоби), що розглянута й схвалена на засіданні методичної комісії ІЕКВМ УААН (протокол № 16 від 8 грудня 2004 р.). Досьє на вакцину подано на експертизу до ДНКІБШМ та узгодження до Державного комітету ветеринарної медицини України.
2. Спосіб профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби, що передбачає одночасне застосування вакцини живої культуральної проти вірусної діареї та імуностимулюючого ліпополісахариду ЛПС-1, виготовленого з Bacillus alvei.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Стеценко, В.І. Антигенна спорідненість та відмінність різних штамів вірусу діареї великої рогатої худоби [Текст] / В. І. Стеценко, О. В. Годовський, Л. І. Кучерявенко, Л.П. Тризна, Ю. С. Голуб, І.В. Чебанюк // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. — Х, 2002. — Вип. 80. — С. 589–594. (Дисертанткою проведено накопичення клітинної біомаси перещеплюваних клітин ПТ, ТрТ, КСТ, 9‑разові пасажі трьох штамів вірусу діареї в цих культурах клітин, визначення їх інфекційності та антигенної спорідненості ).
2. Стеценко, В. І. Вивчення реактогенних та антигенних властивостей різних штамів вірусу діареї великої рогатої худоби [Текст] / В. І. Стеценко, Л. П. Тризна, І.В. Чебанюк , Л. Н. Покусай // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. — Х., 2003. — Вип. 81. — С. 351–356. (Дисертанткою проведено накопичення вірусовміщуючої культуральної суспензії трьох штамів ВД і вивчено в біопробі на кроликах їх реактогенність з оцінкою стану клітинного імунітету ).
3. Чебанюк, І.В. Корекція імунітету ліпополісахаридом Bacіllus alvei при застосуванні живої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби [Текст] / І.В. Чебанюк , В.І. Стеценко, Л.П. Тризна // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. — Х., 2004. — Вип. 83. — С. 258–262. (Дисертанткою вивчались властивості ліпополісахаридного імуностимулятора та дослідних зразків вакцини проти ВД ВРХ ).
4. Коваленко, Л. В. Динамика гуморального иммунитета телят, привитых живой вакциной против вирусной диареи крупного рогатого скота [Текст] / Л. В. Коваленко, И. В. Чебанюк , С. А. Михайлова, М. Е. Романько, В. С. Бойко // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. — Х., 2004. — Вип. 84. — С. 341–345. (Дисертанткою проведено щеплення тварин та дослідження сироваток крові в реакції нейтралізації на наявність антитіл до вірусу діареї, здійснено аналіз стану гуморального імунітету ).
5. Чебанюк, І. В. Випробування вакцини живої проти вірусної діареї великої рогатої худоби [Текст] / І. В. Чебанюк // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. — Х., 2005. — Вип. 85. — Т. 2. — С. 1110–1113.
6. Деклараційний патент на корисну модель № 5153 Україна мпк7 А61К39/12. Спосіб профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби [Текст] / Стеценко В. І., Кучерявенко Л. І., Чебанюк І. В. , Тризна Л. П. ; заявник і патентовласник Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини. — № 20040705657 ; заявл. 12.07.04 ; опубл. 15.02.05, Бюл. № 2. — 4 с.
АНОТАЦІЇ
Малакєєва-Чебанюк Ірина Владиславівна. Розробка живої культуральної вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини». Харків, 2008.
Захищаються матеріали, які містять результати експериментальних досліджень із розробки технології виготовлення на основі модифікованого штаму ВК-1М вірусу діареї вакцини живої культуральної проти вірусної діареї та вивчення її імуногенної ефективності в лабораторних і виробничих умовах.
Випробувана культура клітин КСТ, що має високу продуктивну здатність щодо формування моно шару під час ролерного культивування, забезпечує активну репродукцію вірусу та накопичення його вихідної біомаси для виготовлення вакцини.
У лабораторних умовах на білих мишах, морських свинках, кроликах та на телятах у неблагополучних щодо вірусної діареї великої рогатої худоби господарствах вивчено антигенні властивості вакцини та імуногенність зразків рідкої й сухої живої вакцини проти вірусної діареї.
Показано, що атенуйований штам вірусу діареї, репродукований у культурі перещеплюваних клітин КСТ із кінцевим титром інфекційності 7,6 lg ТЦД50 /см3 , активно індукує в організмі щеплених тварин вірусонейтралізуючі антитіла.
Запропонована технологія культивування клітин та вірусу дозволяє одержувати неконтаміновану сторонньою мікрофлорою (бактеріями, грибами, вірусами), нешкідливу для тварин та високоімуногенну вакцину. У дозі 2Ч105,45 ТЦД50 /гол. за одночасного введення з бактеріальним ліпополісахаридом з розрахунку 7 мкг/кг маси тіла тварин дворазово з інтервалом 14 діб вона активізує в організмі щеплених тварин усі ланки імунної системи, забезпечуючи індукцію вірусонейтралізуючих антитіл у титрах до 8,0 log2 і захист від захворювання на вірусну діарею.
Розроблено проект нормативної документації на вакцину живу культуральну проти вірусної діареї великої рогатої худоби, який надіслано для експертизи до ДНКІБШМ та узгодження в Державному комітеті ветеринарної медицини України.
Ключові слова: вірусна діарея, велика рогата худоба, виробничий штам вірусу, культура клітин, антигенні властивості, вакцина, імуномодулятор, специфічна профілактика.
Малакеева-Чебанюк Ирина Владиславовна. Разработка живой культуральной вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота. – Рукопись.
Диссертация на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 – ветеринарная микробиология и вирусология. Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины». Харьков, 2008.
Диссертация посвящена разработке вакцины и способа специфической профилактики вирусной диареи телят в неблагополучных по данной вирусной инфекции хозяйствах, основанного на принципе одновременного введения живой вакцины и иммуностимулирующего бактериального липополисахарида ЛПС–1 из Bacillus alvei.
Защищаются материалы, которые включают результаты экспериментальных исследований по разработке технологии изготовления вакцины живой культуральной против вирусной диареи крупного рогатого скота и изучения её имуногенной эффективности в лабораторных и производственных условиях.
Подобрана культура клеток, обладающая высокой продуктивной способностью к формированию монослоя при роллерном культивировании, которая обеспечивает активную репродукцию вируса и накопление его исходной биомассы для изготовления вакцины.
В лабораторных условиях на белых мышах, морских свинках, кроликах и на телятах в неблагополучных по вирусной диарее крупного рогатого скота хозяйствах испытаны антигенные свойства и имуногенность образцов жидкой и сухой вакцины против вирусной диареи.
Показано, что аттенуированный штамм вируса диареи, репродуцированный в культуре перевиваемых клеток КСТ с конечным титром инфекционности 7,6 lg ТЦД50 /мл, активно индуцирует в организме привитых животных вируснейтрализующие антитела.
Предложенная технология культивирования клеток и вируса позволяет получать не контаминированную посторонней микрофлорой (бактериями, микоплазмами, грибами, вирусами), безвредную для животных и высокоиммуногенную вакцину. В дозе 2Ч105,45 ТЦД50 /гол. при одновременном введении с липополисахаридом бактериального происхождения из расчёта 7 мкг/кг массы тела животного двукратно с интервалом 14 суток она активизирует в организме вакцинированных животных индукцию вируснейтрализующих антител в титрах до 8,0 log2 и защищает от заболевания вирусной диареей.
Применение бактериального липополисахарида ЛПС-1, полученного из культуры Bacillus alvei (штамм 413), из расчёта 7 мкг/кг массы тела телят одновременно с введением вакцины живой культуральной против вирусной диареи активизирует как специфические, так и неспецифические факторы резистентности у животных, проявляет иммунореабилитирующее действие на иммунную систему, сглаживает имуносупрессивность и повышает иммунный ответ на введение производственного штамма вируса диареи.
Разработан проект нормативной документации на вакцину живую культуральную против вирусной диареи крупного рогатого скота, который направлен на экспертизу в Государственный научно-контрольный институт биотехнологии и штаммов микроорганизмов и для согласования в Государственном комитете ветеринарной медицины Украины.
Ключевые слова: вирусная диарея, крупный рогатый скот, производственный штамм вируса, культура клеток, антигенные свойства, вакцина, иммунитет, иммуномодулятор, специфическая профилактика.
Malakeyeva–Chebanyuk Irina Vladislavovna. Development of an alive cultural vaccine against virus diarrhea of cattle.- Manuscript.
Dissertation presented for obtaining the scientific degree of a candidate of veterinary
sciences in speciality 16.00.03 – veterinary microbiology and virology. National scientific center «Institute of experimental and clinical veterinary medicine». Kharkiv, 2008.
Materials are defended that contain the experimental research results of alive cultural against virus diarrhea vaccine’s making technology
8-09-2015, 23:45